基于細(xì)胞膜脂肪酸調(diào)控提高乳桿菌凍干存活率

錢志浩，崔樹茂，唐鑫，毛丙永，趙建新，陳衛(wèi)

(江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無錫，214122)

乳桿菌是益生菌的重要組成部分，常見的乳桿菌有植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌[1]等。它是一類優(yōu)良的益生菌，具有維持腸道菌群穩(wěn)態(tài)、緩解便秘與腹瀉、提高免疫力、拮抗病菌、治療炎癥等益生功能[2]，與人類的健康息息相關(guān)[3]，越來越多的被應(yīng)用于食品、藥品、飼料等領(lǐng)域。

乳桿菌在體內(nèi)產(chǎn)生益生作用需要達(dá)到較高的活菌數(shù)[4]，所以微生態(tài)制劑一般采用冷凍干燥的生產(chǎn)工藝制備成菌粉來保證益生效果。提高乳桿菌的凍干存活率主要有兩類方法[5-6]，一是優(yōu)化凍干保護(hù)劑及凍干工藝參數(shù)[7]；二是調(diào)整菌株的生理狀態(tài)使其更容易在冷凍干燥的過程中存活下來。

與微生物凍干存活率相關(guān)的生理狀態(tài)主要有形態(tài)大小、莢膜多糖、胞內(nèi)相容性物質(zhì)及細(xì)胞膜組成等幾個(gè)方面。在乳桿菌冷凍干燥條件下，這些因素均會對最終的存活率造成影響。一般認(rèn)為細(xì)菌的凍干存活率與形態(tài)大小存在聯(lián)系，單個(gè)細(xì)胞體積小、接近球型形態(tài)的細(xì)菌凍干存活率高；而單個(gè)細(xì)胞體積大，呈不規(guī)則形態(tài)的細(xì)菌存活率較低[8]。胞外多糖的產(chǎn)生被認(rèn)為是有利于提高凍干存活率的因素[9]，胞內(nèi)相容性物質(zhì)的積累能提高凍干存活率[10]，細(xì)胞膜脂肪酸組成的復(fù)雜變化被認(rèn)為與凍干存活率密切相關(guān)。大量研究表明，細(xì)菌能夠通過細(xì)胞膜成分的改變有效提高在冷凍干燥及其他不良環(huán)境中的存活率[11]。但是什么樣的細(xì)胞膜組成更有利于乳桿菌的凍干存活、通過什么手段可以改變?nèi)闂U菌的細(xì)胞膜脂肪酸組成從而提高菌的凍干存活率，目前缺乏系統(tǒng)的研究。

本研究旨在通過分析乳桿菌細(xì)胞膜組成差異以及其與凍干存活率的聯(lián)系，得到凍干存活率較高的乳桿菌的細(xì)胞膜組成特征。并研究和比較幾種調(diào)控細(xì)胞膜脂肪酸組成的有效方法，為提高乳桿菌凍干菌粉的質(zhì)量提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株與試劑

1.1.1 菌株

植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)CCFM259、干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)15m11、短乳桿菌(Lactobacillusbrevis)173-1-2、鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus)FAHHBO1、FJND，江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心。

1.1.2 試劑

蛋白胨、牛肉膏、酵母粉、無水葡萄糖、無水乙酸鈉、七水合硫酸鎂、一水合硫酸錳、檸檬酸氫二鈉、無水磷酸氫二鉀、吐溫20、吐溫80、濃硫酸、蒽酮、甲醇鈉甲醇溶液、正己烷，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；低聚異麥芽糖，上海博飛美科有限公司；食品級膠原蛋白，河北潤盈生物科技有限公司；谷胱甘肽，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高速冷凍離心機(jī)，Eppendorf公司；GRP-9080型隔水式恒溫培養(yǎng)箱，上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；FE20型pH計(jì)、EL3002型電子天平，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；MS 3 basic型渦旋振蕩器，德國IKA公司；MLS-3750型高溫高壓滅菌鍋，日本SANYO公司；ZHJH-C1115B型超凈工作臺，上海智誠分析儀器制造有限公司；Freeze-dryer Lyobeta 5PS雙腔體凍干機(jī)，西班牙Telstar公司；KA92 NV02TI低溫冰箱，日本西門子；UV-2450紫外分光光度計(jì)、GCMS-QP2010 Ultra單四級桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀，日本島津公司；JY92-IIDN超聲波儀，寧波新芝；BA410E正置生物顯微鏡，香港麥克奧迪有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 乳桿菌的活化和培養(yǎng)

從-80 ℃冰箱中取出保菌管、在mMRS固體平板上劃線，37 ℃培養(yǎng)48 h后長出較大的菌落。使用接種環(huán)挑取較大的單菌落至5 mL液體mMRS試管活化2代，每代培養(yǎng)12～14 h，獲得較強(qiáng)活力的種子液。

高活力乳桿菌種子液以1%的接種量接種至mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期收菌。保證接種量、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)狀態(tài)一致。

mMRS液體培養(yǎng)基[12](g/L)：蛋白胨10.0，牛肉膏10.0，葡萄糖20.0，酵母粉5.0，乙酸鈉2.0，無水磷酸氫二鉀2.0，檸檬酸氫二胺2.0，硫酸鎂0.1，硫酸錳0.05，pH(6.2±0.2)。

1.3.2 乳桿菌形態(tài)大小的測定

取培養(yǎng)時(shí)間一致的乳酸菌，進(jìn)行革蘭氏染色，在裝配DFC425C攝像頭的萊卡顯微鏡下鏡檢。隨機(jī)取形態(tài)大小具有代表性的，視野中央的100個(gè)菌體用顯微鏡自帶的Leica Qwin V3測定長度和寬度，計(jì)算其平均值作為該菌株的長和寬。將乳桿菌看成兩端是相等的均勻半球，中間是標(biāo)準(zhǔn)圓柱體，估算其面積用于表示乳桿菌大小,如公式(1)所示:

S=4 πr2+2 πrl2

(1)

式中：S，單個(gè)乳桿菌菌體表面積，μm2；r，乳酸菌桿的半徑，μm；l，乳桿菌的高度，μm。

1.3.3 乳桿菌的凍干工藝和凍干保護(hù)劑

收取培養(yǎng)至穩(wěn)定期的乳桿菌液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)時(shí)間與測定形態(tài)大小的收菌時(shí)間一致，8 000×g(15 min)離心，去上清液收獲菌泥。將菌泥與凍干保護(hù)劑溶液按1∶1(g∶mL)混勻后調(diào)pH值至6.4左右，振蕩至充分均勻后取1 mL分裝至西林瓶。凍干保護(hù)劑配方與凍干工藝參照譚莎莎等[13]的方法。

凍干保護(hù)劑(g/100mL)：低聚異麥芽糖21.49，膠原蛋白7.16，硫酸鎂0.6，谷胱甘肽0.45，硫酸錳0.3。

凍干工藝：板層預(yù)冷，放入裝有乳桿菌的西林瓶，降溫至-50 ℃，預(yù)凍保持4 h；一次干燥，控制層板溫度-30 ℃、真空度200 μbar，保持24 h；二次干燥，控制層板溫度25 ℃、真空度5 μbar，保持18 h。

1.3.4 乳桿菌的凍干存活率計(jì)算

平板菌落計(jì)數(shù)法：取0.5 mL菌液以生理鹽水10倍依次梯度稀釋至3個(gè)合適稀釋度，各取1 mL稀釋液注入無菌培養(yǎng)皿，將已融化并冷卻至45 ℃左右的培養(yǎng)基傾注15 mL至培養(yǎng)皿中，立即放在桌上手動(dòng)搖晃混勻，每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行，凝固后倒置于37 ℃培養(yǎng)箱，培養(yǎng)完成后挑選菌落數(shù)在30～300 CFU/mL的平板進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)如公式(2)所示:

(2)

1.3.5 乳桿菌的莢膜多糖的檢測

硫酸蒽酮法測量菌株莢膜多糖含量，0.2 g蒽酮溶于100 mL濃硫酸混勻冷卻。用100 μg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液配制0、10、20、30、40、60、80 μg/mL的葡萄糖溶液，取不同濃度葡萄糖溶液各1 mL加4 mL硫酸蒽酮，一起沸水浴10 min后冷卻在620 nm處測定吸光值。以葡萄糖含量(μg)作為橫坐標(biāo)、吸光度作為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。

乳桿菌以1%的接種量接至mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后8 000×g(10 min)離心，去上清液。稱取1 g菌泥，生理鹽水洗滌后再以8 000×g(10 min)離心，去掉上清液。菌泥用生理鹽水溶解，冰水浴下低功率81 W超聲3 min輔助剝除莢膜[14]，12 000×g、4 ℃、10 min離心收集上清液。上清液1 mL+4 mL硫酸蒽酮一起沸水浴10 min后冷卻，在620 nm處測定吸光值。吸光值對應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算單位菌體莢膜多糖含量,如公式(3)所示：

單位菌體莢膜多糖含量/(mg·CFU-1)=

(3)

1.3.6 乳桿菌的細(xì)胞膜脂肪酸的檢測

細(xì)胞膜脂肪酸的提?。喝闂U菌以1%的接種量接至mMRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后8 000×g(10 min)離心，去上清液。用8.5 g/L無菌生理鹽水洗滌離心(6 000×g、4 ℃、15 min)3次，棄掉上清液，稱取菌泥0.5 g。然后向得到的菌泥中加入1.5 mL濃度為1 mol/L甲醇鈉的甲醇溶液劇烈振蕩1.5 min，置于4 ℃靜置10 min。加入1 mL的正己烷溶液，振蕩1 min，靜置5 min，在6 000×g離心5 min后，吸取上清液，用有機(jī)系濾頭過濾，制得的樣品置于氣相瓶內(nèi)然后進(jìn)行脂肪酸含量的測定[15]。

氣相條件：用GC-MS分析細(xì)胞膜脂肪酸的組成與含量，毛細(xì)管柱0.25 mm×30 m×0.25 μm，載氣為高純氦氣，進(jìn)樣量為1 μL，不分流進(jìn)樣。進(jìn)樣口溫度240 ℃，柱流速1 mL/min，柱起始溫度為160 ℃，以5 ℃/min升溫至190 ℃保持5 min，再以2 ℃/min升溫至220 ℃，保持5 min。

1.3.7 乳桿菌的胞內(nèi)甜菜堿的檢測

甜菜堿提取[16]：按1.3.1的方法培養(yǎng)乳桿菌12 h至穩(wěn)定期，8 000×g(10 min)離心得菌泥，取1 g濕菌泥用生理鹽水洗滌2遍。加10%(體積分?jǐn)?shù))高氯酸振蕩10 min，KOH調(diào)至pH值為7。12 000 ×g離心20 min取上清液，用0.22 μm無機(jī)濾膜過濾后定容至20 mL后檢測。

液相色譜條件：色譜柱:X Bridge Amide(4.6 mm×250 mm，3.5 μm)；流動(dòng)相∶V(乙腈)∶V(水)=85∶15；檢測波長:195 nm；流速:1.0 mL/min;柱溫:30 ℃；進(jìn)樣量:10 μL，14 min左右出峰,甜菜堿含量計(jì)算如公式(4)所示：

(4)

式中：m，單位菌體的胞內(nèi)甜菜堿含量，mg；c，甜菜堿質(zhì)量濃度，μg/mL；N，菌體的活菌數(shù)，CFU/mL。

1.3.8 調(diào)控乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成的培養(yǎng)方式

本實(shí)驗(yàn)采用4種不同的培養(yǎng)方式(酸脅迫、冷脅迫、添加吐溫80、添加吐溫20)，從而探究不同的培養(yǎng)方式對細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響以及細(xì)胞膜脂肪酸組成與凍干存活率的聯(lián)系。

酸脅迫實(shí)驗(yàn)[17]：活化過的乳桿菌按1%的接種量在mMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期，8 000×g(15 min)離心收集菌泥重懸于pH 3.5的mMRS培養(yǎng)基中酸應(yīng)激4 h，得到的菌體進(jìn)行后續(xù)的冷凍干燥和細(xì)胞膜脂肪酸組成分析。

冷脅迫實(shí)驗(yàn)[18]：活化過的乳桿菌按1%的接種量在mMRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期，置于4 ℃條件下冷應(yīng)激2 h，得到的菌體進(jìn)行后續(xù)的冷凍干燥和細(xì)胞膜脂肪酸組成分析。

添加吐溫80培養(yǎng)[19]：在mMRS液體培養(yǎng)基中添加2 mL/L的吐溫80，活化過的乳桿菌按1%的接種量在含過量吐溫80的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期，得到的菌體進(jìn)行后續(xù)的冷凍干燥和細(xì)胞膜脂肪酸組成分析。

添加吐溫20培養(yǎng)：在mMRS液體培養(yǎng)基中添加2 mL/L的吐溫20，活化過的乳桿菌按1%的接種量在含過量吐溫20的液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h至穩(wěn)定期，得到的菌體進(jìn)行后續(xù)的冷凍干燥和細(xì)胞膜脂肪酸組成分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)中每個(gè)實(shí)驗(yàn)值均是3次平行實(shí)驗(yàn)的平均值。不同組之間的顯著性差異采用IBM SPSS Statistics 22.0軟件進(jìn)行ANOVA分析(DUNCAN檢驗(yàn))，P<0.05 則認(rèn)為差異顯著；采用Graphpad 8.01進(jìn)行生長曲線和柱形圖的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)統(tǒng)一的乳桿菌表面物質(zhì)和相容性物質(zhì)檢測

乳桿菌的凍干存活率受到多個(gè)因素的影響，主要包括形態(tài)大小、胞外表面物質(zhì)的產(chǎn)生、胞內(nèi)相容性物質(zhì)的積累以及細(xì)胞膜脂肪酸的組成等[20]。為了重點(diǎn)研究細(xì)胞膜脂肪酸對乳桿菌凍干存活率產(chǎn)生的影響，首先系統(tǒng)分析了江南大學(xué)食品生物技術(shù)中心菌種保藏中心不同乳桿菌的形態(tài)大小、胞外多糖及胞內(nèi)相容性溶質(zhì)，然后從中篩選這些條件一致的乳桿菌進(jìn)一步研究乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成特征對乳桿菌凍干存活率的影響及細(xì)胞膜脂肪酸組成的調(diào)控方法。

通過篩選得到5株形態(tài)一致的不同種屬的乳桿菌，如表1所示。5株乳桿菌形態(tài)大小相近，長寬比為3左右，呈典型的桿菌形態(tài)。單個(gè)桿菌表面積在3 μm2左右，差異較小，不會因形態(tài)大小對凍干存活率造成較大差異。

表1 實(shí)驗(yàn)中乳桿菌的形態(tài)大小、莢膜多糖、胞內(nèi)甜菜堿濃度Table 1 The morphology，capsular polysaccharide and the glycine betaine of the selected Lactobacillus

前期研究表明，乳桿菌表面物質(zhì)的產(chǎn)生過量時(shí)，會降低凍干保護(hù)劑對乳桿菌的保護(hù)效率，導(dǎo)致菌體凍干存活率降低；乳桿菌胞外多糖含量<10-11mg/CFU這個(gè)水平時(shí)，不會影響菌的凍干存活率[17]。本研究篩選出的5株乳桿菌莢膜多糖產(chǎn)量均<10-12mg/CFU，不會對乳桿菌凍干存活率造成明顯影響。

選擇最具代表性的相容性溶質(zhì)甘氨酸甜菜堿表示胞內(nèi)相容性溶質(zhì)含量，相容性溶質(zhì)的積累差異一般在高滲有外源物質(zhì)補(bǔ)充的環(huán)境下發(fā)生[21]，實(shí)驗(yàn)中的乳桿菌在mMRS培養(yǎng)基培養(yǎng)條件下胞內(nèi)相容性溶質(zhì)甘氨酸甜菜堿含量很低，遠(yuǎn)達(dá)不到影響凍干存活率的程度。

綜上，經(jīng)篩選所得5株乳桿菌：干酪乳桿菌15m11、植物乳桿菌CCFM259、鼠李糖乳桿菌FJND、鼠李糖乳桿菌FAHHBO1、短乳桿菌173-1-2形態(tài)大小差異較小、胞外多糖及相容性溶質(zhì)不足以影響凍干存活率，通過這5株乳桿菌進(jìn)行后續(xù)的細(xì)胞膜脂肪酸研究。

2.2 不同乳桿菌的細(xì)胞膜脂肪酸組成

在相同的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)5株乳桿菌，利用GC-MS分析了乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸的具體組成(表2)。并根據(jù)乳桿菌的組成比例(圖1)及平均鏈長等特征對5株乳桿菌的細(xì)胞膜脂肪酸組成進(jìn)行比較分析。

表2 實(shí)驗(yàn)乳桿菌菌株的細(xì)胞膜脂肪酸組成及相對含量 單位：%

由表2可知，乳桿菌脂肪酸組成的主要成分為飽和脂肪酸十六烷酸(C16∶0)、不飽和脂肪酸十八烯酸(C18∶1)和環(huán)丙烷脂肪酸(cycC19∶0)，3種主要的成分占總脂肪酸的80%以上，十六烯酸(C16∶1)和十八烷酸(C18∶0)含量較低不超過10%。不同乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸的組成有較大差異，鼠李糖乳桿菌FJND的不飽和度最低為(54.01±0.10)%，平均鏈長最長達(dá)到17.39±0.01。干酪乳桿菌15m11和短乳桿菌173-1-2的不飽和度較高，分別為(63.25±0.12)%以及(64.14±0.13)%，平均鏈長分別為17.21±0.01 和17.30±0.01。細(xì)胞膜的不飽和度及鏈長會影響細(xì)胞膜在冷凍干燥這個(gè)不良環(huán)境中的流動(dòng)性，從而影響凍干存活率，一般認(rèn)為高不飽和度低鏈長的脂肪酸組成具有較高的膜流動(dòng)性[22]，細(xì)菌有利用脂肪酸組成改變細(xì)胞膜以應(yīng)對環(huán)境壓力，確保細(xì)胞膜保持最佳的狀態(tài)和持續(xù)的功能。極地環(huán)境中的嗜冷微生物的不飽和度往往可以達(dá)到95%以上[23]，從而在低溫下能存活繁殖。乳桿菌在37 ℃正常培養(yǎng)條件下不飽和度被調(diào)控為約55%～65%，通過環(huán)境的擾動(dòng)及添加過量的脂肪酸可以使正常的細(xì)胞膜受到擾動(dòng)，令細(xì)胞膜脂肪酸組成發(fā)生改變來適應(yīng)環(huán)境的變化。

2.3 細(xì)胞膜脂肪酸組成對凍干存活率的影響

5株乳桿菌凍干存活率見表3，在完全相同凍干工藝下5株乳桿菌的凍干存活率有較大差異，由于整個(gè)培養(yǎng)以及凍干保護(hù)劑都保持一致，形態(tài)、胞內(nèi)外物質(zhì)的干擾也較小，存活率的差異很大程度上來自于細(xì)胞膜脂肪酸的差異。一般而言，較長的鏈長增加了雙分子層間?；湹南嗷プ饔茫龠M(jìn)了更緊密的結(jié)構(gòu)，較短的鏈跨越的疏水雙層結(jié)構(gòu)域較少，受鏈間力的限制也較少，有助于更流動(dòng)的結(jié)構(gòu)。不飽和脂肪酸中的雙鍵通過增加鏈的體積和旋轉(zhuǎn)自由度來減少鏈的相互作用[24]，?；滈L和飽和度共同影響細(xì)胞膜的流動(dòng)性，而流動(dòng)性會影響冷凍干燥過程中膜相變的發(fā)生和膜損傷的程度[25]。根據(jù)實(shí)驗(yàn)中乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成分析可知，鼠李糖乳桿菌FJND細(xì)胞膜不飽和度最低，鏈長最長，結(jié)果其凍干存活率表現(xiàn)較差。干酪乳桿菌15m11和鼠李糖乳桿菌FAHHBO1不飽和度較高，鏈長較短，表現(xiàn)出了較理想的凍干存活率，這與普遍認(rèn)為的高不飽和度低鏈長的脂肪酸組成有利于細(xì)胞膜維持流動(dòng)性相符。乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度>60%、平均鏈長<17.30時(shí),乳桿菌存活率較高，推測是由于這個(gè)范圍內(nèi)的乳桿菌細(xì)胞膜流動(dòng)性較好，在冷凍干燥過程中受到較小的損傷。實(shí)驗(yàn)中短乳桿菌173-1-2的不飽和度為(64.14±0.13)%，平均鏈長17.31，但存活率較低，僅有(41.87±1.44)%，可能在沒有分析到的應(yīng)激蛋白表達(dá)、DNA分子受損修復(fù)上存在問題，本文將繼續(xù)研究通過提高不飽和脂肪酸的含量是否可以提高其凍干存活率。

表3 實(shí)驗(yàn)乳桿菌菌株的凍干存活率 單位：%

a-乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成比例；b-乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸平均鏈長圖1 實(shí)驗(yàn)中乳桿菌脂肪酸組成比例和細(xì)胞膜脂肪酸平均鏈長Fig.1 The composition of cell membrane fatty acid and average chain length of Lactobacillus注：組間不同字母表示具有顯著性差異(P<0.05)(下同)

2.4 細(xì)胞膜脂肪酸調(diào)控及其對乳桿菌凍干存活率的影響

經(jīng)過上述的細(xì)胞膜脂肪酸組成以及凍干存活率的分析，結(jié)果表明乳桿菌細(xì)胞膜的組成會影響最終的凍干存活率。對乳桿菌來說，高不飽和度和低鏈長的細(xì)胞膜脂肪酸組成有利于最終的凍干存活。鼠李糖乳桿菌FJND和短乳桿菌173-1-2的凍干存活率較低，考慮是否可以通過環(huán)境營養(yǎng)、環(huán)境應(yīng)激手段調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸組成從而提高乳桿菌凍干存活率。有研究表明，很多因素都能改變脂質(zhì)組成進(jìn)而影響細(xì)胞膜流動(dòng)性；包括溫度、化學(xué)物質(zhì)、離子、壓力、營養(yǎng)物和微生物培養(yǎng)物的生長階段[26]。吐溫20是外源月桂酸(C12∶0)補(bǔ)充劑，吐溫80是外源油酸(C18∶1)補(bǔ)充劑，被報(bào)道可以改變細(xì)胞膜脂肪酸組成[27]。酸應(yīng)激、冷應(yīng)激[28]也均有報(bào)道能提高乳桿菌不飽和度，改變細(xì)胞膜流動(dòng)性。然而通過這些因素調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸組成的效果如何，哪種調(diào)節(jié)細(xì)胞膜脂肪酸的手段最適合用在乳桿菌凍干工藝中應(yīng)用還沒有具體的比較總結(jié)。本實(shí)驗(yàn)選擇了較溫和并且破壞性較小的調(diào)控手段，研究環(huán)境應(yīng)激以及外源脂肪酸添加分別對細(xì)胞膜脂肪酸組成和存活率的影響。

2.4.1 環(huán)境應(yīng)激對細(xì)胞膜脂肪酸組成的改變

乳桿菌通過冷應(yīng)激和酸應(yīng)激處理后，細(xì)胞膜脂肪酸會有小幅度的改變，冷應(yīng)激能略微提高乳桿菌的不飽和度，酸應(yīng)激對細(xì)胞膜脂肪酸組成影響很小。2種應(yīng)激處理均沒有很明顯的凍干存活率的提升，其中鼠李糖乳桿菌FJND經(jīng)過冷應(yīng)激和酸應(yīng)激處理后凍干存活率從(45.22±1.54)%分別提高到(45.84±4.11)%和(50.52±1.24)%，短乳桿菌173-1-2經(jīng)過冷應(yīng)激與酸應(yīng)激處理后凍干存活率還發(fā)生了下降，這與預(yù)期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果有所差別，猜測是應(yīng)激雖然略微提高了細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度但是乳桿菌在應(yīng)激過程中產(chǎn)生了不可逆的損傷，最終的存活率發(fā)生下降。

如圖2所示，冷應(yīng)激、酸應(yīng)激造成的細(xì)胞膜飽和度改變很小，鏈長基本不會發(fā)生改變，這是由于環(huán)境應(yīng)激對細(xì)胞膜產(chǎn)生擾動(dòng)后，細(xì)胞膜開始改變脂肪酸合成朝著更適合應(yīng)激環(huán)境的方向改變[29]，由于環(huán)境中沒有充足的現(xiàn)成脂肪酸，乳桿菌需要通過延長酶及去飽和酶從頭合成或者改變脂肪酸的結(jié)構(gòu)，這個(gè)過程通常是比較緩慢的，因此通過冷應(yīng)激、酸應(yīng)激處理的乳桿菌飽和度及鏈長并沒有很大的改變，凍干存活率也無顯著提高。

2.4.2 添加外源脂肪酸對細(xì)胞膜脂肪酸組成的改變

由表4可知，過量添加富含月桂酸的吐溫20之后細(xì)胞膜組成中出現(xiàn)了本不存在的月桂酸，過量添加富含油酸的吐溫80細(xì)胞膜脂肪酸中油酸的比例大大提高，說明乳桿菌可以利用環(huán)境中現(xiàn)成的脂肪酸調(diào)節(jié)自身脂肪酸組成。2種脂肪酸的添加均提高了乳桿菌的凍干存活率，月桂酸的添加造成了不飽和度的降低，但是同時(shí)造成了平均鏈長顯著的降低，最終凍干存活率有較小幅度的提升。由圖3可知，外源油酸的添加極大的提高了不飽和度，平均鏈長稍有增加，最終的凍干存活率提升較大，鼠李糖乳桿菌FJND的凍干存活率從(45.22±1.54)%提升至(59.63±1.55)%，而短乳桿菌173-1-2凍干存活率從(41.87±1.44)%提升至(60.72±1.15)%。

圖3 不同處理后乳桿菌凍干存活率變化Fig.3 Changes of survival rate of lyophilized Lactobacillus after different treatments

表4 營養(yǎng)和應(yīng)激對鼠李糖乳桿菌FJND和短乳桿菌173-1-2細(xì)胞膜脂肪酸組成影響 單位：%

通過過量添加外源脂肪酸的方法培養(yǎng)，乳桿菌的飽和度范圍、鏈長范圍會發(fā)生很大的改變，而冷應(yīng)激、酸應(yīng)激造成的細(xì)胞膜飽和度改變很小，鏈長基本不會發(fā)生改變。因此，通過調(diào)控細(xì)胞膜脂肪酸組成提高乳桿菌的凍干存活率，采取添加外源脂肪酸的方法能比應(yīng)激處理獲得更加理想的效果。

a-總不飽和脂肪酸變化；b-鏈長變化圖2 乳桿菌總不飽和脂肪酸及鏈長的變化Fig.2 Changes of total unsaturated fatty acids and chain length in Lactobacillus

3 結(jié)論

不同乳桿菌的細(xì)胞膜脂肪酸不飽和度與鏈長具有差異，且會影響菌體的凍干存活率。高不飽和度、低平均鏈長的脂肪酸組成更有利于乳桿菌在冷凍干燥的環(huán)境下存活。添加外源脂肪酸或環(huán)境應(yīng)激后，乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成會產(chǎn)生改變，細(xì)胞膜脂肪酸組成的改變可以顯著提升乳桿菌的凍干存活率。低溫、酸等應(yīng)激對乳桿菌細(xì)胞膜脂肪酸影響較小，通過應(yīng)激處理乳桿菌凍干存活率的變化不顯著。而通過添加外源脂肪酸的方式會使乳桿菌飽和度和鏈長均發(fā)生較大的改變，存活率會產(chǎn)生較明顯的提升。添加2 mL/L的吐溫80后，乳桿菌不飽和度明顯提高，平均鏈長略微提高，凍干存活率顯著提高；添加2 mL/L的吐溫20后，乳桿菌不飽和度和平均鏈長均顯著下降，凍干存活率略微提升。