建立檢測禽流感病毒抗體的液相蛋白芯片方法

劉向楠 叢鋒 關(guān)劍池 劉賢旭

1.廣東科貿(mào)職業(yè)學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院 510430

2.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測所 510000

禽流感（Avian influenza，AI）是由禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）引起多種禽類發(fā)生感染和死亡的一種重要?jiǎng)游镆卟?，?yán)重危害世界養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展和公共衛(wèi)生安。目前，血凝抑制和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）檢測是實(shí)驗(yàn)室檢測AIV 抗體的主要技術(shù)方法。但是，血凝抑制試驗(yàn)1%紅細(xì)胞懸液的制備需要新鮮配制和保存，結(jié)果判讀主觀性較強(qiáng)。ELISA 試劑盒成本較高，無法實(shí)現(xiàn)多重抗體檢測。而本研究采用的液相蛋白芯片技術(shù)（Flexible Multi Analyte Profiling，xMAP）作為一種新型的高通量檢測技術(shù)，具有多重檢測和靈敏度高的技術(shù)優(yōu)勢，已普遍用于實(shí)驗(yàn)動(dòng)物疫病抗體檢測，在畜牧獸醫(yī)領(lǐng)域研究較少，尚未商品化應(yīng)用。

本研究建立了檢測AIV 抗體的xMAP 檢測方法，豐富了AIV 檢測技術(shù)方法，具有解決臨床上高通量抗體檢測的潛力，為禽流感的診斷、檢測及防控提供了一種新的技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 試劑禽流感病毒（Avian influenza virus，AIV）H2N2核蛋白（Nucleoprotein，NP 蛋白）購自廣州千尋生物技術(shù)有限公司。馬立克病毒（Marek's disease virus，MDV）陽性血清、新城疫病毒（Newcastle disease virus，NDV）陽性血清、AIV 陽性血清、SPF 雞血清購自哈爾濱維科生物科技有限公司。傳染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）陽性血清、傳染性支氣管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）陽性血清、傳染性喉氣管炎（Infectious Laryngotracheitis virus，ILTV）陽性血清購自中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）陽性血清為哈爾濱國生生物有限公司的禽白血病抗體ELISA 試劑盒中陽性對(duì)照品。28 份臨床雞血清采集自廣東惠州某養(yǎng)雞場。

生物素標(biāo)記的兔抗雞IgG 購自Solarbio 公司，藻紅蛋白標(biāo)記的鏈霉親和素（SAPE）購自Invitrogen 公司。xMAP 磁珠購自Luminex 公司。禽流感ELISA 抗體檢測試劑盒購于西班牙海博萊公司。

1.2 儀器液相芯片檢測系統(tǒng)Luminex 2000，渦旋振蕩儀，超聲儀，搖床，磁力板等。

1.3 蛋白抗原性分析按經(jīng)驗(yàn)值將NP 參考蛋白偶聯(lián)試劑盒說明書偶聯(lián)到xMAP 磁珠，蛋白濃度為8μg/ 106 磁珠，將有偶聯(lián)后的磁珠稀釋至50 個(gè)/μL，取50μL 稀釋后的磁珠加入96 孔板。以禽流感陽性血清為陽性對(duì)照，以SPF 級(jí)雞陰性血清作為陰性對(duì)照，分別1 ∶100 倍稀釋，每孔加入50μL 稀釋后血清，混勻后室溫震搖2 小時(shí)。洗液洗2 遍后，按100μL/孔加入2mg/L 的生物素標(biāo)記二抗，室溫振搖30 分鐘。洗液洗2 遍后，按100μL/孔加入2mg/L 的SAPE，室溫振搖30分鐘。洗液洗2 遍后加入100μL/孔洗液，在液相芯片檢測系統(tǒng)Luminex 2000 上讀取MFI 值，并計(jì)算陽性血清熒光信號(hào)值（MFI）值與陰性MFI 值的比值，即P/N 值。若P/N 值＞5，表明包被的蛋白抗原性較好，值得進(jìn)一步優(yōu)化反應(yīng)條件。

1.4 xMAP 檢測條件的優(yōu)化將NP 蛋白按1、2、4、8、16和32μg/106磁珠的濃度分別包被磁珠。將AIV 陽性血清和SPF 雞血清分別稀釋25 倍，隨后作2 倍倍比稀釋，按照1.3的方法檢測。上機(jī)讀取MFI 值，計(jì)算對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)陽性血清與陰性血清的MFI 比值（P/N 值）；以檢測靈敏度最高且P/N 最大的蛋白包被濃度為抗原最佳工作濃度。

1.5 特異性試驗(yàn)將AIV、IBV、ILTV、AIV、NDV、MDV、IBDV 和ALV 陽性血清進(jìn)行1 ∶100 稀釋，按優(yōu)化后的NP 蛋白包被濃度檢測上述血清，并使用SPF 雞血清作陰性對(duì)照血清，驗(yàn)證特異性，方法同1.3。

1.6 靈敏性試驗(yàn)將AIV 陽性血清稀釋25 倍，隨后作2 倍倍比稀釋，按優(yōu)化后的NP 蛋白包被濃度檢測上述血清，SPF雞血清作為陰性對(duì)照，PBS 作為空白對(duì)照，檢驗(yàn)靈敏性。

同時(shí)使用商品化ELISA 試劑盒同步檢測，具體操作按照試劑盒說明書進(jìn)行：通過對(duì)比兩種方法檢出陽性的血清最低稀釋倍數(shù)來比較兩種檢測方法的靈敏度。

1.7 重復(fù)性試驗(yàn)用所建立的方法對(duì)1∶200 稀釋陽性血清進(jìn)行重復(fù)性檢測，同一批內(nèi)每個(gè)檢測樣品進(jìn)行3 次重復(fù)測定，對(duì)MFI 值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV）。對(duì)上述樣品進(jìn)行3次測定，計(jì)算同一樣品測定結(jié)果之間的批間變異系數(shù)（CV）。

1.8 臨床樣本的檢測利用所建立的xMAP 方法和商品化ELISA 試劑盒對(duì)收集到的28 份臨床樣本進(jìn)行檢測，對(duì)比兩者的陽性檢出率及符合率。

2 結(jié)果

2.1 AIV xMAP檢測方法建立將重組蛋白包被熒光磁珠后，用AIV陽性對(duì)照血清，陰性血清對(duì)照作為檢測樣品，進(jìn)行間接免疫試驗(yàn)，經(jīng)Luminex 200儀器檢測，結(jié)果如圖1 所示，陽性血清的MFI 值高達(dá)7789.5，陰性血清僅66.5-76，二者差異明顯，說明包被的AIV NP 重組蛋白能夠很好地識(shí)別AIV 陽性血清，抗原性較好。

圖1 NP 蛋白xMAP 檢測AIV 陽性血清和陰性血清

2.2 AIV 重組抗原最佳包被濃度確定每1×106個(gè)磁珠分別包被1μg，2μg，4μg，8μg，16μg，32μg 共6 個(gè)濃度，按照1.3 的檢測方法進(jìn)行檢測，結(jié)果表明16μg/1×106個(gè)磁珠的包被濃度時(shí)P/N 平均值最高，達(dá)198.08，最終確定使用16μg/1×106個(gè)磁珠的包被濃度（表1 和表2）。

表1 不同濃度NP 蛋白包被MFI 值

表2 不同濃度NP 蛋白包被的P/N 值

2.3 特異性的檢測采用建立的xMAP 方法對(duì)NDV、AIV、IBV、ILTV、IBDV、MDV 和ALV 陽性血清進(jìn)行檢測，驗(yàn)證該方法的特異性。結(jié)果除AIV 為陽性外，其他病毒血清均為陰性（P/N 值小于2.5），不存在交叉反應(yīng)，表明建立的方法具有良好的特異性（表3 和圖2）。

表3 xMAP 檢測AIV 的特異性檢測

圖2 特異性實(shí)驗(yàn)的結(jié)果

2.4 xMAP 與ELISA 的靈敏度比較

xMAP 與ELISA 分別檢測稀釋度1∶25～1∶409600的AIV 陽性血清。結(jié)果顯示，xMAP 能檢測到的AIV陽性血清的最高稀釋度為1∶ 102400；而ELISA 能檢測到的最高稀釋倍數(shù)為1∶100（表4 和圖3）。

圖3 xMAP 與ELISA 方法檢測AIV 的靈敏度

表4 xMAP 與ELISA 方法檢測AIV 的靈敏度

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用所建立的方法對(duì)1 ∶200 倍數(shù)稀釋的陽性血清和陰性對(duì)照血清進(jìn)行重復(fù)檢測，同一次實(shí)驗(yàn)對(duì)陽性樣品作3 次重復(fù)測定，讀取MFI 值并計(jì)算其P/N 值，統(tǒng)計(jì)P/N 值并計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)（CV 值）；重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)3次，對(duì)比不同次實(shí)驗(yàn)里的批內(nèi)變異系數(shù)，對(duì)不同次實(shí)驗(yàn)的平均P/N 值統(tǒng)計(jì)并計(jì)算其批間變異系數(shù)。

三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)的批內(nèi)變異系數(shù)分別為1.97%，3.36%，1.18%，其中最大值為3.36%；批間變異系數(shù)為7.66%。以上結(jié)果均小于10%，表明該檢測方法具有較好的重復(fù)性（表5）。

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.6 臨床樣品檢測應(yīng)用建立的AIV xMAP 方法與ELISA 方法比較，對(duì)28 份臨床樣樣本進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果見表6。AIV 檢測中，xMAP 檢測出28 例陽性，0 例陰性；ELISA 檢測出28 例陽性，0 例陰性。兩種檢測方法結(jié)果相符（表7）。

表6 xMAP 與ELISA 檢測臨床樣本結(jié)果比較

注：下劃線為陽性

表7 xMAP 與ELISA 的符合率

3 結(jié)論

本研究初步建立了AIV 抗體的xMAP 檢測方法；確定了AIV NP 蛋白的最佳抗原包被濃度為16μg/106個(gè)磁珠。特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示所建立的方法與ILTV、IBV、NDV、MDV、IBDV、ALV 陽性血清沒有交叉反應(yīng)，表明該方法特異性良好。對(duì)AIV 陽性血清檢測的靈敏度高于ELISA 方法1024 倍。重復(fù)試驗(yàn)中，批內(nèi)CV 值最高為3.36%，批間CV 值為7.66%，表明重復(fù)性較佳。對(duì)28 份臨床樣品檢測與ELISA 結(jié)果相符。綜上，本研究建立了一種特異性、靈敏性和重復(fù)性均良好的xMAP 檢測方法。但xMAP 檢測的優(yōu)勢在于多重檢測，本研究僅建立了AIV 抗體檢測方法，尚不能發(fā)揮多重檢測的優(yōu)勢，有待于進(jìn)一步建立ILTV、IBV、NDV 等病原抗體的xMAP 方法，然后聯(lián)合使用。本研究采集臨床樣品的雞場均免疫了禽流感疫苗，檢測結(jié)果100%陽性率，表明免疫程序規(guī)范均產(chǎn)生抗體。推測因免疫后抗體水平較高，因此即使檢測靈敏度較低的ELISA 方法仍100%檢出。