HIF-3在骨肉瘤組織中的表達及低氧狀態(tài)對MG-63細胞侵襲能力的影響

盛奇智 阮鋒 魏優(yōu)秀 李廣磊 劉平*

骨肉瘤是骨組織最常見的原發(fā)性實體惡性腫瘤，也是骨腫瘤患者的主要死亡原因之一[1-2]。骨肉瘤的惡性程度高、轉移早，治療后容易復發(fā)和轉移，患者預后差，5年生存率相對較低。骨肉瘤的侵襲轉移機制目前尚未完全闡明，仍然是當前研究的熱點和難點。

目前大量研究表明，低氧微環(huán)境與人類惡性實體腫瘤關系非常密切[3-4]，腫瘤低氧環(huán)境是引起其侵襲轉移的關鍵因素[5-6]。檢測低氧微環(huán)境誘導的骨肉瘤細胞內相關基因的表達對闡明其侵襲轉移的分子機制具有重要作用。腫瘤對低氧引起的反應主要是由轉錄因子低氧誘導因子（hypoxiainducible factor，HIF）家族介導的，HIF由功能性的 亞基和結構組成性的 亞基[7]2個亞基組成，亞基對氧敏感，對HIF功能的發(fā)揮起關鍵作用[8]。有研究報道在人體內發(fā)現HIF-3，在胰腺癌中，低氧誘導的HIF-3表達增強了胰腺癌細胞的侵襲轉移能力[9-10]。本文以骨肉瘤組織和細胞株為研究對象，從細胞學實驗角度確立HIF-3在骨肉瘤中的表達與侵襲轉移的關系，探討HIF-3在此關系中的作用。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清（Gibco公司，美國）；-actin抗體（Proteintech公司，中國）；HIF-3抗體（Proteintech公司，中國）；HRP標記羊抗兔IgG（H+L）（Proteintech公司，中國）；FLAG-HIF-3質粒（ViGene公司，中國）；HIF-3及-actin引物合成（GENE公司，中國）；HiPerFect Transfection Reagent（Qiagen公司，美國）；Effectene Transfection Reagent（Qiagen公司，美國）；Oligofectamine Reagen（Invitrogen公司，美國）；HIF-3 siRNA（廣州瑞博生物科技有限公司）。

1.2 一般資料

選擇武漢大學人民醫(yī)院和華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬梨園醫(yī)院2017年1月～2019年12月骨科骨肉瘤患者手術切除送檢的骨肉瘤標本15例，選擇同期骨軟骨瘤患者手術切除的骨軟骨瘤組織15例作為對照。其中骨肉瘤組織標本來源患者年齡12～45歲，平均（30.3±14.7）歲，對照組骨軟骨瘤組織來源患者年齡13～48歲，平均（32.2±15.9）歲。兩組標本來源患者年齡比較差異無統(tǒng)計學意義。標本組織入選標準：具備完整的臨床資料；具備詳細的診療記錄，病歷記錄詳細、規(guī)范，手術資料及影像學資料完備；組織標本排除標準：既往曾患惡性腫瘤或合并其他器官系統(tǒng)腫瘤患者；合并其他系統(tǒng)慢性器官功能衰竭患者；患有其他內分泌系統(tǒng)疾病；長期應用糖皮質激素或免疫抑制劑患者；合并慢性呼吸系統(tǒng)疾病可能導致慢性低氧性疾病患者。

1.3 RT-PCR法檢測骨肉瘤MG-63細胞中HIF-3 mRNA的表達

提取細胞總RNA，逆轉錄合成cDNA，再進行qRT-PCR擴增檢測，應用SYBRGreenⅠ熒光染料技術進行實時定量PCR反應，獲取各組標本的標準曲線，計算并分析結果值。本實驗所用到的引物均由上海生工生物有限公司設計并合成：管家基因（GAPDH）的引物序列為：H-GAPDHForward primer：5'TGGGTGTGAACCATGAGAAGT3'；H-GAPDH Reverse primer：5'TGAGTCCTTCCACGATACCAA 3'；目的基因引物序列：H-HIF3 Forward primer：5'CAGGCTACAGTGGTGTCAGG 3';H-HIF3 Reverse primer：5'TGCGAGTATGTTGCTCCGTT 3'。

1.4 Western Blot法檢測骨肉瘤MG-63細胞中HIF-3蛋白表達

提取細胞總蛋白，BCA法測定蛋白濃度，Western Blot檢測相關蛋白表達情況，Image J軟件對Western Blot圖像進行統(tǒng)計分析。

1.5 HIF-3 siRNA的轉染

HIF-3 siRNA靶序列：#1：ACAGCAGCTTGCACATT；#2：GCAGGAGCATCCACACT；#3：CCAGCTGCATCGACAGT。

細胞按照轉染步驟進行siRNA轉染后提取RNA或蛋白，分別用RT-PCR和Western Blot方法檢測HIF-3的mRNA和蛋白的表達情況。

1.6 細胞過表達FLAG-HIF-3質粒轉染

細胞按照轉染步驟進行質粒轉染，轉染后提取RNA或蛋白，分別用RT-PCR和Western Blot方法檢測HIF-3的mRNA和蛋白的表達情況。

1.7 骨肉瘤MG-63細胞黏附實驗

向96孔培養(yǎng)板內細胞中加入100 L/孔的100 g/mL的Fn作用2 h，黏附細胞用Promega公司的Cyto Tox96R Non2Radioactive Cytotoxicity Assay Kit定量。用酶聯(lián)儀測定OD490的值；黏附細胞百分比等于黏附細胞OD490和加入總細胞OD490的比。

1.8 骨肉瘤MG-63細胞遷移實驗

將MG-63細胞接種于24孔培養(yǎng)板里Millicell上室，下室加入400 L完全培養(yǎng)液，培養(yǎng)24 h后，取出Millicell小室，收集運動至下室的細胞，MTT法測穿膜細胞數。遷移率＝［（實驗組值－空白組值）/（正常對照組值－空白組值）］×100%。

1.9 骨肉瘤MG-63細胞體外侵襲實驗

用50 L Matrigel包被Millicell小室，將Millicell小室放入24孔培養(yǎng)板，上室為含1%FBS的培養(yǎng)液，將MG-63細胞接種于已用Matrigel包被好的24孔培養(yǎng)板Millicell小室上室中培養(yǎng)48 h，取出Millicell小室，用棉簽擦去微孔濾膜上層的細胞，固定、染色穿過微孔濾膜侵襲至下室的細胞，在400倍倒置顯微鏡下計數侵襲穿膜細胞數，每張膜選取8個視野。以對照組侵襲細胞數為參照，按以下公式計算各組細胞侵襲率：侵襲率＝（實驗組侵襲穿膜細胞數／正常對照組侵襲穿膜細胞數）×100%。

1.10 免疫組織化學染色

對全部30例標本進行石蠟切片免疫組織化學染色，實驗大致步驟為：石蠟切片脫蠟至水，抗原修復，阻斷內源性過氧化物酶，血清封閉，加一抗，加二抗，DAB顯色，脫水封片，最后顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件對實驗數據進行統(tǒng)計學分析。計量資料用均數±標準差表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用 檢驗。<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 免疫組化檢測HIF-3在骨肉瘤組織中的表達

通過對臨床上收集的15例骨肉瘤組織和15例骨軟骨瘤組織進行HIF-3免疫組化染色，觀察骨肉瘤和骨軟骨瘤組織中HIF-3的表達情況，如圖1所示，骨軟骨瘤組織作為對照，發(fā)現在骨肉瘤組織中HIF-3顯著表達（棕黃色顆粒）（見圖1B），而骨軟骨瘤組織中未見表達（見圖1A）。

圖1 組織中HIF-3的表達情況（標尺為100 m）：A.免疫組化染色骨軟骨瘤組織HIF-3的表達；B.免疫組化染色骨肉瘤組織HIF-3的表達

2.2 檢測低氧對HIF-3表達的影響

用常氧和低氧條件下培養(yǎng)MG-63細胞48 h后分別用定量RT-PCR和Western Blot方法檢測HIF-3在轉錄mRNA水平和蛋白水平的表達情況，如圖2所示，在低氧刺激下，HIF-3 mRNA和蛋白都明顯升高，表明低氧促進了HIF-3的表達。

2.3 檢測低氧對骨肉瘤MG-63細胞的黏附、遷移和侵襲能力的影響

在常氧和低氧條件下檢測了MG-63細胞的黏附、遷移和侵襲能力，如表1所示，和常氧組相比低氧組骨肉瘤MG-63細胞的黏附率、遷移率和侵襲率都明顯增加，差異具有統(tǒng)計學意義（<0.05）。

表1 低氧對MG-63骨肉瘤細胞黏附、遷移和侵襲的影響（%）

2.4 HIF-3 siRNA的篩選

筆者從廣州銳博生物科技有限公司訂購了3條HIF-3 siRNA，靶序列為：#1：ACAGCAGCTTGCACATT；#2：GCAGGAGCATCCACA；#3：CCAGCTGCATCGACAGT；在MG-63細胞中轉染HIF-3 siRNA 72 h收集細胞，用定量RT-PCR和Western Blot方法檢測HIF-3在轉錄組和蛋白組上的表達情況，以篩選出沉默有效的HIF-3 siRNA。如圖3所示，3條HIF-3 siRNA中HIF-3 siRNA#1沉默效率最高，后續(xù)的敲降實驗中用此條。

2.5 敲降HIF-3后檢測骨肉瘤MG-63細胞低氧誘導的HIF-3表達情況

通過在MG-63細胞中轉染HIF-3 siRNA#1后，觀察常氧和低氧條件下HIF-3的表達情況，如圖4所示，低氧引起的HIF-3的表達升高可以被HIF-3小干擾RNA抑制。

2.6 敲降HIF-3后檢測骨肉瘤MG-63細胞低氧誘導的黏附、遷移和侵襲能力的情況

在MG-63細胞中轉染HIF-3 siRNA后，檢測常氧和低氧條件下MG-63細胞的黏附率、遷移率和侵襲率，如表2所示，HIF-3敲降后可以使MG-63細胞的黏附率、遷移率和侵襲率都減小，差異具有統(tǒng)計學意義（<0.05）。

表2 敲降HIF-3后檢測骨肉瘤MG-63細胞黏附、遷移和侵襲能力的情況（%）

2.7 過表達HIF-3后檢測骨肉瘤MG-63細胞低氧誘導的黏附、遷移和侵襲能力的情況

HIF-3-FLAG質粒帶有FLAG標簽蛋白，轉染過后，Western Blot檢測FLAG標簽蛋白，如圖5所示，檢測到FLAG蛋白，說明MG-63細胞HIF-3過表達成功。接著，過表達之后，檢測MG-63細胞的黏附率、遷移率和侵襲率，如表3所示，HIF-3過表達后可以使得MG-63細胞的黏附率、遷移率和侵襲率都增加，差異具有統(tǒng)計學意義。

表3 過表達HIF-3后檢測骨肉瘤MG-63細胞黏附、遷移和侵襲能力的情況（%）

圖5 MG-63細胞HIF-3質粒轉染24 h后，檢測標簽蛋白FLAG表達情況

3 討論

骨肉瘤是兒童和65歲以上老年人中常見的原發(fā)性惡性骨腫瘤，其病理學特征是容易復發(fā)和轉移，并且對化療的耐受性強，預后差[3]。研究表明，當腫瘤體積超過1 mm3時，氧不能完全擴散到整個腫瘤中[11]。幾乎所有實體瘤都因其快速生長與營養(yǎng)和血液供應之間的不平衡而存在低氧，因此腫瘤細胞對低氧的適應性尤為重要。低氧誘導因子HIF既包含低氧誘導型 亞基，又包含組成型表達的 亞基，在低氧對骨肉瘤影響過程中起關鍵作用。HIF不僅與骨肉瘤抗藥性和生存不良有關，而且與臨床中的疾病等級、分期和復發(fā)有關[12-14]。有研究報道，HIF可通過直接和間接機制誘導細胞凋亡，HIF通過直接誘導促凋亡基因（如BNIP3和NIX）的表達來促進低氧條件下腫瘤細胞的存活[15]。BNIP3的表達受到HIF-2的抑制，HIF-2通過使p53泛素連接酶Mdm2失活來穩(wěn)定p53，或在其與HIF-1上的氧依賴性降解域結合后誘導p53激活p53介導的細胞周期停滯并導致細胞凋亡[16]。HIF-1還可以通過激活抗凋亡基因，如Bcl-2基因家族和凋亡抑制劑（IAPs），或通過增加葡萄糖攝取和糖酵解來間接誘導凋亡并促進腫瘤細胞存活[17]，在低氧條件下，HIF通過與HRE區(qū)結合來調節(jié)下游基因（如Glut-1和VEGF）的表達。有研究表明，HIF-1沉默可下調Akt的磷酸化，從而通過阻斷促凋亡因子Bad和Caspase-9的活性來抑制細胞凋亡，從而通過增加IKK的磷酸化最終促進細胞存活，進而激活核因子（NF-kb）[18]。

在腫瘤領域的研究中，相比HIF-1和HIF-2，HIF-3研究相對較少，特別是在骨肉瘤的相關研究中，HIF-1和HIF-2研究的比較多，與骨肉瘤的侵襲轉移相關機制做的比較深，而HIF-3的作用尚未可知，所以筆者選擇HIF-3作為研究對象。有研究報道HIF-3的表達上調加速了卵巢癌進程[19]，在低氧條件下，胰腺癌細胞中HIF-3表達的刺激程度高于HIF-1和HIF-2表達。HIF-3蛋白水平在胰腺癌組織中也升高，與存活率降低、局部浸潤和遠處轉移相關，而HIF-3的敲低在低氧條件下抑制了胰腺癌細胞的侵襲和遷移。在常氧下，HIF-3的過度表達促進胰腺癌細胞的侵襲和遷移，并刺激F-肌動蛋白的聚合?？傊?，HIF-3通過轉錄激活RhoC-ROCK1信號通路促進體內胰腺癌細胞的侵襲和轉移[20]。筆者通過在臨床上收集骨肉瘤組織并對其做免疫組化查看HIF-3的表達情況，發(fā)現與正常組織相比，骨肉瘤組織高表達HIF-3，初步說明HIF-3與骨肉瘤關系密切，所以筆者緊接著通過細胞實驗探討HIF-3與骨肉瘤的關系。

大量文獻報道低氧會促進腫瘤的侵襲轉移[21]，但HIF-3在其中的作用不得而知。筆者首先檢測了低氧對骨腫瘤MG-63細胞中HIF-3的表達情況，發(fā)現低氧促進了HIF-3 mRNA和蛋白的表達，并且低氧促進了MG-63細胞的侵襲轉移能力，緊接著通過敲降和過表達方面對HIF-3和MG-63細胞的侵襲轉移關系進行研究，發(fā)現敲降HIF-3后抑制了低氧對MG-63細胞侵襲轉移的誘導，過表達HIF-3后增強了低氧對MG-63細胞侵襲轉移的誘導作用，說明HIF-3與MG-63細胞侵襲轉移直接相關。氧氣供應不足會導致低氧誘導因子（HIF）的表達，從而導致促血管生成因子的積累和腫瘤侵襲性[22-23]。筆者猜想HIF-3的升高可能會影響腫瘤侵襲相關的多種信號通路，這需要通過后續(xù)實驗來探討。

目前，預防骨腫瘤進展和骨轉移發(fā)展方面取得了長足的進步。當前，臨床上已經采用了幾種方法來治療骨腫瘤和骨轉移。其中大多數強調預防刺激破骨細胞和阻斷骨吸收或降低血液中PTHrP的濃度。應用的藥物包括骨保護素、RANKFc[24]、雙膦酸鹽[25]、PTHrP抗體[26]和維生素D類似物。其他藥物的重點是通過靶向儲存在骨頭中的細胞因子，如TGF-。筆者發(fā)現對腫瘤低氧的適應在腫瘤的發(fā)展和轉移中都很重要。HIF-1主要在低氧條件下發(fā)揮作用，在腫瘤細胞的遷移和侵襲中起關鍵作用。通過藥理學抑制HIF靶VEGF產生的抗血管生成作用也強調了該蛋白對于腫瘤血管生成的重要性。此外，HIFs在耐藥性和抗輻射性中起著重要作用[27]，這在癌癥的治療中具有重要作用。HIF途徑的阻斷可能為腫瘤患者提供一種新的診療策略。低氧是所有實體瘤所共有的特點，腫瘤低氧在臨床研究中具有重要意義。低氧誘導因子1（HIF-1）是細胞對低氧反應的主要參與者，HIF-1在低氧條件下對調節(jié)腫瘤存活和生長起著至關重要的作用，因此已被列為癌癥治療目標的首位。近年來，已經發(fā)現了幾種可以特異性靶向HIF途徑的小分子[28-29]，目前已經開發(fā)了幾種針對腫瘤低氧的基因治療策略[29-30]，筆者對HIF-3的研究為開發(fā)用于臨床癌癥治療的抗腫瘤藥物提供了一種可行性，通過下調蛋白HIF-3來抑制腫瘤的侵襲轉移，為治療骨肉瘤提供新的治療思路。