聚醚醚酮基骨科植入物的改性技術(shù)研究*

梁新宇# 馬靜# 唐斌* 劉正偉,3

聚醚醚酮（polyetheretherketone，PEEK）由于其優(yōu)異的力學(xué)性能、耐化學(xué)性、良好的生物相容性和可重復(fù)滅菌處理，使其被開發(fā)為骨科應(yīng)用中的新型生物材料。與金屬骨替代物相比，具有低彈性模量（3～4 GPa）的PEEK植入物避免了應(yīng)力屏蔽，從而提高了其長期穩(wěn)定性[1]。由于其射線的可透性和非磁性，PEEK還避免了CT或MRI中的偽影，從而提高了外科醫(yī)師的術(shù)后診斷準(zhǔn)確率[2]。PEEK生物材料具有優(yōu)異的耐磨性，有效避免了磨損顆粒引起的炎癥和骨質(zhì)溶解。然而，PEEK的生物惰性阻礙了植入后的骨整合，限制了其臨床應(yīng)用，因此需通過各種技術(shù)改性PEEK，以提高其生物活性。已報(bào)道的技術(shù)有3D打印[3]、表面引入孔隙[4]、羥基磷灰石（hydroxyapatite，HA）摻雜[5]和生物活性顆粒涂層[6]等，且均在一定程度上提高了PEEK材料的生物活性。但這些技術(shù)需使用98%的濃硫酸或在高溫（360℃以上）條件下進(jìn)行，因此仍需要探索一種新型的、無需濃硫酸或高溫條件下的改性方法。

聚乳酸（polylactic acid，PLA）由于其易加工性、優(yōu)異的生物相容性和可降解性已被用于多孔支架、手術(shù)縫合線、藥物遞送顆粒等[7]。但PLA的脆性（斷裂伸長率不到10%）限制了其在需要高應(yīng)力和塑性變形的植入物中的應(yīng)用。鑒于具有編織結(jié)構(gòu)的PEEK良好的韌性（延展性可達(dá)10%～60%）[8-9]，故將PEEK編織物與PLA相結(jié)合以利用各自優(yōu)勢，實(shí)現(xiàn)PEEK基復(fù)合材料在保持原有優(yōu)異力學(xué)性能前提條件下易加工改性的需求。

硫酸鍶軟骨素（strontium chondroitin sulfate，SrCS）是一種新型的多糖金屬離子化合物，通過用鍶離子代替硫酸軟骨素（chondroitin sulfate，CS）上的鈉離子而合成[10]。其中的CS是所有結(jié)締組織的基本成分，是一種異質(zhì)多糖，有助于抗炎、抑制細(xì)胞凋亡和形成膠原蛋白[11]。鍶（Sr）是一種主要存在于骨骼中的微量元素，具有促進(jìn)骨質(zhì)形成、改善骨結(jié)構(gòu)及治療骨質(zhì)疏松的作用[12]。故將SrCS引入具有優(yōu)異力學(xué)性能的PEEK基復(fù)合材料中以提高其生物活性。因此，本研究將熔融的PLA充分填充于PEEK二維編織物中，之后在PLA/PEEK復(fù)合材料的表面上引入SrCS，以期獲得易加工且兼具仿生骨力學(xué)性能和生物活性的聚醚醚酮基生物材料，提供一種新型的、無需濃硫酸或高溫條件下的改性方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料及儀器

PEEK細(xì)絲（0.3 mm，中國江蘇駿華PEEK有限公司）；PEEK二維編織物（深圳市精細(xì)紡織有限公司）；聚乳酸顆粒（中國浙江海正生物材料有限公司）；乙醇和二甲基亞砜（北京化工廠）；氯仿（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司）；-MEM培養(yǎng)基、10%牛血清（Gibco公司，美國）；噻唑藍(lán)（MTT）（Sigma公司，美國）；L929成纖維細(xì)胞（ATCC，Rockville，MD，美國）；電恒溫干燥箱（DHG-9140A，中國），超景深三維顯微鏡（VHX-5000），附有能量色散光譜（EDS）的掃描電子顯微鏡SEM（ZEISS Merlin，德國），X射線衍射儀（XRD）（Rigaku-Smartlab，日本）；納米壓痕儀G200（Keysight Technologies，美國）；萬能試驗(yàn)機(jī)（CMT5205，中國），全自動酶標(biāo)儀（BIO-RAD，美國）。

1.2 PEEK基復(fù)合材料的制備

在通風(fēng)櫥中，將5 g PLA顆粒溶于100 mL氯仿溶液中，磁力攪拌3 h，以確保PLA顆粒完全溶解。然后將2 g PEEK二維編織物浸入已完全溶解的PLA溶液中，真空中保持12 h，以促進(jìn)PLA充分地填充于PEEK二維編織物的孔隙中和氯仿完全蒸發(fā)。再將含有PLA的PEEK二維編織物置于銅制模具中，加熱至設(shè)定溫度（分別為145℃、155℃和165℃）并在10 MPa壓力下保持30 min。隨后，采集PLA/PEEK復(fù)合材料樣品并按照樣品測試尺寸標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行切割待用。在上述PLA溶液中加入100 mg SrCS粉末，再重復(fù)上述流程即可獲得SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料。

1.3 PEEK基復(fù)合材料的表征

1.3.1 表面形貌和結(jié)構(gòu)檢測

PEEK基復(fù)合材料表面的結(jié)構(gòu)和主要元素組成分別通過超景深三維顯微鏡和附有能量色散X射線光譜（energy-dispersive X-ray spedctroscopy，EDS）的SEM進(jìn)行表征。

1.3.2 結(jié)晶度檢測

以9 kW銅靶為輻射源，用X射線衍射儀檢測了PEEK基復(fù)合材料的晶相。衍射角（2）設(shè)定在3°～30°之間，管電流和管電壓分別為200 mA和45 kV。

1.3.3 宏觀力學(xué)檢測

使用萬能試驗(yàn)機(jī)測量樣品的宏觀力學(xué)性能。根據(jù)GB 13022-1991塑料-薄膜拉伸性能試驗(yàn)方法[9]，在環(huán)境溫度和65%相對濕度下，對樣品加載以5 mm/min的速度進(jìn)行單軸拉伸的試驗(yàn)。

1.3.4 微觀力學(xué)檢測

通過納米壓痕儀測量樣品的微觀力學(xué)性能。所使用的壓頭尖端金剛石Berkovich探針（具有1 140 GPa的楊氏模量和0.07的泊松比）。對所有樣品在隨機(jī)選擇的位置進(jìn)行25個(gè)壓痕實(shí)驗(yàn)，將以20 mN/min的恒定速率至峰值載荷（分別為50、100、200、300和400 mN）并保持30 s，然后卸載。

1.3.5 體外細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

L929成纖維細(xì)胞培養(yǎng)于混有-MEM培養(yǎng)基和10%牛血清的培養(yǎng)基中。樣品分別為PLA/PEEK和SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料，每組樣品設(shè)立6個(gè)平行樣本。在24孔培養(yǎng)板中，所有樣品分別經(jīng)75%的乙醇溶液（浸泡2 h）和12 h的紫外線照射進(jìn)行消毒滅菌處理。隨后，將樣品放置于加有1 mL細(xì)胞培養(yǎng)基的潔凈24孔板中，分別在37℃、5%CO2環(huán)境下預(yù)處理12 h，再將L929成纖維細(xì)胞以每孔2×104個(gè)細(xì)胞的密度接種于24孔板中分別共培養(yǎng)1、3和5 d后，每孔中加入100 L 5 mg/mL MTT溶液，放回培養(yǎng)箱中孵育4 h。隨后吸去培養(yǎng)基，每孔中加入1 mL DMSO（二甲基亞砜）溶液，再將24孔板用錫箔包裹以避光，并在脫色振蕩器上振蕩15 min。最后每孔取100 L轉(zhuǎn)移到96孔板中。使用全自動酶標(biāo)儀在490 nm處測定各孔吸光度值，分析各樣品的細(xì)胞增殖情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用Origin8.0統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析處理。<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PLA/PEEK復(fù)合材料的表面形貌和結(jié)構(gòu)

不同熱壓溫度（145℃、155℃和165℃）下PLA/PEEK復(fù)合材料表面的超景深圖像如圖1所示。結(jié)果顯示，與145℃（見圖1A）和165℃（見圖1C）熱壓后復(fù)合材料相比，155℃（見圖1B）熱壓PLA/PEEK復(fù)合材料中PEEK細(xì)絲被透明的PLA膜均勻地包裹著。不同熱壓溫度下PLA/PEEK復(fù)合材料的橫切面超景深和SEM圖像如圖2、圖3所示。結(jié)果表明，在考察的3個(gè)熱壓溫度下，PLA/PEEK復(fù)合材料中的PEEK細(xì)絲均被PLA包裹。

圖1 不同熱壓溫度下PLA/PEEK復(fù)合材料表面超景深圖：A.145℃；B.155℃；C.165℃

圖2 不同熱壓溫度下PLA/PEEK復(fù)合材料橫切面超景深圖：A.145℃；B.155℃；C.165℃

圖3 不同熱壓溫度下PLA/PEEK復(fù)合材料橫切面SEM圖：A.145℃；B.155℃；C.165℃

2.2 PLA/PEEK復(fù)合材料的宏觀力學(xué)性能

不同熱壓溫度下PLA/PEEK復(fù)合材料的拉伸性能如圖4所示。從圖4中可看出，PLA/PEEK復(fù)合材料的拉伸模量和拉伸強(qiáng)度隨著熱壓溫度的升高呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢。不同熱壓溫度下PLA/PEEK復(fù)合材料的XRD圖譜如圖5所示，顯示了PLA衍射峰的兩個(gè)位置在熱壓前后沒有明顯變化，但其強(qiáng)度隨熱壓溫度的增加而增強(qiáng)。155℃熱壓后的PLA/PEEK復(fù)合材料的衍射峰強(qiáng)度達(dá)到最大。

圖4 不同熱壓溫度下PLA/PEEK復(fù)合材料的拉伸性能：A.拉伸模量；B.拉伸強(qiáng)度

圖5 不同熱壓溫度下不同材料的XRD圖譜

由于155℃熱壓后的PLA/PEEK復(fù)合材料具有優(yōu)異的拉伸模量和強(qiáng)度，因此通過積分拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線面積可獲得該熱壓溫度下復(fù)合材料的韌性（見圖6）。結(jié)果表明，與單獨(dú)的PLA（0.356 J/m3）或PEEK二維編織物（16.93 J/m3）相比，PLA/PEEK復(fù)合材料的韌性顯著增加（54.27 J/m3）。從圖6中還可以看出，PLA/PEEK復(fù)合材料的斷裂伸長率（400%，見圖6B）分別比PLA（1.5%，見圖6A）和PEEK二維編織物的（168.56%，見圖6C）提高了267倍和1.7倍。與此同時(shí)，PLA/PEEK復(fù)合材料在局部受到應(yīng)力發(fā)生多個(gè)區(qū)域性斷裂時(shí)仍可極大程度地保持其整體結(jié)構(gòu)（見圖7）。

圖6 材料的拉伸應(yīng)力-應(yīng)變曲線：A.PLA；B.PLA/PEEK復(fù)合材料；C.PEEK二維編織物

圖7 PLA/PEEK復(fù)合材料拉伸測試圖

2.3 PLA/PEEK復(fù)合材料的微觀力學(xué)性能

不同熱壓溫度下復(fù)合材料的微觀彈性模量如圖8所示。結(jié)果表明，在50 mN載荷作用下，155°C熱壓后的PLA/PEEK復(fù)合材料的彈性模量可達(dá)到3.5 GPa，遠(yuǎn)高于145°C和165°C熱壓后復(fù)合材料的。此外，155°C熱壓后PLA/PEEK復(fù)合材料的彈性模量隨載荷的增加而下降。對于145°C和165°C熱壓后復(fù)合材料，其彈性模量隨載荷的增加出現(xiàn)了先下降后升高的趨勢。

圖8 PLA/PEEK復(fù)合材料多尺度彈性模量

2.4 SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料的力學(xué)性能

為了提高PLA/PEEK復(fù)合材料的生物活性，將SrCS引入優(yōu)異力學(xué)性能的PLA/PEEK復(fù)合材料中，以獲得SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料。從SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料表面的EDS圖譜（見圖9）中可看出Sr的峰位（2.64keV）且其質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為4.57%，這說明SrCS成功地被摻雜在PLA/PEEK復(fù)合材料中。SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料的超景深圖像如圖10所示，從中可觀察到SrCS相對均勻地分布在復(fù)合材料的表面上（見圖10A）且與PLA/PEEK復(fù)合基體之間不存在縫隙或缺陷（見圖10B），這說明SrCS的引入對PLA/PEEK復(fù)合材料的力學(xué)性能不會產(chǎn)生負(fù)面影響。PLA/PEEK和SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料的力學(xué)性能如圖11所示，結(jié)果顯示，與PLA/PEEK復(fù)合材料相比，SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料的拉伸模量提高了，而拉伸強(qiáng)度降低了。

圖9 SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料表面的EDS圖譜

圖10 SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料的超景深圖片：A.SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料的表面形貌，其中白色顆粒是SrCS；B.SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料的橫切面形貌

圖11 PLA/PEEK和SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料的力學(xué)性能：A.拉伸模量；B.拉伸強(qiáng)度

2.5 L929細(xì)胞在SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料表面上的增殖

PLA/PEEK和SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料薄片與L929細(xì)胞分別共培養(yǎng)1、3、5 d后，利用MTT法檢測細(xì)胞增殖情況。結(jié)果顯示，共培養(yǎng)1、3 d時(shí)，兩組細(xì)胞增殖情況未見明顯差異；而共培養(yǎng)5 d時(shí)，可發(fā)現(xiàn)加入SrCS組可有效促進(jìn)細(xì)胞增殖（見圖12），這表明SrCS具有促進(jìn)L929細(xì)胞增殖的作用。因此，SrCS的引入可提高PLA/PEEK復(fù)合材料的生物活性。

圖12 不同PEEK材料分組與L929共培養(yǎng)細(xì)胞增殖性能測定（MTT法）：**表示與L929細(xì)胞共培養(yǎng)5 d后，PLA/PEEK和SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料各自表面上的細(xì)胞增殖量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（<0.01）

3 討論

松質(zhì)骨多存在于骨骼遠(yuǎn)端，是由大量不規(guī)則排列的骨小梁連接組合而成的多孔網(wǎng)格結(jié)構(gòu)。與軟骨一起協(xié)同吸收和緩沖由外界力學(xué)沖擊帶來的能量，以維持骨骼力學(xué)穩(wěn)態(tài)和保證骨骼系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此，松質(zhì)骨的缺損一方面因?qū)雇饨缌W(xué)沖擊能力減弱使得骨骼穩(wěn)定性下降，另一方面因骨骼力學(xué)穩(wěn)態(tài)的失衡從而加劇了組織局部炎癥反應(yīng)，進(jìn)而誘發(fā)包括骨關(guān)節(jié)炎和血栓等各類并發(fā)癥。尤其是對于大塊松質(zhì)骨缺失而言，由于自體愈合速度差強(qiáng)人意，故需研發(fā)與松質(zhì)骨力學(xué)性能匹配且具有生物活性的植入物，以解決松質(zhì)骨缺損修復(fù)這一臨床問題。

本研究將具有優(yōu)異力學(xué)性能的聚醚醚酮（PEEK）、易加工且可降解的聚乳酸（PLA）和促進(jìn)骨質(zhì)形成的硫酸軟骨素鍶（SrCS）相結(jié)合，利用各自優(yōu)勢以制備出易加工、與松質(zhì)骨力學(xué)性能匹配且兼具生物活性的聚醚醚酮基生物材料，從而為探索一種新型的、無需濃硫酸或高溫條件下的聚醚醚酮表面改性方法提供依據(jù)。通過將溶劑澆鑄和熱壓相結(jié)合的方法成功地復(fù)合了兩種熱力學(xué)性能差異較大的高分子材料（PLA和PEEK），并從3個(gè)方面展示了其力學(xué)仿生性能：①PLA/PEEK復(fù)合材料負(fù)載后的區(qū)域性斷裂行為（見圖6、圖7）與骨骼損傷時(shí)孤立性負(fù)荷行為相似[13]；②PLA/P EEK復(fù)合材料的微觀彈性模量（2.3～3.5 GPa，見圖8）可達(dá)到松質(zhì)骨的彈性模量（2.09～26.6 GPa）下限[14]；③PLA/PEEK復(fù)合材料的多尺度力學(xué)特性，即PLA/PEEK復(fù)合材料（見圖8）的彈性模量隨負(fù)載的增加而降低，這一趨勢與松質(zhì)骨的相似[14]。這些結(jié)果證實(shí)，PLA/PEEK復(fù)合材料不僅在微觀和宏觀層面上都獲得了力學(xué)性能的改善，而且賦予了材料優(yōu)異韌性和多尺度力學(xué)，這將滿足骨移植材料在力學(xué)性能仿生的要求。

在155℃和10 MPa的熱壓條件下，PEEK細(xì)絲與PLA的結(jié)合最為緊密，形成了穩(wěn)定的互鎖結(jié)構(gòu)。這主要是因?yàn)?45℃熱壓條件下熔融的PLA流動性較低，在相同的熱壓條件下不足以覆蓋PEEK纖維的表面。在155℃時(shí)，熔融的PLA能夠充分地填充到二維編織PEEK的孔中。而在165℃熱壓條件下，PLA分子因溫度升高而擁有更高的能量，其粘度降低，流動性增加[15]，使得PLA/PEEK復(fù)合材料表面存在明顯的空隙。因此，PLA和PEEK的復(fù)合效果主要取決于在不同熱壓溫度下PLA的流動性。此外，與145℃和165℃熱壓后的復(fù)合材料相比，155℃熱壓后的PLA/PEEK復(fù)合材料顯示了較高的結(jié)晶度，較優(yōu)的拉伸模量、拉伸強(qiáng)度和微觀彈性模量。這可能是由以下兩個(gè)因素造成的：一是在加熱-緩慢冷卻過程中，PLA分子鏈進(jìn)行了重新排列，使得其結(jié)晶度增加，從而使得PLA的彈性模量顯著提高[16]。二是PLA和PEEK二維編織物之間的互鎖程度。由于165℃熱壓后復(fù)合材料中存在間隙（見圖1C），使得拉伸過程中應(yīng)力集中從而降低了其拉伸性能[17]。Sahoo等[18]已報(bào)道納米壓痕的結(jié)果與材料的致密性密切相關(guān)，且材料的致密性隨溫度而變化。與此同時(shí)，與純PLA和PEEK二維編織物相比，PLA/PEEK復(fù)合材料的韌性和斷裂伸長率顯著提高，并且在局部受到應(yīng)力發(fā)生斷裂時(shí)可保持整體結(jié)構(gòu)。這表明復(fù)合材料在塑性變形和斷裂過程中的能量吸收能力變強(qiáng)，發(fā)生脆性斷裂的可能性變小[19]。這很可能是由于PLA/PEEK復(fù)合材料中的互鎖結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了其抗斷裂性。在拉伸過程中，能量通過每個(gè)互鎖結(jié)構(gòu)分散，小區(qū)域的斷裂不會引起整體材料抗拉失效[20]。PLA/PEEK復(fù)合材料這些優(yōu)異的力學(xué)性能在一定程度上將可滿足高應(yīng)力和塑性變形的植入物要求。由于SrCS粉末與熔融的PLA可以完全混合，因此無需濃硫酸對PEEK進(jìn)行磺化或者高溫（360℃以上）熔融PEEK而獲得SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料。一方面，SrCS的引入提高了復(fù)合材料的拉伸模量，這可能歸因于SrCS顆粒進(jìn)一步填補(bǔ)了PLA和PEEK之間的微小縫隙，從而使PEEK和PLA之間的相互作用得以均勻分散和改善。Ma等[21]指出，SrCS作為增強(qiáng)填料，可以顯著改善絲素蛋白膜的機(jī)械性能。另一方面，SrCS的引入提高了L929細(xì)胞在復(fù)合材料表面上的增殖，改善了PLA/PEEK復(fù)合材料的生物活性。綜上，PLA的填充能有效提高PEEK材料的可加工性，通過機(jī)械互鎖形成的PLA/PEEK復(fù)合材料具有與松質(zhì)骨類似的力學(xué)特性，而SrCS的引入能有效提高其表面生物活性，因此SrCS/PLA/PEEK復(fù)合材料有潛力作為新型的骨科修復(fù)材料。