流體剪切力通過Piezo1調(diào)控MG-63骨肉瘤細(xì)胞的凋亡

馬宏武，馬成華，張宇，李培武

1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急救中心，甘肅蘭州730000；2.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院急診外科，甘肅蘭州730000

前言

骨肉瘤（Osteosarcoma,OS）是最常見的惡性骨腫瘤，發(fā)病人群以兒童和青少年居多，通常表現(xiàn)為長骨干骺端的實(shí)體瘤［1］。盡管OS 的發(fā)生率較低，約為每年每百萬人4.4 例，但它仍是與癌癥相關(guān)兒童死亡的最常見原因之一［2-3］。當(dāng)前的療法包括外科手術(shù)和全身化療，手術(shù)以切除病灶為主，常造成肢體缺損，嚴(yán)重影響患者的心理健康和生活質(zhì)量。盡管化學(xué)療法增加了局部OS 的總體生存率，但生存率仍然較低，約為50%～60%［4］，只有30%的轉(zhuǎn)移性O(shè)S 患者可以實(shí)現(xiàn)長期生存，且因耐藥問題日益突出，在過去30～40年中OS生存率無明顯提升［5］。因此，研究OS發(fā)展的相關(guān)機(jī)制和信號(hào)通路，尋找潛在的分子靶點(diǎn)對(duì)提升OS患者的生存期和生活質(zhì)量至關(guān)重要。

機(jī)械敏感（Mechanosensitive,MS）離子通道是完整的膜蛋白，在活細(xì)胞的機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中起著至關(guān)重要的作用［6］。最近，Coste 等［7-8］發(fā)現(xiàn)了一種新型的MS 陽離子通道，即Piezo1 蛋白，之后又通過同源性序列發(fā)現(xiàn)了Piezo2，這兩種MS 陽離子通道分別由FAM38A 和FAM38B 基因編碼。它們是與細(xì)胞骨架密切相關(guān)的參與機(jī)械信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的陽離子通道蛋白，是進(jìn)化過程中保守離子通道家族的一部分。Piezo1和Piezo2都在空腔器官的組織中廣泛表達(dá)，例如胃、肺、膀胱、腸和血管內(nèi)皮細(xì)胞［9］。MS 離子通道功能異常會(huì)導(dǎo)致多種遺傳疾病的發(fā)生，Piezo1的敲除會(huì)致死小鼠胚胎［10］，其功能獲得性突變會(huì)導(dǎo)致遺傳性干細(xì)胞增多癥［11-12］，而功能喪失性突變會(huì)導(dǎo)致淋巴發(fā)育不良［13-14］。最近的研究發(fā)現(xiàn)Piezo1 在OS 細(xì)胞中高表達(dá)，在給予拉伸應(yīng)力后OS 細(xì)胞的Piezo1 蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，且會(huì)促進(jìn)凋亡蛋白Bax、BAD、caspase 3 和caspase 9 的表達(dá)，提示Piezo1 會(huì)促進(jìn)OS細(xì)胞的凋亡［15］。

流體剪切力（Fluid Shear Stress,FSS）是骨骼組織中常見的機(jī)械應(yīng)力，它可由肌肉收縮擠壓間質(zhì)液流經(jīng)哈弗氏管及骨骼陷窩表面的細(xì)胞而產(chǎn)生［16］。在腫瘤微環(huán)境中OS 細(xì)胞同樣會(huì)受到間質(zhì)液的刺激而產(chǎn)生FSS［17］。最近的研究表明，0.5～12.0 dyn/cm2的FSS可以誘導(dǎo)MG-63 人骨肉瘤細(xì)胞的凋亡［18］。Sagar 也報(bào)道了高FSS（60 dyn/cm2）消除的腫瘤細(xì)胞多于低FSS（15 dyn/cm2），而高FSS 可以在4 h 內(nèi)消除90%以上的腫瘤細(xì)胞，F(xiàn)SS 終止后16～24 h，腫瘤細(xì)胞的凋亡仍持續(xù)［19］?？梢奆SS 會(huì)通過相關(guān)信號(hào)通路調(diào)控OS細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，Piezo1可調(diào)控OS細(xì)胞的凋亡，而作為Piezo1離子通道機(jī)械刺激之一的FSS 也可促進(jìn)OS細(xì)胞凋亡，因此，我們認(rèn)為FSS 可通過上調(diào)OS 細(xì)胞Piezo1 的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)OS 細(xì)胞的凋亡。為了驗(yàn)證這一科學(xué)假設(shè)，我們將給OS 細(xì)胞加載60 min 12 dyn/cm2的FSS，檢測Piezo1 的表達(dá)情況，以及使用Piezo1的抑制劑GsMTx4 進(jìn)而明確FSS 是否可通過Piezo1調(diào)控OS細(xì)胞的凋亡。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：MG-63 人骨肉瘤細(xì)胞購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫。實(shí)驗(yàn)試劑：α-MEM 培養(yǎng)基（Hyclone，美國）、胎牛血清、胰蛋白酶、PBS結(jié)晶粉末（北京中衫金橋，中國）、RIPA 裂解液、PMSF、甘氨酸、十二烷基硫酸納、10% SDS、APS、TEMED、Marker、30%丙烯酰胺、Tris pH=8.8、Tris pH=6.8、BCA 試劑盒、4×上樣緩沖液、PVDF 膜、封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液、10×TBST Beta-actin 一抗（Abcam, 英國）、caspase3 一抗（Abcam, 英國）、caspase9 一抗（Abcam, 英國）、BAD 一抗（Abcam, 英國）、Bax 一抗（Abcam, 英國）、Piezo1 一抗（Abcam, 英國）、山羊抗鼠二抗（Abcam,英國）、山羊抗兔二抗（Abcam,英國）、ECL 化學(xué)發(fā)光液。主要儀器如下：生物安全柜（BIOBASE,中國）、細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo, 美國）、超高速離心機(jī)、磁力攪拌器、顯微鏡、冰箱（海爾, 中國）、制冰機(jī)（雪科,中國）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

將購買的MG-63 細(xì)胞解凍后吸出置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，再加入4 mL 由α-MEM 培養(yǎng)基、10%胎牛血清和青霉素-鏈霉素制成的完全培養(yǎng)基，吹打混勻后放入37 ℃、5%濃度二氧化碳的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3 d 換液一次。待細(xì)胞長滿瓶底90%的區(qū)域時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞傳代與凍存。

1.3 細(xì)胞爬片

在培養(yǎng)皿中不同區(qū)域滴入兩滴培養(yǎng)基后將消毒的蓋玻片放于培養(yǎng)基上（用于固定蓋玻片），將消化好的細(xì)胞懸液向每個(gè)玻片上滴加600 μL（注意不要滴到玻片以外的皿底區(qū)域），平穩(wěn)置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，3 h后待細(xì)胞完全貼于玻片上時(shí)再小心向各玻片上滴加5 mL培養(yǎng)基，再置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，等待加載FSS。

1.4 加載FSS

第一部分實(shí)驗(yàn)分組為Control 組和FSS 組，將兩組細(xì)胞玻片從皿底小心取出置于FSS 加載裝置流體小室中，組裝好管路后，向儲(chǔ)液罐中加入300 mL培養(yǎng)基，設(shè)定FSS 大小為12 dyn/cm2，加載時(shí)長為60 min，啟動(dòng)裝置開始加載FSS。第二部分實(shí)驗(yàn)分組為Control組、FSS 組、GsMTx4 組和FSS+GsMTx4 組，其中GsMTx4 組的細(xì)胞在加載FSS 前使用10 μmmol/L的Piezo1 的抑制劑GsMTx4 處理，F(xiàn)SS+GsMTx4 組的細(xì)胞使用10 μmmol/L 的Piezo1 的抑制劑GsMTx4 處理后加載FSS，F(xiàn)SS 的大小和加載時(shí)間與第一部分相同。

1.5 Western Blot檢測

FSS 加載完畢后，使用預(yù)冷PBS 洗滌玻片3 次，向玻片上加入配制好的裂解液在冰上裂解，用刮刀刮玻片收集裂解液，在12 000 rpm的超高速離心機(jī)中離心20 min 后取上清，標(biāo)記好樣本名和體積后使用BCA 試劑盒測定各組的蛋白濃度以確定上樣量，再加入上樣緩沖液，置于沸水中煮5 min，置于冰箱中備用。配膠、制膠后按照各組蛋白上樣量向孔中加入樣本，電泳結(jié)束后，使用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，電轉(zhuǎn)結(jié)束后封閉液封閉1 h，再使用一抗搖床孵育1 h 后過夜，10×TBST洗滌后二抗孵育1 h，再次洗滌后曝光。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPSS20 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均重復(fù)3 次，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，使用t檢驗(yàn)和單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FSS促進(jìn)MG-63細(xì)胞的凋亡

對(duì)FSS 組的MG-63 細(xì)胞加載60 min 12 dyn/cm2的FSS 后檢測兩組（Control 組和FSS 組）凋亡蛋白caspase3 的表達(dá)情況。Western Blot 檢測結(jié)果見圖1a。如圖1b所示，F(xiàn)SS 組的caspase3蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.001），這說明FSS 可促進(jìn)MG-63細(xì)胞的凋亡。

2.2 FSS促進(jìn)MG-63細(xì)胞Piezo1的表達(dá)

使用Western Blot 檢測兩組Piezo1 的表達(dá)情況，結(jié)果見圖1a。如圖1c 所示，F(xiàn)SS 組Piezo1 的表達(dá)水平較Control 組顯著升高（P＜0.001），提示FSS 可上調(diào)MG-63 細(xì)胞機(jī)械敏感離子通道Piezo1 的表達(dá)，這與FSS調(diào)控caspase3的表達(dá)呈同向變化。

圖1 Western Blot檢測FSS組和Control組的caspase3和Piezo1的表達(dá)情況（***P＜0.001）Fig.1 Expression levels of caspase3 and Piezo1 in FSS group and control group detected by Western Blot(***P＜0.001)

2.3 FSS通過Piezo1促進(jìn)MG-63細(xì)胞的凋亡

為了明確FSS 是否可通過Piezo1 離子通道調(diào)控MG-63 細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)分組分為Control 組、FSS組、GsMTx4 組和FSS+GsMTx4 組，依次給予各組對(duì)應(yīng)的干預(yù)措施后檢測凋亡相關(guān)蛋白caspase3、caspase9、BAD 和Bax 的表達(dá)。Western Blot 結(jié)果見圖2a。如圖2b 所示，F(xiàn)SS 組的caspase3 較Control 組顯著升高（P＜0.001），而FSS+GsMTx4 組的caspase3較FSS 組顯著降低（P＜0.001），這表明FSS 可通過Piezo1 上調(diào)caspase3 的表達(dá)。如圖2c 所示，F(xiàn)SS 組caspase9 的表達(dá)較Control組顯著提高，F(xiàn)SS+GsMTx4組的caspase9較FSS組顯著下降（P＜0.001），說明FSS可通過Piezo1 促進(jìn)MG-63 細(xì)胞caspase9 的表達(dá)。如圖2d 所示，F(xiàn)SS 顯著提高了MG-63 細(xì)胞凋亡蛋白BAD 的表達(dá)（P＜0.001），F(xiàn)SS+GsMTx4 顯著抑制了凋亡蛋白BAD 的表達(dá)（P＜0.001），提示FSS 可通過Piezo1促進(jìn)MG-63細(xì)胞凋亡蛋白BAD的表達(dá)。如圖2e 所示，F(xiàn)SS 組的Bax 表達(dá)水平較Control 組明顯升高（P＜0.001），F(xiàn)SS+GsMTx4 組Bax 表達(dá)水平較FSS組明顯下降，說明FSS是通過上調(diào)Piezo1離子通道的表達(dá)來提高Bax 的表達(dá)水平。綜上所述，F(xiàn)SS 可通過上調(diào)Piezo1 機(jī)械敏感離子通道的表達(dá)來上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)MG-63細(xì)胞的凋亡。

圖2 Western Blot檢測Control組、FSS組、GsMTx4組和FSS+GsMTx4組凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)情況（***P＜0.001）Fig.2 Expression levels of apoptosis-related proteins in control group,FSS group,GsMTx4 group and FSS+GsMTx4 group detected by Western Blot(***P＜0.001)

3 討論

Piezo1 離子通道是一種新型的機(jī)械敏感離子通道，目前的研究大都集中在Piezo1蛋白的結(jié)構(gòu)解析方面。本研究首次闡述了FSS 通過Piezo1 調(diào)控MG-63人骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，實(shí)驗(yàn)過程中，我們使用了Piezo1 的特異性抑制劑GsMTx4，確保在抑制Piezo1離子通道的同時(shí)不影響其他離子通道，相關(guān)蛋白在FSS 組和FSS+GsMTx4 組的表達(dá)差異足以說明FSS是通過Piezo1而非其他離子通道發(fā)揮作用，最終的結(jié)果表明FSS可上調(diào)機(jī)械敏感離子通道Piezo1的表達(dá)，進(jìn)而上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白caspase3、caspase9、BAD 和Bax的表達(dá)，促進(jìn)MG-63細(xì)胞的凋亡。

在腫瘤微環(huán)境中，間質(zhì)液會(huì)流經(jīng)OS 細(xì)胞表面產(chǎn)生FSS，F(xiàn)SS 的機(jī)械信號(hào)會(huì)經(jīng)細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)抵達(dá)相關(guān)效應(yīng)靶點(diǎn)，進(jìn)而引起相應(yīng)的細(xì)胞反應(yīng)［20-22］。FSS 可通過激活ERK5-AKT-FoxO3a 信號(hào)通路下調(diào)FasL 和Bim 的表達(dá)進(jìn)而抑制caspase3 的激活，抑制成骨細(xì)胞的凋亡［16］。FSS不僅與成骨細(xì)胞的凋亡相關(guān)，最新的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)SS 可上調(diào)Hep3B 肝癌細(xì)胞、MG63 骨肉瘤細(xì)胞、SCC25 口腔鱗狀細(xì)胞癌和A549 癌性肺泡基底膜上皮細(xì)胞caspase3、caspase8 和caspase9的表達(dá)并促進(jìn)這些細(xì)胞的凋亡［23-24］。這說明FSS與腫瘤細(xì)胞的凋亡密切相關(guān)，本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)FSS 可促進(jìn)caspase3、caspase9、BAD 和Bax 等凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)MG-63 細(xì)胞的凋亡。有意思的是，Bin等［16］研究提示FSS抑制了caspase3的表達(dá)，這與本研究的結(jié)果截然相反，這可能是細(xì)胞種系、細(xì)胞狀態(tài)和加載的FSS 大小時(shí)間不同所致。最近有研究關(guān)注了FSS 將機(jī)械信號(hào)傳遞至細(xì)胞內(nèi)的機(jī)制，發(fā)現(xiàn)FSS 激活ERK 呈雙相，早期階段不依賴于Ca2+、PI3-K和Rho激酶，但需要RAF活性，而后期卻依賴于Ca2+，不依賴RAF 活性［25］。這說明FSS 作用于細(xì)胞產(chǎn)生特定的細(xì)胞反應(yīng)依賴于Ca2+，而Ca2+是通過相關(guān)離子通道進(jìn)入細(xì)胞的。本研究中我們所關(guān)注的Piezo1 機(jī)械敏感離子通道就是一種陽離子通道，可允許包括Ca2+在內(nèi)的許多陽離子進(jìn)入細(xì)胞，引起膜電位的變化，進(jìn)而引起特定的細(xì)胞反應(yīng)［26-27］。最近，有研究發(fā)現(xiàn)Piezo1 在人OS 細(xì)胞中高表達(dá)，給予拉伸應(yīng)力后Piezo1在MG-63和U2OS細(xì)胞系的表達(dá)水平會(huì)明顯升高，且凋亡相關(guān)蛋白Bax、BAD、caspase3和caspase9的表達(dá)也隨之升高［15］，可見這種拉伸應(yīng)力可增加Piezo1機(jī)械敏感離子通道的數(shù)量，促進(jìn)更多的陽離子進(jìn)入細(xì)胞，引起細(xì)胞的凋亡。本研究加載的外力是OS 微環(huán)境中最常見的FSS，它也是通過增加Piezo1機(jī)械敏感離子通道的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)MG-63 細(xì)胞凋亡的。除了外力不同，我們的研究僅納入了MG-63 這一種細(xì)胞系，而沒有研究U2OS 和143B 等細(xì)胞系，但研究結(jié)論高度一致。這也從側(cè)面證實(shí)了細(xì)胞外應(yīng)力的確可促進(jìn)OS細(xì)胞的凋亡。

本研究揭示了Piezo1 機(jī)械敏感離子通道是一個(gè)治療OS的潛在靶點(diǎn)。臨床中我們無法掌控FSS的大小，也無法通過某種設(shè)備將其應(yīng)用于OS 患者，但是我們可以促進(jìn)肌肉活動(dòng)以上調(diào)OS 細(xì)胞表面Piezo1機(jī)械敏感離子通道的數(shù)量，進(jìn)而促進(jìn)OS 細(xì)胞的凋亡。此外，通過Piezo1這一分子靶點(diǎn)研發(fā)新的藥物可為臨床治療OS提供一種全新的選擇。

本研究首次證實(shí)FSS 可通過Piezo1 機(jī)械敏感離子通道調(diào)控MG-3骨肉瘤細(xì)胞的凋亡。3這一種骨肉瘤細(xì)胞，而沒有納入U(xiǎn)2OS 和143B 等細(xì)胞系，研究結(jié)論的可靠性有待驗(yàn)證。僅使用抑制劑GsMTx4 來阻斷Piezo1 機(jī)械敏感離子通道，而沒有使用小干擾RNA 沉默Piezo1 的表達(dá)，這可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。此外，僅采用Western Blot 這一實(shí)驗(yàn)手段進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測，而沒有采用流式細(xì)胞儀和TUNEL法分析細(xì)胞的凋亡。

綜上所述，F(xiàn)SS 可通過Piezo1 機(jī)械敏感離子通道促進(jìn)MG-63 人骨肉瘤細(xì)胞的凋亡，Piezo1 可能是一種治療骨肉瘤的新型分子靶點(diǎn)。