水稻ptc1隱性核不育系的創(chuàng)制及其配合力分析

李京琳 李佳林 李新鵬 安保光 曾 翔 吳永忠 黃培勁 龍 湍

水稻隱性核不育系的創(chuàng)制及其配合力分析

李京琳 李佳林 李新鵬 安保光 曾 翔 吳永忠 黃培勁 龍 湍*

海南波蓮水稻基因科技有限公司, 海南?？?570203

細(xì)胞質(zhì)雄性不育系和光溫敏雄性不育系是目前雜交水稻育種、制種中廣泛利用的兩種不育系, 然而這兩種不育系分別具有組配不自由和育性不穩(wěn)定的缺陷。隱性核雄性不育系可以克服上述缺陷, 創(chuàng)制、鑒定和利用細(xì)胞核雄性不育系將成為新一代雜交水稻技術(shù)的重要環(huán)節(jié)。本研究通過篩選9311的輻射誘變突變體庫, 獲得了一個無花粉型隱性核雄性不育突變體。圖位克隆發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)位于9號染色體上, 是一段包含編碼區(qū)在內(nèi)259.37 kb的大片段缺失。共分離檢測表明, 雄性不育表型是由突變位點(diǎn)造成的。通過分子標(biāo)記輔助選擇將突變位點(diǎn)回交轉(zhuǎn)育至兩系不育系C815S和三系保持系五豐B中, 在BC3F3世代分別獲得與輪回親本性狀相似的隱性核不育系C815G和五豐G。配合力分析表明, C815G和五豐G分別具有與C815S和三系不育系五豐A基本相同的配合力水平。本研究為隱性核不育系的創(chuàng)制提供了新的基因和材料資源, 并證實(shí)了隱性核不育系代替現(xiàn)有三系和兩系不育系的可行性。

水稻; 雄性不育;; 圖位克隆; 回交轉(zhuǎn)育; 配合力分析

水稻(L.)是最重要的糧食作物之一, 世界上超過1/2的人口以稻米為主食。據(jù)預(yù)計(jì), 到2030年水稻產(chǎn)量必須增加40%才能滿足世界人口增長的需求[1]。中國是稻米最大的生產(chǎn)國和消費(fèi)國, 提高水稻產(chǎn)量是保障我國糧食安全和提高人民生活水平的基石[2]。利用雜種優(yōu)勢是提高水稻產(chǎn)量的有效方法之一[3], 雜交稻可以將水稻單產(chǎn)提高10%～20%[4]。目前, 我國的雜交水稻種植面積常年保持在1.3×108hm2以上。

我國雜交稻技術(shù)研究從1960年代開始, 共經(jīng)歷了3個階段的發(fā)展[5]。第一階段是以胞質(zhì)不育為核心的“三系法”雜交稻技術(shù)。該技術(shù)是基于1970年發(fā)現(xiàn)的“野敗”型細(xì)胞質(zhì)雄性不育, 它的不育性狀是由線粒體基因突變引起, 可以由核恢復(fù)基因()恢復(fù)育性[6-7], 因此可以構(gòu)建一個包含不育系、保持系和恢復(fù)系的“三系”系統(tǒng)來實(shí)現(xiàn)雜交制種。1973年, 我國在東南亞和國際水稻所引進(jìn)的品種中篩選出了優(yōu)良的恢復(fù)系古154、泰引1號、IR24、IR665、桂選7號[8], 標(biāo)志著三系配套的成功[9]。然而由于恢保關(guān)系的限制, 細(xì)胞質(zhì)雄性不育的可利用種質(zhì)資源僅為5%, 親本間遺傳多樣性小, 雜種優(yōu)勢的潛力無法得到充分利用[5]。第二階段是以光溫敏不育系為核心的“兩系法”雜交稻技術(shù)。兩系法是利用其在一定的光溫環(huán)境下植株表現(xiàn)出雄性不育, 而在另一光溫環(huán)境下轉(zhuǎn)變?yōu)檎？捎奶匦詠矸謩e實(shí)現(xiàn)雜交制種和自交繁殖。生產(chǎn)上常用的光溫敏不育系的育性性狀多由、和控制[10]。自1985培育出第一個兩系不育系后, “兩系法”雜交稻目前已占全國雜交水稻播種面積的35%左右, 成為水稻雜種優(yōu)勢利用的重要途徑[11]。“兩系法”較“三系法”具有諸多優(yōu)越性: 其一, 兩系的不育性狀為核基因控制, 不受恢保關(guān)系的限制, 因而選育新品種的幾率更大。其二, 不育系可以一系兩用, 減少育種工序和時間成本, 是快速繁育雜交水稻新品種的新途徑。其三, 兩系不育系有豐富的種質(zhì)資源, 對培育多樣化的雜交稻有極大的促進(jìn)作用[12]。然而, 環(huán)境變化引起的不育系育性轉(zhuǎn)換將極大增加制種失敗的風(fēng)險。第三階段將是以隱性核雄性不育系為核心的“遺傳智能化育種技術(shù)”[13]。隱性核雄性不育的育性由核基因單獨(dú)控制, 不受環(huán)境等外部因素的影響, 育性穩(wěn)定, 可利用的種質(zhì)資源廣, 因此是雜交育種的理想材料。隱性核不育系無法通過常規(guī)方法大量繁殖, 在生產(chǎn)上的應(yīng)用一直受到限制[14]。直到最近, SPT技術(shù)(seed production technology)的出現(xiàn)解決了隱性核不育系的繁殖問題, 使在水稻上大規(guī)模利用隱性核不育系進(jìn)行育種、制種成為可能[15-16]。由于該技術(shù)將現(xiàn)代生物技術(shù)和傳統(tǒng)雜交育種技術(shù)相結(jié)合, 這將是育種史上的一次巨大變革, 可能給水稻產(chǎn)量帶來大幅度的提高。

目前在水稻中已有超過20個隱性核不育基因被克隆[17], 其中調(diào)控從四分體時期到花粉成熟時期小孢子發(fā)育的基因被認(rèn)為是最理想的隱性核不育基因。這一過程中, 絨氈層細(xì)胞起著決定性的作用。水稻中絨氈層的早期發(fā)育受Undeveloped Tapetum1 ()基因調(diào)控[18], 它是一種loop- helx-loop (bHLH)轉(zhuǎn)錄因子, 在突變體中, 絨氈層降解延遲, 導(dǎo)致小孢子敗育。最近發(fā)現(xiàn)另一個bHLH因子TDR, 它是絨氈層程序性死亡(programmed cell death, PCD)的調(diào)控基因, 該基因的突變使絨氈層的PCD啟動延遲, 花粉壁因無法獲得前體物質(zhì)而形成受阻[19-20]。在擬南芥中,的直系同源基因同樣具有調(diào)控絨氈層PCD的功能[21]。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)TDR還能與EAT1互作, 兩者共同調(diào)控PCD的過程。此外, Huang等[23]克隆了一個基因, 它編碼一個679個氨基酸的PHD鋅指蛋白, 是絨氈層PCD的關(guān)鍵基因。PTC1 (OsMS1)蛋白還能夠與OsMADS15和TIP2蛋白互作, 并通過調(diào)控基因的表達(dá), 進(jìn)而調(diào)控絨氈層的PCD過程[24]。在PTC1的缺失突變體植株中, 絨氈層細(xì)胞無限制分裂及增大, 導(dǎo)致絨氈層細(xì)胞降解延遲, 烏氏體形成異常, 花粉壁發(fā)育缺陷,從而引起完全雄性不育。

除了雄性育性性狀外, 雜種優(yōu)勢潛力也是評價一個不育系優(yōu)劣的重要標(biāo)準(zhǔn)。雜種優(yōu)勢是子一代表現(xiàn)出超越雙親平均值或高于任何一親本的現(xiàn)象[25], 而有研究表明光溫敏不育基因就是一個雜種優(yōu)勢的QTL位點(diǎn)[26]。利用隱性核不育基因替換光溫敏不育基因或胞質(zhì)不育基因后, 新不育系是否能保持原不育系的配合力水平, 目前尚無報(bào)道。為了調(diào)查不育基因?qū)Σ挥蹬浜狭Φ挠绊? 本研究首先篩選并鑒定了一個大片段缺失型的新等位突變位點(diǎn), 然后將該突變位點(diǎn)導(dǎo)入優(yōu)良的兩系不育系C815S和三系保持系五豐B中獲得了相應(yīng)的隱性核不育系。對F1表型的分析表明隱性核不育系與相應(yīng)的兩系或三系不育系具有相似水平的配合力。研究結(jié)果顯示了隱性核不育系用于雜交水稻育制種的可行性,的克隆也為隱性核不育系的創(chuàng)制提供了新的基因和材料資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

突變體是通過Co60輻射誘變秈稻9311 (9311)獲得[27]。秈稻品種明恢63和9311用于構(gòu)建和的F2定位群體。兩系不育系C815S和三系保持系五豐B作為輪回親本, 構(gòu)建帶有位點(diǎn)的核不育系。R524、R329、R315、R9773、R9103、R730、華占、R6-7、R809、R5431、R51084、R177、?；?380、福豐1658、岳恢9113等15個材料作為父本, 用于配制雜交種。以上材料由海南波蓮水稻基因科技有限公司從相應(yīng)材料選育單位引進(jìn)。

1.2 突變體篩選和表型鑒定

2013年11月于海南臨高播種9311突變體庫中的M2家系共計(jì)3617份, 在盛花期篩選花藥異常株系, 取其小花在體式顯微鏡下仔細(xì)觀察花的各部分結(jié)構(gòu), 并用碘-碘化鉀溶液(0.6% KI, 0.3% I2)鑒定花粉的育性, 以野生型9311作為對照。對于花粉碘染顯示完全不育的家系, 在田間觀察突變體與野生型的株高、穗長、花期、葉色等農(nóng)藝性狀并照相記錄, 對突變體材料套袋自交, 并與明恢63雜交, 統(tǒng)計(jì)其結(jié)實(shí)情況。

1.3 遺傳和定位分析

2015年10月在海南臨高用9311和明恢63作父本分別與雜交。2016年2月在臨高種植F1并觀察其表型, 分別混收2個組合F1的自交種。2016年7月在臨高種植2個F2群體, 并統(tǒng)計(jì)2個群體中雄性不育株與正常植株的分離情況。使用明恢63/群體的458株F2植株, 根據(jù)Michelmore等[28]的BSA (bulked segregation analysis)法進(jìn)行基因定位。用于檢測分子標(biāo)記的PCR反應(yīng)程序?yàn)? 94℃變性5 min, 95℃變性20 s, 55℃復(fù)性20 s, 72℃延伸30 s, 30個循環(huán), 最后72℃補(bǔ)充延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)6%聚丙烯酰胺變性凝膠電泳, 1% AgNO3染色10 min, 在0.5%甲醛和2% NaOH混合液中顯影后照相讀帶。

1.4 突變位點(diǎn)的克隆與驗(yàn)證

根據(jù)定位結(jié)果, 參考ASM465v1 (http://plants. ensembl.org/Oryza_indica/Info/Index)版本的9311基因組序列, 在連鎖區(qū)段開發(fā)分子標(biāo)記精細(xì)定位突變位點(diǎn)。參照劉耀光等[29]的側(cè)翼序列分離方法分離突變位點(diǎn)序列, 根據(jù)突變位點(diǎn)序列設(shè)計(jì)共分離標(biāo)記, 并用F2定位群體進(jìn)行共分離驗(yàn)證。

用于側(cè)翼序列分離的PCR反應(yīng)分3步進(jìn)行: 第一步, 使用引物對1664sp1_F和1664AC1_R擴(kuò)增突變體基因組DNA, 反應(yīng)程序?yàn)? 93℃預(yù)熱2 min, 95℃變性1 min; 94℃變性30 s, 60℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min, 10個循環(huán); 94℃變性30 s, 20℃復(fù)性2 min, 72℃延伸3 min; 94℃變性20 s, 58℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min, 25個循環(huán); 72℃延伸5 min。第二步, 使用引物對1664sp2_F和1664AD1_R擴(kuò)增第一步產(chǎn)物的40倍稀釋液, 反應(yīng)程序?yàn)? 94℃變性20 s, 65℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min; 94℃變性20 s, 68℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min, 94℃變性20 s, 68℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min, 94℃變性20 s, 50℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min, 13個循環(huán); 72℃延伸5 min。第三步, 使用引物對1664sp3_F和1664AD2_R擴(kuò)增第二步產(chǎn)物的10倍稀釋液, 反應(yīng)程序?yàn)? 94℃變性20 s, 68℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min, 94℃變性20 s, 68℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min, 94℃變性20 s, 50℃復(fù)性1 min, 72℃延伸3 min, 6～7個循環(huán); 72℃補(bǔ)充延伸5 min。

表1 本研究所用的部分引物

(續(xù)表1)

1.5 ptc1-2核不育系的獲得

選用優(yōu)良的兩系不育系C815S、三系保持系五豐B作為母本, 與的雜合株雜交, 用突變體特異的分子標(biāo)記(1664F1、1664R1和1664R2)篩選出突變位點(diǎn)雜合型的F1, 種植F1并連續(xù)回交3次。每次先用突變體特異標(biāo)記和的功能標(biāo)記[30]篩選2位點(diǎn)為雜合型的株系, 再用多態(tài)標(biāo)記篩選回復(fù)率高的株系進(jìn)入下一輪回交。將獲得的BC3F1自交, 用突變體特異標(biāo)記和的功能標(biāo)記篩選BC3F2植株, 其中只含有純合突變位點(diǎn)且不含有位點(diǎn)的單株, 即為相應(yīng)的核不育系, 分別命名為C815G和五豐G。觀察C815G、五豐G、C815S和五豐A的農(nóng)藝性狀, 并照相記錄, 用碘-碘化鉀分析花粉育性情況。調(diào)查植株的株高、抽穗期、穗粒數(shù)、穗長、粒長和粒寬, 參照Griffing等[31]的顯著性分析方法, 分析C815G和C815S, 五豐G和五豐A在這6個農(nóng)藝性狀上的差異。

1.6 雜交種配制

2018年夏在臨高, 以C815G、五豐G、C815S和五豐A為母本, R524、R329、R315、R9773、R9103、R730、華占、R6-7、R809、R5431、R51084、R177、?；?380、福豐1658和岳恢9113為父本, 根據(jù)不完全雙列雜交(North Carolina mating design II, NCII)的方法配制雜交組合。

1.7 配合力分析

2019年春, 將配制的60個雜交組合種植于海南臨高基地(抽穗期間日均溫26～33℃, 日照時長13.1 h)的2個測試點(diǎn), 按隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì), 每點(diǎn)重復(fù)2次。每個組合種植5行, 每行7株, 單株栽植, 株行距為15 cm × 20 cm。在開始抽穗后, 調(diào)查抽穗期; 在黃熟期, 隨機(jī)選取中間3株調(diào)查總分蘗數(shù)、株高、穗長(每株測量5穗)。收取3～5株的種子, 自然干燥后測量粒長、粒寬、穗粒數(shù)、結(jié)實(shí)率、千粒重、單株產(chǎn)量。統(tǒng)計(jì)由同一母本配制的雜交組合在各個農(nóng)藝性狀的平均值, 分析不同母本所配制的雜交組合的表型差異。參考黃遠(yuǎn)樟等[32]的方法分析一般配合力和特殊配合力, 用DPS軟件分析2套NCII組合的配合力情況[33]; 根據(jù)Griffing等[31]的表型變異方差公式:2P=2G+2E估算父母本對組合間表型變異的貢獻(xiàn)率。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體表型

從輻射突變體庫中1664號家系的M2代群體中找到4株雄性不育突變體, 將其命名為。比較與野生型9311的株高、穗長、葉色、抽穗期等農(nóng)藝性狀, 發(fā)現(xiàn)均無顯著差別(圖1-A, B)。解剖小花觀察可見,的花藥明顯變小、變白(圖1-C)。用碘-碘化鉀將花藥染色后在顯微鏡下觀察, 野生型的花粉粒被染成深紫色(圖1-D), 而觀察不到花粉顆粒(圖1-E)。突變體在套袋自交情況下不結(jié)實(shí), 而在作為母本與明恢63和9311雜交時能正常結(jié)實(shí), 說明突變體是雄性完全不育突變體。2018年冬, 在海南陵水鑒定了突變體的溫敏特性, 結(jié)果顯示在低溫下無法恢復(fù)育性, 表明該突變體不受光溫環(huán)境的影響, 為隱性核不育突變體。

2.2 ptc1-2的定位

突變體與野生型9311、明恢63雜交所獲得的所有F1植株正常可育, 而F2群體中可觀察到育性分離。其中/9311的F2群體中不育株與可育株分別為92株、312株,/明恢63的F2群體中不育株與可育株分別為107株、351株。卡方檢測表明, 2個群體中不育株與正常株的比例都符合1∶3的分離比(表2),突變體表型由核隱性單基因控制。

從400對SSR或InDel標(biāo)記中篩選到169對在9311和明恢63之間有多態(tài)的標(biāo)記, 從中選取均勻分布于水稻12條染色體上的129對多態(tài)標(biāo)記分別分析/明恢63群體中突變體和正常株的DNA混合池, 獲得位于9號染色體上的2個與不育表型緊密連鎖的標(biāo)記RM7039、RM257 (圖2-A)。用RM7039和RM257標(biāo)記分別擴(kuò)增50個突變單株, 各檢測到8個和5個交換單株(圖2-B), 進(jìn)一步證實(shí)就定位于這一區(qū)段內(nèi)。然而, 使用位于RM7039和RM257之間的標(biāo)記D9.168擴(kuò)增這50個單株時, 沒有條帶擴(kuò)增出來(圖2-B)。

圖1 ptc1-2突變體及野生型9311的表型

A: 灌漿期野生型9311和突變體的植株; B: 蠟熟期野生型9311和突變體的穗; C: 野生型9311和突變體的花器官; D: 野生型9311的花粉碘染; E:突變體植株的花粉碘染。標(biāo)尺: 15 cm (A); 3 cm (B); 2 mm (C); 150 μm (D)。

A: plants of 9311 andmutant at filling stage; B: panicles of 9311 andmutant at ripening stage; C: floral organs of 9311 andmutant; D: pollen grains of 9311; E: pollen grains ofmutant. Scale bars: 15 cm (A); 3 cm (B); 2 mm (C); 150 μm (D).

圖2 ptc1-2的圖位克隆

A:位點(diǎn)粗定位在9號染色體長臂的RM7039和RM257兩個標(biāo)記間; B:基因精細(xì)定位至D3102和D3676之間, 物理距離為573 bp; C:位點(diǎn)包含從第15,324,556 bp到第15,583,926 bp共259,370 bp缺失, 該缺失片段包含整個基因。

A: thelocus was first mapped to an interval between RM7039 and RM257 on the long arm of chromosome 9; B:was fine mapped to an interval of 573 base pairs between D1380 and D3676; C: thelocus consisted of a 259,370 base-pair deletion from position 15,324,556 base-pair to position 15,583,926 base-pair. The deletion fragment contained the entire coding region of.

表2 ptc1-2突變體的遺傳分析

2.3 突變位點(diǎn)序列克隆及驗(yàn)證

根據(jù)9311基因組序列, 在標(biāo)記D9.168附近開發(fā)了10個新標(biāo)記, 并用50個突變單株分析這些標(biāo)記的擴(kuò)增情況。其中標(biāo)記D27420、D27560、D461、D3102能擴(kuò)增出條帶, 而標(biāo)記D3676、D5146、D27580、D27590、D27650、D27820不能擴(kuò)增出條帶, 推測可能存在一個大片段缺失。標(biāo)記D3102和標(biāo)記D3676之間的物理距離為573 bp (圖2-B)。在標(biāo)記D3102的上游設(shè)計(jì)3條熱不對稱PCR特異引物(表1), 隨機(jī)引物序列參照劉耀光等[29]設(shè)計(jì)。使用熱不對稱PCR經(jīng)過2輪擴(kuò)增后獲得部分較亮的條帶(圖3-A), 條帶經(jīng)測序分析后發(fā)現(xiàn)突變體在9號染色體第15,324,556位堿基到第15,583,926位堿基處存在259,370 bp的堿基缺失。該缺失片段內(nèi)包含19個完整的開放閱讀框(open reading frame, ORF), 其中一個ORF為基因(圖2-C)。故將該突變位點(diǎn)命名為。

根據(jù)缺失序列, 設(shè)計(jì)了一組特異的三引物(1664F1, 1664R1, 1664R2)標(biāo)記(圖2-C)。使用該標(biāo)記對/明恢63的F2分離群體進(jìn)行PCR擴(kuò)增, 結(jié)果顯示所有雄性不育表型的F2植株擴(kuò)增出的產(chǎn)物均為546 bp, 表明發(fā)生了259,370 bp片段的純合缺失。而表型正常的F2植株擴(kuò)增出的產(chǎn)物均為811 bp, 或546 bp和811 bp兩種帶型(圖3-B), 表明不存在259,370 bp片段的缺失或只有一條染色體帶有259,370 bp片段的缺失。這個結(jié)果表明259,370 bp片段的缺失與不育表型共分離。

2.4 ptc1-2核不育系的轉(zhuǎn)育

為了分析隱性核不育基因?qū)﹄s種優(yōu)勢的影響, 本研究以為供體, 通過回交轉(zhuǎn)育的方法將位點(diǎn)導(dǎo)入到C815S和五豐B中, 分別得到的核不育系C815G和五豐G。在C815G和五豐G中,位點(diǎn)被剔除。如圖4所示, C815G與C815S (圖4-A～C), 以及五豐G和五豐A (圖4-F～H)的株高、穗長、葉色、抽穗期、小穗、小花等農(nóng)藝性狀均無明顯差別。統(tǒng)計(jì)分析顯示, C815G和C815S, 五豐G和五豐A在株高、抽穗期、穗粒數(shù)、穗長、粒長和粒寬等性狀上均無顯著差異(表3)。值得注意的是C815S (圖4-D)、C815G (圖4-E)和五豐G (圖4-J)均為無花粉型不育系, 五豐A (圖4-I)為花粉敗育型不育系。用182對多態(tài)標(biāo)記檢測C815G和五豐G的遺傳背景, 回復(fù)率分別達(dá)到了95.4%、96.7%。

圖3 ptc1-2位點(diǎn)側(cè)翼序列的分離及共分離分析

A:位點(diǎn)兩側(cè)基因組序列分離第2輪TAIL-PCR擴(kuò)增結(jié)果; B:突變體的共分離驗(yàn)證。雄性不育表型的F2植株擴(kuò)增出的產(chǎn)物長546 bp, 而表型正常的F2植株擴(kuò)增出的產(chǎn)物長811 bp或同時有546 bp和811 bp兩條帶。M為D2000 marker。

A: the second round of TAIL-PCR results for isolation of genomic sequences flanking thelocus; B: co-segregation analysis of thelocus with the male sterile phenotype. All PCR products of F2sterile plants were 546 bp in length. The size of PCR products of F2fertile plants was either 811 bp, or 546 bp, and 811 bp. M: DNA 2000 bp marker.

2.5 核不育系的配合力分析

為了分析轉(zhuǎn)育后不育系的配合力是否發(fā)生了改變, 用C815G、C815S、及五豐G和五豐A分別作為母本與15個測試父本, 按照NCII設(shè)計(jì)進(jìn)行配組, 獲得2套NCII組合。對這2個NCII群體進(jìn)行10個農(nóng)藝性狀的表型考察及配合力分析, 結(jié)果顯示, 除株高外, 2對母本配制的雜交組合間表型沒有顯著差異(表4)。但值得注意的是, 個別父本配制的雜交組合結(jié)實(shí)率有較大提高, 例如, 五豐A/R9773的結(jié)實(shí)率只有63.5%, 而五豐G/R9773的結(jié)實(shí)率卻提高到92.9%。

圖4 C815G和五豐G的表型

A: 抽穗期C815S和C815G的植株; B: C815S和C815G的小穗; C: C815S和C815G花器官; D: C815S的花粉碘染; E: C815G的花粉碘染; F: 抽穗期五豐A和五豐G的植株; G: 五豐A和五豐G的小穗; H: 五豐A和五豐G花器官; I: 五豐A的花粉碘染; J: 五豐G的花粉碘染。標(biāo)尺: 10 cm (A, F); 0.5 cm (B, C, G, H); 200 μm (D, E, I, J)。

A: phenotypes of C815S and C815G plants at heading stage; B: spikelets of C815S and C815G; C: floral organs of C815S and C815G; D: pollen grains of C815S; E: pollen grains of C815G; F: phenotypes of Wufeng A and Wufeng G plants at heading stage; G: spikelets of Wufeng A and Wufeng G; H: floral organs of Wufeng A and Wufeng G; I: pollen grains of Wufeng A; J: pollen grains of Wufeng G. Scale bars: 10 cm (A, F); 0.5 cm (B, C, G, H); 200 μm (D, E, I, J).

表3 C815S、C815G、五豐A和五豐G的農(nóng)藝性狀分析

方差分析結(jié)果如表5和表6。除株高性狀以外, 母本間的差異對雜交組合其他9個性狀的影響并不顯著(>0.05), 說明C815G和五豐G分別與不育系C815S和五豐A基本不存在差異。同時根據(jù)NCII的方差分析, 本研究估算了父母本的表型貢獻(xiàn)率, 發(fā)現(xiàn)無論是在以C815S和C815G為母本配制的組合中, 還是在以五豐A和五豐G為母本配制的組合中, 株高表型變異的主要提供者是父本, 分別為43.67%和21.32%, 而母本材料對株高表型的變異貢獻(xiàn)僅占4.68%和11.80%。說明盡管母本間的差異顯著影響配組材料間的株高表型, 但其在決定表型變異程度上依然很小。綜上, NCII的方差分析說明, 利用進(jìn)行育性改良并未明顯改變原有不育系的性狀。

表4 C815G和五豐G配制的雜交組合的表型

*表示差異達(dá)到0.05顯著水平; C815S/+、C815G/+、五豐A/+和五豐G/+分別表示C815S、C815G、五豐A、五豐G配制的雜交組合。

*indicates significant differences at the 0.05 probability levels; C815S/+, C815G/+, Wufeng A/+, and Wufeng G/+ indicate the hybrids of C815S, C815G, Wufeng A, and Wufeng G, respectively.

表5 C815S和C815G的田間配合力方差分析

**、*分別表示差異達(dá)到0.01和0.05顯著水平。

**and*indicate significant differences at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

表6 五豐A和五豐G的田間配合力方差分析

**和*分別表示差異達(dá)到0.01和0.05顯著水平。

**and*indicate significant differences at the 0.01 and 0.05 probability levels, respectively.

此外, 本研究計(jì)算了C815S與C815G, 五豐A與五豐G的一般配合力相對效應(yīng)值, 如表7所示。C815S與C815G、五豐A與五豐G的一般配合力相對效應(yīng)值在所有性狀上差異都不大。上述結(jié)果表明, 母本的一般配合力相似。

3 討論

利用圖位克隆的方法, 本研究從9311輻射誘變突變體中克隆了一個新的突變位點(diǎn)。該突變位點(diǎn)是一個259.37 kb的大片段缺失, 包括在內(nèi)的19個ORF均位于該缺失區(qū)段內(nèi)。前人的報(bào)道中,編碼一個PHD鋅指蛋白, 參與花粉外壁的形成和絨氈層的發(fā)育。突變后造成水稻雄性不育, 但對其他農(nóng)藝性狀沒有明顯影響[22]。因此推測的雄性不育表型是由缺失造成。除外, 另外18個基因的缺失并未造成明顯突變表型, 表明這些基因可能為水稻的非必需基因。Wang等[34]分析3010份水稻品種重測序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn), 有37.9%的基因?yàn)榉潜匦杌? 這些基因通常會在不同個體中出現(xiàn)或缺失, 但不影響個體的生長發(fā)育。因此,的大片段缺失可能并不影響其在生產(chǎn)上應(yīng)用。

配合力是衡量一個材料是否具有雜種優(yōu)勢的重要指標(biāo), 它的測定方法包括雙列雜交法、頂交法和多系測交法, 其中不完全雙列雜交法(NCII)是不育系配合力測定的有效方法[35]。為了探究核不育系對雜種優(yōu)勢的影響, 本研究設(shè)計(jì)了2組NCII交配試驗(yàn), 分別分析了C815G與C815S, 五豐G與五豐A的配合力情況。2組結(jié)果均顯示除株高1個性狀外, 其它9個性狀在母本間的差異均不顯著, 表明不育系改良前后配合力水平相似。為了確定雜交組合中株高差異的主要來源, 本研究估算了2組群體中父母本對株高變異的貢獻(xiàn)率, 結(jié)果顯示母本材料對株高表型的變異貢獻(xiàn)僅占4.68%和11.80%, 而父本貢獻(xiàn)率達(dá)到43.67%和21.32%, 表明組合間的顯著差異主要來源于父本。本研究使用了15個不同來源的恢復(fù)系作為測試親本, 其遺傳基礎(chǔ)廣泛, 更能有效降低與被測親本間的互作效應(yīng), 從而提高配合力測定水平[36]。

表7 田間一般配合力相對效應(yīng)值

目前雜交水稻生產(chǎn)中常用的三系和兩系不育系都有缺陷, 如育性不穩(wěn)定, 可利用種質(zhì)資源狹小, 制種成本高等。發(fā)展新的育種、制種技術(shù)成為雜交水稻產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求[37]。隱性核不育系具有恢復(fù)基因廣泛存在, 育性穩(wěn)定等特點(diǎn), 可以很好的克服三系和兩系不育系的缺點(diǎn)[14-15]。在本研究中五豐G與五豐A配制的雜交組合的平均結(jié)實(shí)率雖然沒有顯著差異, 但個別組合如五豐G/R9773的結(jié)實(shí)率比五豐A/R9773的結(jié)實(shí)率提高了近30%。一個可能的解釋是使用位點(diǎn)替換三系不育系的核質(zhì)互作不育系統(tǒng)后, 解除了恢復(fù)系和不育系的恢保關(guān)系限制, 從而提高了F1代的結(jié)實(shí)率。但考慮到五豐G的轉(zhuǎn)育過程, 五豐G遺傳背景中不可避免的會帶有少量9311的遺傳背景, 因此也不能完全排除少量9311遺傳背景的導(dǎo)入對結(jié)實(shí)率產(chǎn)生了影響。鮑海瀅等[38]利用100個AFLP標(biāo)記分析3個中國春小麥的BC9近等基因系, 發(fā)現(xiàn)它們?nèi)杂屑s0.22%的背景差異, 表明遺傳差異仍然會存在于表型十分相似的植株里。使用更多的三系恢復(fù)系與五豐G和五豐A配組進(jìn)行結(jié)實(shí)率分析, 將進(jìn)一步驗(yàn)證隱性核不育系在大幅增加恢復(fù)基因來源和提高種質(zhì)資源利用率方面的優(yōu)勢。此外, 五豐G為無花粉型不育, 比碘敗型的五豐A不育更徹底, 同時育性也不受光溫環(huán)境的影響, 顯示出隱性核不育系在雜交稻制種安全性方面的優(yōu)勢。

4 結(jié)論

本研究利用圖位克隆的方法從一個秈稻9311輻射誘變突變體中鑒定了一個新的等位突變位點(diǎn)。位點(diǎn)控制雄性不育表型, 不育性狀不受光溫環(huán)境影響, 也不影響水稻其他農(nóng)藝性狀。利用位點(diǎn)創(chuàng)制的隱性核不育系C815G和五豐G保持了相應(yīng)三系和兩系不育系的配合力, 顯示了核不育系具有與兩系和三系不育系相當(dāng)?shù)碾s種優(yōu)勢潛力。本研究為核不育系的利用提供了理論依據(jù), 也提供了新的基因和材料資源。

致謝:中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所孫亮副研究員給予本文細(xì)致的修改, 謹(jǐn)此致謝。

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Creation and combining ability analysis of recessive genic sterile lines with a newlocus in rice

LI Jing-Lin, LI Jia-Lin, LI Xin-Peng, AN Bao-Guang, ZENG Xiang, WU Yong-Zhong, HUANG Pei-Jing, and LONG Tuan*

Hainan Bolian Rice Gene Technology Co., Ltd., Haikou 570203, Hainan, China

Cytoplasmic male sterile (CMS) lines and photoperiod/thermo-sensitive genic male sterile (PTGMS) lines are widely used as female parents in the commercial production of rice hybrid seeds. however, both systems have their intrinsic defects such as low usage of germplasm resources and unstable sterility. Recessive genic male sterile (GMS) lines, which overcome the pro-blems of CMS and PTGMS lines, have played a key role in the development of next generation technologies for rice hybrid seed production. In this study, a GMS mutantwithout pollen grains was identified from an irradiation-induced mutant library of 9311. Using a map-based cloning approach, a 257.37 kb deletion region was detected, which contained entire coding region ofon chromosome 9. PCR co-segregation analysis showed that the male sterility was completely associated with thedeletion region. Thedeletion locus was then introgressed into a PTGMS line C815S and a CMS maintainer line Wufeng B by marker-assisted backcrossing. Corresponding GMS lines C815G and Wufeng G were obtained at BC3F3generation, which showed the phenotypical similarity to the C815S and Wufeng B lines, respectively. Combining ability tests revealed that C815G and Wufeng G had the same combining ability as C815S and the CMS line Wufeng A in conventional field, respectively. These results indicated thatwas a new allele of, which could be applied for breeding GMS linesand be the potential of GMS lines in rice hybrid seed production.

rice; male sterile;; map-based cloning; backcrossing; combining ability test

10.3724/SP.J.1006.2021.02076

本研究由中國水稻研究所水稻生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題項(xiàng)目(20190203)資助。

This study was supported by the Open Project of State Key Laboratory of Rice Biology Foundation of China Rice Research Institute (20190203).

龍湍, E-mail: longtuan2001@aliyun.com, Tel: 0898-66184571

E-mail: 250864463@qq.com

2020-11-15;

2021-03-19;

2021-04-06.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210406.1628.004.html