小麥多酚氧化酶基因Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)等位變異與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系

黃義文 代旭冉 劉宏偉 楊 麗 買春艷 于立強(qiáng) 于廣軍 張宏軍,* 李洪杰,* 周 陽,*

小麥多酚氧化酶基因和位點(diǎn)等位變異與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系

黃義文1代旭冉1劉宏偉1楊 麗1買春艷2于立強(qiáng)3于廣軍3張宏軍1,*李洪杰1,*周 陽1,*

1中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所 / 作物分子育種國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室, 北京 100081;2新鄉(xiāng)縣矮敗小麥育種技術(shù)創(chuàng)新中心, 河南新鄉(xiāng) 453731;3石家莊市農(nóng)林科學(xué)研究院趙縣實(shí)驗(yàn)基地, 河北趙縣 051530

和是控制小麥多酚氧化酶(polyphenol oxidase, PPO)活性的關(guān)鍵基因。有報(bào)道PPO活性與穗發(fā)芽抗性有關(guān), 但和位點(diǎn)不同等位變異對(duì)穗發(fā)芽抗性的影響尚不明確。本研究利用248份我國(guó)主栽小麥品種3年發(fā)芽指數(shù), 結(jié)合和位點(diǎn)等位變異分型結(jié)果, 研究?jī)蓚€(gè)位點(diǎn)不同等位變異及其等位變異組合與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系。結(jié)果表明, 發(fā)芽指數(shù)主要受年份、位點(diǎn)和×互作共同影響。在位點(diǎn), 攜帶低PPO活性等位變異的小麥品種發(fā)芽指數(shù)顯著低于攜帶高PPO活性等位變異的品種, 平均發(fā)芽指數(shù)相差5.22%; 相反, 在位點(diǎn)攜帶低PPO活性等位變異品種的發(fā)芽指數(shù)高于攜帶高PPO活性等位變異的品種, 但差異不顯著。在4種等位變異組合中,組合類型品種的發(fā)芽指數(shù)最低。上述位點(diǎn)等位變異與穗發(fā)芽抗性的關(guān)系在輪選13 × 濟(jì)麥20 F2及F2:3分離群體中得到驗(yàn)證。PPO活性和相對(duì)表達(dá)量均與發(fā)芽指數(shù)呈顯著正相關(guān)。本研究表明,等位變異的分子標(biāo)記可以有效地用于穗發(fā)芽抗性輔助選擇。

小麥; 抗穗發(fā)芽育種; 多酚氧化酶;等位變異; 分子標(biāo)記輔助選擇

中國(guó)是世界上最大的小麥生產(chǎn)國(guó), 約占全球總產(chǎn)量的17%[1]。穗發(fā)芽是限制小麥產(chǎn)量和品質(zhì)的重要自然災(zāi)害之一, 在小麥主產(chǎn)國(guó)頻繁發(fā)生[2]。穗發(fā)芽可導(dǎo)致小麥價(jià)格降低20%～50%, 全球每年因穗發(fā)芽損失高達(dá)10億美元[3]。我國(guó)83%的小麥種植地區(qū)受到不同程度的穗發(fā)芽影響[4]。近年來, 收獲期間的極端天氣導(dǎo)致穗發(fā)芽頻發(fā), 例如2013、2015和2016年小麥主產(chǎn)區(qū)黃淮冬麥區(qū)和長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)穗發(fā)芽大面積發(fā)生, 對(duì)小麥生產(chǎn)造成嚴(yán)重影響[5]。因此, 提高品種的穗發(fā)芽抗性成為我國(guó)小麥主產(chǎn)區(qū)的重要育種目標(biāo)。

小麥穗發(fā)芽抗性是由多基因控制的復(fù)雜數(shù)量性狀[6-7], 受環(huán)境因素影響大, 分子標(biāo)記輔助選擇能夠提高小麥抗穗發(fā)芽育種的選擇效率。目前, 已經(jīng)定位了42個(gè)與穗發(fā)芽抗性相關(guān)的QTL[3,8]。其中, 位于第二、三部分同源群染色體和4A染色體上的6個(gè)穗發(fā)芽抗性基因[9]、[10]、[11]、[12]、[13]和[14]已經(jīng)被克隆并開發(fā)出相應(yīng)的功能標(biāo)記。Lin等[15]利用含有和抗性等位變異的小麥品種Tutoumai分別與AUS1408和NW97S186雜交并回交構(gòu)建BC2F2:3群體, 發(fā)現(xiàn)基因在不同的環(huán)境下能夠降低發(fā)芽率8.3%～29.0%;基因可降低發(fā)芽率6.7%～27.6%; 2個(gè)基因的聚合體可使發(fā)芽率降低9.0%～49.2%。

多酚物質(zhì)的減少或缺失導(dǎo)致無原花色素大麥突變體休眠期縮短、吸水性增強(qiáng), 從而加重穗發(fā)芽發(fā)生[16]。在小黑麥休眠種子中酚類物質(zhì)含量較高, 而在發(fā)芽的種子中明顯較低, 表明酚類物質(zhì)能夠抑制穗發(fā)芽的發(fā)生[17]。此外, 在甜櫻桃[18]、苜蓿[19]和藏紅花[20]等植物上也證實(shí)穗發(fā)芽抗性與酚類物質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)。小麥PPO可以催化酚類的羥基轉(zhuǎn)化為醌或者催化多酚類變?yōu)檠趸玔21]。醌類物質(zhì)因其較強(qiáng)的電化學(xué)性質(zhì)而發(fā)生的自動(dòng)氧化反應(yīng), 是導(dǎo)致小麥面粉食品加工儲(chǔ)藏過程中發(fā)生褐變的主要原因[22]。有研究發(fā)現(xiàn)PPO活性與小麥穗發(fā)芽抗性有關(guān), 并提出PPO活性可作為穗發(fā)芽抗性篩選的指標(biāo)[23-24],但這需要更多品種和遺傳群體驗(yàn)證, 加之PPO活性的測(cè)定耗時(shí)耗力, 因而這個(gè)指標(biāo)難于用于育種后代規(guī)?；x擇。

控制小麥PPO活性基因主要包括位于2AL和2DL染色體上的和[25-26]?；騼?nèi)含子191 bp的插入缺失(InDel)與PPO活性密切相關(guān), STS標(biāo)記PPO18可用來檢測(cè)高、低PPO活性等位變異和[25]。針對(duì)基因開發(fā)的一對(duì)顯性互補(bǔ)STS標(biāo)記PPO29和PPO16, 可分別檢測(cè)高、低PPO活性等位變異和[26]。這3個(gè)功能標(biāo)記可用于和位點(diǎn)不同PPO活性等位變異的檢測(cè)。本研究的目的是闡明這2個(gè)位點(diǎn)不同等位變異與穗發(fā)芽抗性關(guān)系, 為開展育種后代穗發(fā)芽抗性的分子標(biāo)記輔助選擇提供理論和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為248份1971—2020年小麥主栽品種, 其中包括北部麥區(qū)品種13份、黃淮冬麥區(qū)品種204份、長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)品種17份和西南冬麥區(qū)品種14份。利用穗發(fā)芽敏感品種輪選13 (基因型)做為母本, 抗穗發(fā)芽品種濟(jì)麥20(基因型)做為父本, 構(gòu)建輪選13 × 濟(jì)麥20 F2和F2:3群體, 共計(jì)266個(gè)家系, 用于驗(yàn)證位點(diǎn)不同等位變異與穗發(fā)芽抗性關(guān)系。

1.2 田間試驗(yàn)

2017—2018年、2018—2019年和2019—2020年小麥生長(zhǎng)季, 在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所新鄉(xiāng)試驗(yàn)站(35°31′N, 113°85′E)開展田間試驗(yàn)。小麥主栽品種和輪選13 × 濟(jì)麥20群體F2:3家系每個(gè)材料種植1行, 行長(zhǎng)2 m, 行距20 cm, 株距5 cm; 輪選13 × 濟(jì)麥20群體F2單株種植采用2 m行長(zhǎng), 行距20 cm, 株距10 cm。播種前, 施用復(fù)合肥折合純N 200 kg hm–2, P2O5191 kg hm–2和K2O 41 kg hm–2[27]。其他田間管理按照當(dāng)?shù)卮筇锷a(chǎn)管理進(jìn)行。

1.3 穗發(fā)芽抗性表型評(píng)價(jià)

2018、2019和2020年連續(xù)3年對(duì)主栽小麥品種穗發(fā)芽抗性進(jìn)行表型鑒定。采用籽粒發(fā)芽指數(shù)法鑒定穗發(fā)芽抗性, 發(fā)芽指數(shù)越高, 穗發(fā)芽抗性越差[28]。在生理成熟期(開花后約35 d, 穗莖變黃), 每個(gè)材料收獲30個(gè)穗子。室溫(25℃)自然風(fēng)干4 d, 手工脫粒后放入–20℃冰柜中保存, 統(tǒng)一進(jìn)行表型評(píng)價(jià)。發(fā)芽指數(shù)鑒定設(shè)3次重復(fù), 每次重復(fù)50粒種子。種子用5%的NaClO消毒15 min, 蒸餾水沖洗3次。在無菌培養(yǎng)皿中墊上兩張滅菌濾紙并加入適量的蒸餾水, 將消毒后的種子擺放在培養(yǎng)皿中, 種子腹溝朝下。在25℃的條件下培養(yǎng)7 d。每天統(tǒng)計(jì)發(fā)芽數(shù), 并挑出發(fā)芽的種子。發(fā)芽指數(shù)(germination index, GI)計(jì)算公式如下: GI (%) = [(7×1+6×2+5×3+4×4+ 3×5+ 2×6+7)/7×]×100%, 其中1、2、3……7分別代表第1、2、3……7 d的發(fā)芽數(shù),為總粒數(shù)[9]。2019年和2020年, 采用相同方法對(duì)輪選13 × 濟(jì)麥20群體F2和F2:3代進(jìn)行穗發(fā)芽抗性鑒定, 3次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。在生理成熟期, F2代分單株收獲、脫粒、風(fēng)干后進(jìn)行表型鑒定; F2:3代每個(gè)家系隨機(jī)取20個(gè)穗子混脫, 風(fēng)干后進(jìn)行穗發(fā)芽抗性評(píng)價(jià)。

1.4 PPO活性基因不同等位變異分子檢測(cè)

主栽品種每個(gè)材料取10粒種子放在培養(yǎng)皿中, 取室溫生長(zhǎng)5日齡葉片, 利用DNA快速提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司, 北京)提取小麥基因組DNA。在分蘗期, 輪選13 × 濟(jì)麥20群體F2代分單株掛牌取葉片進(jìn)行DNA提取。F2:3代家系分系取穗進(jìn)行穗發(fā)芽抗性鑒定, 其基因型直接用對(duì)應(yīng)的F2單株基因型代替。利用PPO18、PPO16和PPO29引物檢測(cè)和位點(diǎn)不同等位變異, 擴(kuò)增片段大小和退火溫度見表1。PCR擴(kuò)增在賽默飛世爾SimpliAmpPCR儀(ThermoFisher Scientific, USA)上進(jìn)行, 反應(yīng)體系為10 μL, 包括1 μL DNA模板(50～100 ng μL–1), 5 μL 2×PCR Master Mix, 正反引物各1 μL (10 μmol L–1)和2 μL ddH2O。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min, 94℃變性30 s, 60℃退火30 s, 72℃延伸1 min, 35個(gè)循環(huán), 72℃后延伸10 min。利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物, GeneFinder (Bio-V, 中國(guó)福建)染色后用Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)掃描, 分析基因型。

表1 Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)不同等位變異檢測(cè)的功能標(biāo)記信息

1.5 籽粒PPO活性測(cè)定

根據(jù)和位點(diǎn)等位變異四種組合類型, 每種組合選擇10個(gè)品種進(jìn)行PPO活性測(cè)定, 共計(jì)40個(gè)品種。同時(shí), 根據(jù)位點(diǎn)等位變異差異, 在輪選13 × 濟(jì)麥20 F2:3群體中各選取20個(gè)株系進(jìn)行PPO活性測(cè)定。兩次實(shí)驗(yàn)重復(fù)。小麥籽粒PPO活性測(cè)定參照Anderson和Morris[29]的方法。每個(gè)材料挑選15粒飽滿、無病、大小均勻一致的成熟種子用蒸餾水清洗2次, 拭去表面水分, 稱重后置于50 mL離心管中, 然后加入配好的L-DOPA/ MOPS反應(yīng)緩沖液(50 mmol L–1的MOPS緩沖液, pH 6.5; 10 mmol L–1L-DOPA溶液, 吐溫20) 4.5 mL; 在振蕩器上振蕩30 min, 結(jié)束后立即放至冰上結(jié)束反應(yīng)。以L-DOPA/MOPS反應(yīng)緩沖液作為空白對(duì)照, 利用SPECORD 200紫外可見分光光度計(jì)(Analytik Jena AG, Jena, Germany)測(cè)定475 nm的吸光值A(chǔ)。PPO活性公式如下: PPO酶活值(A475nmmin–1g–1× 103)= A/(30 min × 15粒種子克數(shù)) × 103。

1.6 RNA提取及qRT-PCR分析

用于PPO活性測(cè)定的材料同時(shí)用于和基因的qRT-PCR分析。籽?？俁NA提取及純化采用種子果實(shí)RNA提取試劑盒(北京金百特生物技術(shù)有限公司, 北京)。利用HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司, 北京)進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄, 反應(yīng)體系為20 μL, 包括 4 μL dNTPs Mix, 2 μL Primer Mix, 2 μL RNA模板(200～300 ng μL?1), 4 μL 5 × RT buffer, 2 μL (0.1 mol L?1) DTT, 1 μL (200 U μL?1) HiFi-MMLV和7 μL RNAase-free H2O。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)程序?yàn)?2℃孵育30～50 min, 85℃孵育5 min, 反應(yīng)結(jié)束后, 置于冰上冷卻。qRT-qPCR擴(kuò)增在CFX Touch實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Bio-Rad, Hercules, USA)上進(jìn)行, 反應(yīng)體系為20 μL, 包括10 μL 2 × Universal SYBR Green Fast qPCR Mix (武漢愛博泰克生物科技有限公司, 湖北武漢), 4 μL cDNA模板(25 ng μL?1), 正反向引物各0.4 μL (10 μmol L?1), 5.2 μL Nuclease-free H2O。引物序列見表2。反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性3 min, 95℃變性5 s, 60℃延伸30 s, 40個(gè)循環(huán)?；蜃鳛閮?nèi)參基因, 采用2?ΔΔCT方法[30]計(jì)算和基因相對(duì)表達(dá)量。設(shè)置3次重復(fù)。

表2 qRT-PCR分析引物

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

利用Microsoft Excel 2019數(shù)據(jù)分析工具對(duì)發(fā)芽指數(shù)表型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。利用SAS v9.2軟件(SAS Institute, Cary, NC, USA)進(jìn)行方差分析和相關(guān)分析。通過SPSS16.0軟件(International Business Machines Corporation, Armonk, New York, USA)對(duì)和位點(diǎn)不同等位變異間發(fā)芽指數(shù)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)和不同等位變異組合發(fā)芽指數(shù)、PPO活性以及基因相對(duì)表達(dá)量多重比較分析(LSD法)。采用下列公式計(jì)算廣義遺傳力(2):2=2g/(2g+2gy/+2ε/), 其中,2g、2gy、2ε、和分別表示基因型、基因型× 年份間互作、重復(fù)和年份[31]。

2 結(jié)果與分析

2.1 穗發(fā)芽抗性表型分析

248份小麥品種3年發(fā)芽指數(shù)方差分析發(fā)現(xiàn), 基因型、年份及基因型與年份間互作均方顯著(< 0.01), 表明發(fā)芽指數(shù)受三者共同影響(表3)。發(fā)芽指數(shù)廣義遺傳率為0.95。年份間供試品種發(fā)芽指數(shù)呈極顯著正相關(guān), 相關(guān)系數(shù)為0.69～0.80 (< 0.01) (圖1)。由表4可見, 小麥品種間發(fā)芽指數(shù)差異顯著。供試品種3年平均發(fā)芽指數(shù)為46.70%, 變幅為11.55%～88.70%, 變異系數(shù)為36.41%。不同年份間發(fā)芽指數(shù)存在差異。2019年平均發(fā)芽指數(shù)最高為58.39%, 變幅為17.14%～92.19%, 變異系數(shù)為30.10%; 2020年平均發(fā)芽指數(shù)最低為34.21%, 變幅為2.95%～88.71%, 變異系數(shù)為55.59%。不同種皮顏色品種間發(fā)芽指數(shù)同樣存在顯著差異, 紅粒品種發(fā)芽指數(shù)(36.15%)明顯低于白粒品種(48.19%)。發(fā)芽指數(shù)較低的白粒品種有洛旱11 (13.84%)、豐產(chǎn)3號(hào)(16.38%)和百農(nóng)3217 (16.96%), 紅粒品種有揚(yáng)麥20 (11.56%)、揚(yáng)麥15 (14.53%)和揚(yáng)麥16 (15.68%)。

親本輪選13平均發(fā)芽指數(shù)(81.68%)顯著高于濟(jì)麥20 (28.68%) (< 0.05) (圖2)。2019年輪選13 × 濟(jì)麥20群體F2平均發(fā)芽指數(shù)為59.49%, 變幅為18.10%～90.76%, 變異系數(shù)為27.88%; 2020年F2:3平均發(fā)芽指數(shù)為46.94%, 變幅為19.14%～79.53%, 變異系數(shù)為28.18%。

表3 2018–2020年248份小麥品種發(fā)芽指數(shù)方差分析

**表示在< 0.01水平下差異顯著。**Significance at< 0.01.

圖1 小麥品種年份間發(fā)芽指數(shù)相關(guān)分析

**表示在< 0.01水平下差異顯著。**Significance at< 0.01.

表4 248份小麥品種和輪選13 ×濟(jì)麥20群體平均發(fā)芽指數(shù)、標(biāo)準(zhǔn)差、變幅和變異系數(shù)

圖2 親本輪選13 (A)和濟(jì)麥20 (B)穗發(fā)芽抗性比較(發(fā)芽3 d)

2.2 Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)不同等位變異檢測(cè)

利用PPO18、PPO16和PPO29標(biāo)記檢測(cè)248份小麥品種和位點(diǎn)的不同等位變異。在位點(diǎn), PPO18標(biāo)記在洛旱7號(hào)、新麥20和淮麥20等113份小麥品種中擴(kuò)增出685 bp片段, 表明這些品種攜帶高PPO活性等位變異; 京411、山農(nóng)20和石4185等135份小麥品種中擴(kuò)增出876 bp片段, 表明這些品種攜帶低PPO活性等位變異(圖3-A)。在位點(diǎn), PPO16標(biāo)記在石麥12、山農(nóng)20和新麥20等129份小麥品種中擴(kuò)增出713 bp片段, 表明這些品種攜帶低PPO活性等位變異; PPO29標(biāo)記在京411、洛旱7號(hào)和石4185等119份小麥品種中擴(kuò)增出490 bp片段, 表明這些品種攜帶高PPO活性等位變異(圖3-B)。所有供試品種在2個(gè)位點(diǎn)沒有發(fā)現(xiàn)雜合基因型。

2.3 Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)不同等位變異與穗發(fā)芽抗性關(guān)系

248份小麥品種和位點(diǎn)3年發(fā)芽指數(shù)方差分析發(fā)現(xiàn), 發(fā)芽指數(shù)受年份、位點(diǎn)以及×互作共同影響(表5)。在位點(diǎn), 攜帶等位變異品種(135份)發(fā)芽指數(shù)顯著低于攜帶等位變異品種(113份) (< 0.01)。2018年、2019年和2020年,品種比品種發(fā)芽指數(shù)分別降低3.90%、6.33%和5.43%, 3年平均降低5.22% (圖4-A)。相反, 在位點(diǎn)攜帶低多酚氧化酶等位變異品種(129份)一致表現(xiàn)比攜帶高多酚氧化酶等位變異品種(119份)更高的發(fā)芽指數(shù), 但兩種等位變異品種間發(fā)芽指數(shù)差異不顯著。在2018年、2019年、2020年以及3年平均分別高1.6%、1.4%、1.5%和1.5% (圖4-B)。

圖3 分子標(biāo)記PPO18、PPO16和PPO29檢測(cè)部分小麥品種Ppo-A1 (A)和Ppo-D1 (B)位點(diǎn)的不同等位變異

M: DNA ladder 2000; 1: 京411; 2: 洛旱7號(hào); 3: 山農(nóng)20; 4: 石4185; 5: 石麥12; 6: 新麥20; 7: 開麥20; 8: 許農(nóng)5號(hào); 9: 淮麥20; 10: 邢麥13。

M: marker DNA ladder 2000; 1: Jing 411; 2: Luohan 7; 3: Shannong 20; 4: Shi 4185; 5: Shimai 12; 6: Xinmai 20; 7: Kaimai 20; 8: Xunong 5; 9: Huaimai 20; 10: Xingmai 13.

表5 248份小麥品種Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)3年發(fā)芽指數(shù)方差分析

*和**表示在< 0.05和< 0.01水平下差異顯著。*and**represent significance at< 0.05 and< 0.01, respectively.

圖4 小麥品種Ppo-A1 (A)和Ppo-D1 (B)位點(diǎn)不同等位變異間發(fā)芽指數(shù)比較

**表示在< 0.01水平下差異顯著。圓點(diǎn): 極端值。**represents significant at< 0.01. Dot: outlier.

2.4 Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)不同等位變異組合與穗發(fā)芽抗性關(guān)系

方差分析發(fā)現(xiàn)×互作均方顯著, 表明2個(gè)位點(diǎn)共同影響穗發(fā)芽抗性。4種等位變異組合發(fā)芽指數(shù)比較分析發(fā)現(xiàn), 不同等位變異組合品種間存在差異。其中,位點(diǎn)低PPO活性等位變異和位點(diǎn)高PPO活性等位變異組合品種(71份)平均發(fā)芽指數(shù)最低, 為42.52%; 其次為兩個(gè)低PPO活性等位變異組合品種(64份), 平均發(fā)芽指數(shù)為46.30%; 兩個(gè)高PPO活性等位變異組合(48份)發(fā)芽指數(shù)最高, 平均為50.90%(圖5)。4種組合品種中,與相比, 2018年、2019年、2020年和3年平均發(fā)芽指數(shù)分別降低5.88%、9.19% (< 0.01)、10.10% (< 0.01)和8.39% (< 0.01);與相比, 2018年、2019年、2020年和3年平均發(fā)芽指數(shù)分別降低4.95%、6.88% (< 0.01)、6.16%和5.99% (< 0.01)。其他等位變異組合間發(fā)芽指數(shù)無顯著差異。

圖5 小麥品種Ppo-A1和Ppo-D1位點(diǎn)不同等位變異組合間發(fā)芽指數(shù)比較

不同字母表示等位變異間發(fā)芽指數(shù)在0.01水平顯著。圓點(diǎn): 極端值。

Different letters indicate significance at< 0.01 in germination index between alleles. Dot: outlier.

圖6 輪選13 ×濟(jì)麥20群體Ppo-A1位點(diǎn)不同等位變異間發(fā)芽指數(shù)比較

不同字母表示等位變異間發(fā)芽指數(shù)在0.01水平顯著。

Different letters indicate significant difference at< 0.01 in germination index between alleles.

2.5 輪選13 ×濟(jì)麥20遺傳群體Ppo-A1位點(diǎn)不同等位變異間穗發(fā)芽抗性比較

利用PPO18標(biāo)記分析, 輪選13 × 濟(jì)麥20 F2群體檢測(cè)出80株純合基因型(), 64株純合基因型(), 122株是雜合基因型()。根據(jù)F2和F2:3表型,基因型發(fā)芽指數(shù)顯著低于雜合型和基因型(< 0.01)。與基因型相比,基因型發(fā)芽指數(shù)在2019年和2020年分別降低9.17% (< 0.01)和4.77% (< 0.01); 與雜合型相比,基因型發(fā)芽指數(shù)在2019年和2020年分別下降10.44% (< 0.01)和5.48% (< 0.01) (圖6)。基因型與雜合型間發(fā)芽指數(shù)差異不顯著。

2.6 不同基因型PPO活性以及Ppo-A1和Ppo-D1基因表達(dá)分析

4種等位變異組合品種、、和的平均PPO活性分別為19.32、20.13、5.00和4.33 (A475nmmin–1g–1×103)。其中, 組合和的PPO活性和發(fā)芽指數(shù)顯著低于和組合(< 0.01) (圖7-A)。在輪選13 × 濟(jì)麥20 F2:3群體中, 基因型和平均PPO活性分別為19.33和9.62 (A475nmmin–1g–1×103), 兩種基因型間在PPO活性和發(fā)芽指數(shù)上同樣存在極顯著差異(< 0.01) (圖7-B)。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn), 40個(gè)等位變異組合品種PPO活性與發(fā)芽指數(shù)呈極顯著正相關(guān)(= 0.80,< 0.01), 并且在F2:3群體中40個(gè)家系PPO活性與發(fā)芽指數(shù)同樣呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)(= 0.74,< 0.01)。qRT-PCR分析發(fā)現(xiàn), 在低發(fā)芽指數(shù)和組合品種中基因相對(duì)表達(dá)量要低于高發(fā)芽指數(shù)的和組合品種(圖8-A), 相比之下,基因表達(dá)量無明顯差異(圖8-B)。在輪選13 × 濟(jì)麥20 F2:3群體中, 兩種不同基因型間基因相對(duì)表達(dá)量存在顯著差異(圖8-C)。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn), 供試小麥品種間發(fā)芽指數(shù)存在較大差異。其中, 豐產(chǎn)3號(hào)、百農(nóng)3217和洛旱11等白粒品種以及揚(yáng)麥20、揚(yáng)麥15和揚(yáng)麥16等紅粒品種發(fā)芽指數(shù)較低, 表明這些品種具有很好的穗發(fā)芽抗性, 而且它們大部分曾經(jīng)是各自生態(tài)區(qū)主推的小麥品種, 具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀, 可作為抗穗發(fā)芽育種的親本。不同麥區(qū)品種穗發(fā)芽抗性存在顯著差異, 其中, 長(zhǎng)江中下游冬麥區(qū)供試的17個(gè)品種抗穗發(fā)芽能力整體較強(qiáng)?？赡茉蛞皇沁@個(gè)麥區(qū)是穗發(fā)芽高發(fā)區(qū), 自然選擇和育種的有目的選擇使品種的穗發(fā)芽抗性較強(qiáng); 二是這些品種大部分是紅粒品種, 一般紅粒品種比白粒品種的穗發(fā)芽抗性更強(qiáng)[8]。

圖7 不同基因型品種(A)和輪選13 ×濟(jì)麥20群體F2:3株系(B)PPO活性比較

不同字母表示基因型間發(fā)芽指數(shù)或者PPO活性在0.01水平顯著。

Different letters indicate significant difference at< 0.01 in germination index (GI) / PPO activity among genotypes.

圖8 不同基因型品種(A和B)和輪選13 ×濟(jì)麥20群體F2:3株系(C) Ppo-A1和Ppo-D1基因?qū)崟r(shí)定量表達(dá)分析

不同字母表示基因型間發(fā)芽指數(shù)或者基因相對(duì)表達(dá)水平在0.01水平顯著。

Different letters indicate significant difference at< 0.01 in germination index (GI) / relative expression level among genotypes.

本研究通過對(duì)248份主栽品種和位點(diǎn)等位變異與穗發(fā)芽抗性關(guān)系分析表明, 攜帶低PPO活性等位變異的小麥品種發(fā)芽指數(shù)顯著低于攜帶高PPO活性等位變異的品種。利用輪選13 × 濟(jì)麥20組合F2和F2:3分離群體驗(yàn)證得出相同的結(jié)論。在位點(diǎn), 兩種等位變異間穗發(fā)芽抗性差異不顯著。張立平等[33]利用中優(yōu)9507 × CA9632 DH群體在染色體2AL和2DL上發(fā)現(xiàn)了2個(gè)控制小麥PPO活性主效QTL, 分別解釋表型變異37.9%～50.0%和25.0%～29.1%, 說明位點(diǎn)對(duì)PPO活性的效應(yīng)小于位點(diǎn)。攜帶的品種PPO活性(單位為A475nmmin–1g–1×103)為40.5, 攜帶的品種PPO活性為20.6, 兩者相差19.9; 攜帶的品種PPO活性為27.5, 攜帶的品種PPO活性為34.5, 兩者相差7.0[26]。在某些遺傳背景下,位點(diǎn)不同等位變異之間PPO活性無差異或呈現(xiàn)相反的表型, 即含有等位變異卻表現(xiàn)高PPO活性[32]。通過對(duì)40個(gè)主栽品種PPO活性測(cè)定發(fā)現(xiàn), 攜帶等位變異的品種為12.18,等位變異的品種為13.91, 兩者間無顯著差異。由此可見,位點(diǎn)效應(yīng)較小, 并且不同等位變異間PPO活性無明顯差異, 可能是導(dǎo)致該位點(diǎn)不同等位變異間穗發(fā)芽抗性差異不顯著的主要原因。

Nilthong等[32]發(fā)現(xiàn),位點(diǎn)雜合基因型PPO活性介于兩種純合基因型之間, 盡管略高于雙親的平均值, 但明顯低于純合基因型。在輪選13 × 濟(jì)麥20群體中, 純合高PPO活性等位變異基因型和雜合基因型材料的發(fā)芽指數(shù)相近, 而且均顯著高于純合低PPO活性等位變異基因型, 由此可見, 雜合基因型發(fā)芽指數(shù)明顯偏離中親值, 具體原因有待進(jìn)一步研究。但值得注意的是在輪選13 × 濟(jì)麥20 F2和F2:3群體中雜合基因型均表現(xiàn)出與純合高PPO活性基因型相近的高發(fā)芽指數(shù), 高PPO活性基因表現(xiàn)出顯性效應(yīng)。

方差分析發(fā)現(xiàn),×互作均方顯著, 表明兩個(gè)位點(diǎn)共同影響穗發(fā)芽抗性, 但4種等位變異組合發(fā)芽指數(shù)比較分析發(fā)現(xiàn), 2個(gè)低PPO活性等位變異組合品種(64份, 46.30%)的發(fā)芽指數(shù)并非最低, 而是組合(71份, 42.52%)的發(fā)芽指數(shù)最低, 且分別低于攜帶等位變異(44.31%)和(45.90%)品種在單個(gè)位點(diǎn)的發(fā)芽指數(shù); 加之在單個(gè)位點(diǎn), 等位變異和相對(duì)于同一位點(diǎn)另一個(gè)等位變異具有更好的穗發(fā)芽抗性。由此可見,組合具有更低的發(fā)芽指數(shù)可能是等位變異和的累加效應(yīng)造成的結(jié)果。

降低PPO活性是重要的小麥品質(zhì)育種目標(biāo), 根據(jù)優(yōu)良等位基因開發(fā)的功能標(biāo)記已經(jīng)用于低PPO活性材料篩選[34]。本研究表明,功能標(biāo)記可以同時(shí)用于穗發(fā)芽抗性的選擇, 為選育優(yōu)質(zhì)、抗穗發(fā)芽品種提供了重要信息?？顾氚l(fā)芽基因的分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)在許多國(guó)家的小麥育種中廣泛應(yīng)用[15,35], 選擇同時(shí)具有抗穗發(fā)芽基因和低PPO活性基因可能是提高穗發(fā)芽抗性的重要育種途徑之一。

4 結(jié)論

我國(guó)小麥育成品種間發(fā)芽指數(shù)變異較大。和位點(diǎn)發(fā)芽指數(shù)受年份、位點(diǎn)以及×互作共同影響。位點(diǎn)不同等位變異間穗發(fā)芽抗性差異顯著;位點(diǎn)等位變異間發(fā)芽指數(shù)沒有顯著差異。4種等位變異組合品種中, 具有的品種發(fā)芽指數(shù)最低(42.52%),組合次之(46.30%)。輪選13 × 濟(jì)麥20遺傳群體研究結(jié)果進(jìn)一步證明低PPO活性等位變異與穗發(fā)芽抗性顯著相關(guān), 這個(gè)等位變異分子標(biāo)記可用于穗發(fā)芽抗性育種的分子標(biāo)記輔助選擇。

[1] Li H J, Zhou Y, Xin W L, Wei Y Q, Zhang J L, Guo L L. Wheat breeding in northern China: achievements and technical advances., 2019, 7: 718–729.

[2] Ali A, Cao J J, Jiang H, Chang C, Zhang H P, Sheikh S W, Shah L, Ma C X. Unraveling molecular and genetic studies of wheat (L.) resistance against factors causing pre-harvest sprouting., 2019, 9: 117.

[3] Depauw R M, Knox R E, Singh A K, Fox S L, Humphreys D G, Hucl P. Developing standardized methods for breeding pre-harvest sprouting resistant wheat, challenges and successes in Canadian wheat., 2012, 188: 7–14.

[4] Liu C X, Ding F, Hao F H, Yu M, Lei H H, Wu X Y, Zhao Z X, Guo H X, Yin J, Wang Y L. Reprogramming of seed metabolism facilitates pre-harvest sprouting resistance of wheat, 2016, 6: 20593.

[5] Zhu Y L, Wang S X, Wei W X, Xie H Y, Liu K, Zhang C, Wu Z Y, Jiang H, Cao J J, Zhao L X. Genome-wide association study of pre-harvest sprouting tolerance using a 90K SNP array in common wheat (L.), 2019, 132: 2947–2963.

[6] Liu Y J, Liu Y X, Zhou Y, Wight C, Pu Z, Qi P F, Jiang Q T, Deng M, Wang Z X, Wei Y M. Conferring resistance to pre-harvest sprouting in durum wheat by a QTL identified in, 2017, 213: 19.

[7] Shao M Q, Bai G H, Rife T W, Jesse P, Lin M, Liu S B, Cai H, Tadele K, Allan F, Harold T. QTL mapping of pre-harvest sprouting resistance in a white wheat cultivar Danby, 2018, 131: 1683–1697.

[8] Vetch J M, Stougaard R N, Martin J M, Giroux M J. Revealing the genetic mechanisms of pre-harvest sprouting in hexaploid wheat (L.), 2019, 281: 180–185.

[9] Zhang Y J, Xia X C, He Z H. The seed dormancy alleleassociated with pre-harvest sprouting tolerance is mainly present in Chinese wheat landraces, 2017, 130: 81–89.

[10] Nakamura S, Abe F, Kawahigashi H, Nakazono K, Tagiri A, Matsumoto T, Utsugi S, Ogawa T, Handa H, Ishida H. A wheat homolog of MOTHER OF FT AND TFL1 acts in the regulation of germination., 2011, 23: 3215–3229.

[11] Himi E, Noda K. Red grain colour gene () of wheat is a Myb-type transcription factor., 2005, 143: 239–242.

[12] Yang G H, Zhao X Q, Li B, Liu J Z, Li Z S. Molecular cloning and characterization of a DFR from developing seeds of blue-grained wheat in anthocyanin biosynthetic pathway, 2003, 45: 1329–1338.

[13] Bailey P C, Mckibbin R S, Lenton J R, Holdsworth M J, Flintham J E, Gale M D. Genetic map locations for orthologousgenes in wheat and rice., 1999, 98: 281–284.

[14] Torada A, Koike M, Ogawa T, Takenouchi Y, Tadamura K, Wu J, Matsumoto T, Kawaura K, Ogihara Y. A causal gene for seed dormancy on wheat chromosome 4A encodes a MAP kinase kinase, 2016, 26: 782–787.

[15] Lin M, Liu S B, Zhang G R, Bai G H. Effects ofandgenes on wheat pre-harvest sprouting resistance, 2018, 8: 210.

[16] 吳玉良, 楊煜峰. 無原花色素大麥突變體穗發(fā)芽的研究. 浙江農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 1996, 22: 647–650.

Wu Y L, Yang Y F. Study on pre-harvest sprouting of barley mutants without proanthocyanidins., 1996, 22: 647–650 (in Chinese with English abstract).

[17] Weidner S, Krupa U, Amarowicz R, Karamac M, Abe S. Phenolic compounds in embryos of triticale caryopses at different stages of development and maturation in normal environment and after dehydration treatment., 2002, 126: 115–122.

[18] 魏海蓉, 高東升, 李憲利. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)甜櫻桃休眠的調(diào)控及花芽酚類物質(zhì)含量的影響. 園藝學(xué)報(bào), 2005, 32: 17–21.

Wei H R, Gao D S, Li X L. Effects of plant growth regulators on the content of phenolics in sweet cherry dormant flower buds and dormancy., 2005, 32: 17–21 (in Chinese with English abstract).

[19] 宋亮, 潘開文, 王進(jìn)闖, 馬玉紅. 酚酸類物質(zhì)對(duì)苜蓿種子萌發(fā)及抗氧化物酶活性的影響. 生態(tài)學(xué)報(bào), 2006, 10: 3393–3403.

Song L, Pan K W, Wang J C, Ma Y H. Effects of phenolic acids on seed germination and seedling antioxidant enzyme activity of alfalfa., 2006, 10: 3393–3403 (in Chinese with English abstract).

[20] Esmaeili N, Ebrahimzadeh H, Abdi K. Correlation between polyphenol oxidase (PPO) activity and total phenolic contents inL. Corms during dormancy and sprouting stages., 2017,13: S519–S524.

[21] Demeke T, Morris C F, Campbell K G, King G E, Anderson J A, Chang H G. Wheat polyphenol oxidase: distribution and genetic mapping in three inbred line populations, 2001, 41: 1750–1757.

[22] Baik B, Czuchajowska Z, Pomeranz Y. Comparison of polyphenol oxidase activities in wheats and flours from Australian and US cultivars, 1994, 19: 291–296.

[23] 王寶鳳, 付金鋒, 董立峰. 多酚氧化酶活性與小麥抗穗發(fā)芽的關(guān)系及抗穗發(fā)芽新品種秦麥3號(hào)的選育. 麥類作物學(xué)報(bào), 2006, 29: 97–100.

Wang B F, Fu J F, Dong L F. The Relationship between activity of polyphenol oxidase and resistance to pre-harvest sprouting in wheat and breeding of Qinmai 3 with high resistance to PHS., 2006, 29: 97–100 (in Chinese with English abstract).

[24] 王寶鳳, 楊雪, 付金鋒, 董立峰, 馬理. 低酚酶活性選擇對(duì)小麥穗發(fā)芽的影響. 核農(nóng)學(xué)報(bào), 2015, 29: 899–907.

Wang F B, Yang X, Fu J F, Dong L F, Ma L. Effects of consecutive selection for low polyphenol oxidase activity on wheat pre-harvest sprouting., 2015, 29: 899–907 (in Chinese with English abstract).

[25] Sun D J, He Z H, Xia X C, Zhang L P, Morris C F, Appels R, Ma W J, Wang H. A novel STS marker for polyphenol oxidase acti-vity in bread wheat., 2005, 16: 209–218.

[26] He X Y, He Z H, Zhang L P, Sun D J, Morris C F, Fuerst E P, Xia X C. Allelic variation of polyphenol oxidase (PPO) genes located on chromosomes 2A and 2D and development of functional markers for the PPO genes in common wheat., 2007, 115: 47–58.

[27] 買春艷, 李洪杰, 劉宏偉, 楊麗, 于立強(qiáng), 周陽, 張宏軍. 北方冬麥區(qū)小麥品種產(chǎn)量相關(guān)性狀和幼穗分化特點(diǎn)研究. 麥類作物學(xué)報(bào), 2018, 7: 773–781.

Mai C Y, Li H J, Liu H W, Yang L, Yu L Q, Zhou Y, Zhang H J. Characterization of yield related traits and inflorescence differentiation in representative wheat cultivars from the northern China winter wheat region., 2018, 7: 773–781 (in Chinese with English abstract).

[28] Martinez S A, Godoy J, Huang M, Zhang Z W, Carter A H, Garland Campbell K A, Steber C M. Genome-wide association mapping for tolerance to pre-harvest sprouting and low falling numbers in wheat, 2018, 9: 141.

[29] Anderson J V, Morris C F. An improved whole-seed assay for screening wheat germplasm for polyphenol oxidase activity., 2001, 41: 1697–1705.

[30] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2?ΔΔCTmethod., 2001, 25: 402–408.

[31] Jin H, Wen W E, Liu J D, Zhai S N, Zhang Y, Yan J, Liu X Y, Xia X C, He Z H. Genome-wide QTL mapping for wheat processing quality parameters in a Gaocheng 8901/Zhoumai 16 recombinant inbred line population, 2016, 7: 1032.

[32] 張立平, 葛秀秀, 何中虎, 王德森, 閆俊, 夏先春, Sutherland M W. 普通小麥多酚氧化酶活性的QTL分析. 作物學(xué)報(bào), 2005, 31: 7–10.

Zhang L P, Ge X X, He Z H, Wang D S, Yan J, Xia X C, Sutherland M W. Mapping QTLs for polyphenol oxidase activity in a DH population from common wheat., 2005, 31: 7–10 (in Chinese with English abstract).

[33] Nilthong S, Graybosch R A, Baenziger P S. Inheritance of grain polyphenol oxidase (PPO) activity in multiple wheat (L.) genetic backgrounds, 2012, 125: 1705–1715.

[34] 張曉, 高德榮, 李曼, 劉大同, 吳素蘭, 江偉, 呂國(guó)鋒. 小麥面粉和鮮面片色澤及與等位變異檢測(cè). 麥類作物學(xué)報(bào), 2019, 39: 415–422.

Zhang X, Gao D R, Li M, Liu D T, Wu S L, Jiang W, Lyu G F. Color of flour and fresh dough sheet of wheat varieties and detection of allelic variations for genesand., 2019, 39: 415–422 (in Chinese with English abstract).

[35] Kato K, Maruyama-Funatsuki W, Yanaka M, Ban Y, Takata K. Improving preharvest sprouting resistance in durum wheat with bread wheat genes., 2017, 67: 466–471.

Relationship between the allelic variations at theandloci and pre-harvest sprouting resistance in wheat

HUANG Yi-Wen1, DAI Xu-Ran1, LIU Hong-Wei1, YANG Li1, MAI Chun-Yan2, YU Li-Qiang2, YU Guang-Jun3, ZHANG Hong-Jun1,*, LI Hong-Jie1,*, and ZHOU Yang1,*

1Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Engineering Laboratory for Crop Molecular Breeding, Beijing 100081, China;2Center for Technological Innovation of Dwarf-male-sterile Wheat Breeding (Xinxiang), Xinxiang 453731, Henan, China;3Zhaoxian Experiment Station, ShijiazhuangAcademy of Agricultural and Forestry Sciences, Zhaoxian 051530, Hebei, China

andare the major genes that control the activity of polyphenol oxidase (PPO) in wheat. It has been reported that the activity of polyphenol oxidase affects pre-harvest sprouting (PHS) resistance, but the effect of different alleles/allelic combinations at theandloci on PHS resistance remains unclear. The current study was carried out to elucidate the effects based on the germination index obtained from 248 Chinese wheat cultivars in a three-year trial in combination with genotypic data at theandloci. Analysis of variation for theandloci showed that year,locus and×interaction had significant effects on germination index. At locus, germination index of cultivars carrying the alleleof low PPO activity was 5.22% lower than that carrying the alleleof high PPO activity on average. In contrast, the cultivars carrying the alleleof low PPO activity had higher germination index than that carrying the alleleof high PPO activity at locus, but no significant differences between two alleles. Among the four allelic combinations, the cultivars with thehad the lowest germination index. The relationship between the alleles at locusand PHS resistance had been verified in the Lunxuan 13 ×Jimai 20 F2and F2:3segregationpopulations. There were significantly positive correlations between PPO activity / relative expression level ofgene and germination index. This study suggests that functional markers ofallelecan be effectively applied in marker-assisted selection for PHS resistance.

; the breeding for resistance to pre-harvest sprouting; polyphenol oxidase;allele; molecular marker-assisted selection

10.3724/SP.J.1006.2021.01089

本研究由河北省現(xiàn)代種業(yè)科技專項(xiàng)(19226351D), 國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0101000)和中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院創(chuàng)新工程項(xiàng)目資助。

This study was supported by the Science and Technology Project for Modern Seed Industry of Hebei (19226351D), the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0101000), and the Agricultural Science and Technology Innovation Program of Chinese Academy of Agricultural Sciences.

張宏軍, E-mail: zhanghongjun01@caas.cn; 李洪杰, E-mail: lihongjie@caas.cn; 周陽, E-mail: zhouyang@caas.cn

E-mail: 18838916683@163.com

2020-11-20;

2021-03-19;

2021-04-01.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20210401.1308.009.html