一株花生白絹病菌拮抗細(xì)菌的篩選、鑒定及發(fā)酵液中活性物質(zhì)穩(wěn)定性研究

李亮亮雷 高李 磊岳丹丹甄 靜王繼雯

(河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司/河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450008)

花生(ArachishypogaeaLinn.)是全球范圍內(nèi)最重要的油料作物之一,有很高的食用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,在我國的種植歷史已有上百年[1]。近年來,隨著我國花生種植面積的急劇擴(kuò)大,以及連作重茬現(xiàn)象日益加劇,導(dǎo)致病害逐年加重。特別是花生白絹病的發(fā)生,對我國花生產(chǎn)業(yè)造成嚴(yán)重?fù)p失?；ㄉ捉伈?Southern blight)是世界范圍內(nèi)花生上發(fā)生的一種重要的枯萎型真菌病害,已經(jīng)對美國、阿根廷、印度、日本等國家的花生產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2-5],該病病原菌的無性世代是半知菌亞門齊整小核菌(SclerotiumrolfsiiSacc.)有性世代為羅氏阿太菌(Atheliarolfsii)[6]。該病菌寄主范圍廣泛,能侵染花生、辣椒、油茶、白術(shù)等植物,是一種危害嚴(yán)重的土傳真菌[7-10]。

目前對花生白絹病的防治方法主要包括輪作、培育抗性品種以及使用化學(xué)藥劑,但防治效果都不理想。同時(shí)化學(xué)藥物的大量使用不僅污染環(huán)境、破壞生態(tài)平衡,而且使病原菌逐漸產(chǎn)生了抗藥性,所以科研人員開始研究對花生白絹病的生物防治方法。白絹病生防真菌方面,席亞東等[11]用綠色木霉防治白絹病,防效可達(dá)70%左右。杜嬋娟等[12]發(fā)現(xiàn)使用木霉菌劑或木霉粉劑對白絹病均有一定的防治效果,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)木霉菌株對白絹病菌菌絲的擴(kuò)展有一定的拮抗作用,主要表現(xiàn)為菌絲畸形,菌核不能正常形成。

與真菌相比,細(xì)菌具有培養(yǎng)簡單、生長繁殖速度快等特點(diǎn),因此生防細(xì)菌在生防微生物的研究中占有重要地位。目前已報(bào)道的防治花生白絹病的生防細(xì)菌種類主要有解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、熒光假單胞菌(Pseudomonasfluorescens)等[13-15]。近年也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)放線菌對白絹病有較好的生防作用[16]。但關(guān)于白絹病菌的研究報(bào)道和生防菌種還十分有限,亟待進(jìn)一步研究。本文以實(shí)驗(yàn)室保存的4株細(xì)菌為研究對象,篩選對花生白絹病菌具有高效拮抗活性的菌株,對篩選出的菌株進(jìn)行鑒定,并對拮抗菌株發(fā)酵液中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

花生白絹病菌(Sclerotiumrolfsii)RS-1分離自河南省汝南縣花生病株。供試菌株WS2-1、WS3-1、WS3-2和nkkc由河南省微生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 供試培養(yǎng)基

NA 培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,牛肉膏3 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.2～7.4。

NB培養(yǎng)基:蛋白胨10 g,氯化鈉5 g,牛肉膏3 g,蒸餾水1000 mL,pH 7.2～7.4。

PDA 培養(yǎng)基:200 g新鮮馬鈴薯去皮煮汁,葡萄糖 20 g,瓊脂粉20 g,蒸餾水1000 mL。

1.3 拮抗細(xì)菌的篩選

1.3.1 平板對峙試驗(yàn)

將經(jīng)NA 培養(yǎng)基活化的4株待測細(xì)菌分別劃線接種于PDA 平板兩側(cè),再將直徑5 mm 的花生白絹病菌PDA 平板培養(yǎng)物點(diǎn)接于平板中間。以只接病原菌的PDA 平板為對照,每處理3個(gè)重復(fù)。置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),待對照接近長滿整個(gè)平板時(shí)觀察不同細(xì)菌對病原菌的拮抗效果。

1.3.2 細(xì)菌發(fā)酵濾液對病原菌生長的影響

將4株待測細(xì)菌接入含100 mL NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中于30℃、200 r/min條件下?lián)u培,將搖培3 d后的細(xì)菌發(fā)酵液于10000 r/min、4℃條件下離心20 min,再用濾膜孔徑為0.22 μm 的細(xì)菌過濾器將菌體過濾,所得的濾液即為無菌發(fā)酵濾液。將發(fā)酵濾液分別稀釋2 倍、4 倍后,按照濾液:PDA 為1:4的比例混合,制成帶毒平板,然后將活化好的5 mm 病原真菌菌餅點(diǎn)接于平板中央。以不接菌的NB液體培養(yǎng)基代替無菌發(fā)酵濾液為對照。每個(gè)處理設(shè)置3個(gè)重復(fù),25℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待對照長滿整個(gè)平板時(shí),計(jì)算細(xì)菌發(fā)酵濾液原液、2倍和4倍稀釋液對花生白絹病菌的抑菌率。計(jì)算公式如下:

1.4 拮抗細(xì)菌WS3-1對白絹病菌菌絲生長及菌核形成的影響

將篩選的拮抗菌株WS3-1接入含100 mL NB液體培養(yǎng)基的三角瓶中于30℃、200 r/min條件下?lián)u培24 h,備用。將活化好的直徑5 mm 白絹病菌菌餅接種到PDA 固體平板中央,在距離平板中央3.5 cm 處打孔,向孔內(nèi)加入20 μL活化的WS3-1菌液,對照孔里加入20 μL 的無菌液體培養(yǎng)基。30℃培養(yǎng)3 d后,觀察菌株WS3-1對花生白絹病菌的抑制作用。挑取白絹病菌的菌落邊緣菌絲于空白PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),同時(shí)在光學(xué)顯微鏡下鏡檢。繼續(xù)培養(yǎng)15 d后,記錄產(chǎn)生的菌核數(shù)量。

1.5 拮抗細(xì)菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)特征和生理生化特征測定

拮抗細(xì)菌WS3-1的形態(tài)特征和生理生化特征測定按照參考文獻(xiàn)《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)教程》[17]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[18]的方法進(jìn)行。

1.5.2 分子生物學(xué)鑒定

利用16S rDNA 和gyrB基因?qū)卓咕闣S3-1進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。提取拮抗細(xì)菌WS3-1的基因組DNA[19],分別用細(xì)菌16S rDNA 和gyrB的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。16S rDNA引物序列為:27f:5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3';1492r:5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'[20],PCR 擴(kuò)增條件為94℃預(yù)變性3 min;94℃變性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1.5 min,33個(gè)循環(huán);72℃延伸10 min。gyrB簡并引物序列為UP-1:5'-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3';UP-2r:5'-AGCAGG GTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'[21],PCR 擴(kuò)增條件為94℃、4 min;94℃、1 min,60℃、1 min,72℃、2 min,33個(gè)循環(huán);72℃、10 min。

擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后,交由華大基因測序。將獲得的16S rDNA 和gyrB基因序列在NCBI網(wǎng)站上用BLAST 程序進(jìn)行同源性比對,并用MEGA 6.05 軟件對16S rDNA 與gyrB線性拼接序列進(jìn)行聯(lián)合建樹。

1.6 WS3-1抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性測定

1.6.1 熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將拮抗細(xì)菌WS3-1的無菌發(fā)酵濾液分別在40、60、80、100℃水浴鍋中處理1 h,在121℃條件下處理20 min。待降至室溫后,按照1.3.2的方法測定濾液原液對白絹病菌的抑菌活性。以經(jīng)相應(yīng)溫度處理的NB液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵濾液作對照,每個(gè)處理3次重復(fù)。

1.6.2 pH 穩(wěn)定性試驗(yàn)

用1 mol/L 的NaOH 和HCl將WS3-1發(fā)酵濾液的pH 分別調(diào)至3.0～10.0。然后將調(diào)至不同pH 的發(fā)酵濾液置于4℃過夜后,于8000 r/min離心20 min取上清。按照1.3.2的方法測定各上清液對白絹病菌的抑菌活性。得到的沉淀被原體積的蒸餾水溶解后(pH=8.5),同樣方法檢測抑菌活性。以相應(yīng)pH 的NB液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵濾液為對照,每個(gè)處理重復(fù)3次。

1.6.3 紫外線穩(wěn)定性試驗(yàn)

將待測WS3-1發(fā)酵濾液置于紫外燈下照射。照射條件為波長254 nm,功率36 w,高度25 cm,照射時(shí)間為1,2,4,8,16 h。照射完畢后,按照1.3.2的方法測定濾液原液對白絹病菌的抑菌活性。以經(jīng)紫外燈照射相應(yīng)時(shí)長的NB液體培養(yǎng)基代替發(fā)酵濾液為對照,每個(gè)處理重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 白絹病拮抗細(xì)菌的篩選

2.1.1 平板對峙試驗(yàn)

通過平板對峙法檢測4株細(xì)菌對白絹病菌的拮抗作用,圖1可知,菌株WS3-1和WS2-1對白絹病菌的抑制作用最強(qiáng),抑菌帶最寬。菌株nkkc的抑制效果次之,菌株WS3-2對病菌的抑制效果最差。同時(shí)還發(fā)現(xiàn)經(jīng)菌株WS3-1和WS2-1拮抗的病菌菌絲稀疏,挑取菌落邊緣的菌絲于PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng),不能正常生長。

圖1 花生白絹病拮抗細(xì)菌的篩選Fig.1 Screening of antagonistic bacteria against Sclerotiumr olfsii

2.1.2 細(xì)菌發(fā)酵濾液對病原菌生長的影響

表1可知,4株細(xì)菌發(fā)酵濾液對病原菌均有一定的抑菌活性,隨著稀釋倍數(shù)升高,抑菌活性逐漸下降。菌株WS3-1對白絹病菌的抑制效果最好,與其他3株細(xì)菌相比,其濾液原液、2倍和4倍稀釋濾液對病菌的抑制率都是最高,分別為95.04%、71.66%和30.64%。結(jié)合平板對峙試驗(yàn)的結(jié)果,選取菌株WS3-1進(jìn)行下一步試驗(yàn)。

表1 細(xì)菌發(fā)酵濾液對花生白絹病菌的抑制作用Table 1 Antagonism by bacterial fermentation filtrate against Sclerotiumr olfsii

2.2 拮抗細(xì)菌WS3-1對白絹病菌菌絲生長及菌核形成的影響

試驗(yàn)結(jié)果顯示,白絹病菌菌絲經(jīng)菌株WS3-1處理后菌絲形態(tài)出現(xiàn)異常,拮抗效果較為明顯,表現(xiàn)為菌絲腫脹變粗、交叉纏結(jié),菌絲頂端膨大畸形(圖2)。繼續(xù)培養(yǎng)15 d后,對產(chǎn)生的菌核進(jìn)行計(jì)數(shù)。結(jié)果表明,經(jīng)WS3-1處理的白絹病菌產(chǎn)生的菌核數(shù)量為37粒,明顯少于對照平板產(chǎn)生的94粒菌核數(shù)量,表明菌株WS3-1可以抑制白絹病菌菌核的產(chǎn)生。

圖2 菌株WS3-1對白絹病菌的抑制效應(yīng)Fig.2 Inhibition effect of strain WS3-1 against Sclerotiumr olfsii

2.3 拮抗細(xì)菌的鑒定

2.3.1 形態(tài)特征和生理生化特征測定

菌株WS3-1在NA 培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h,菌落呈圓形,稍微隆起,顏色為淡乳白色,不透明,表面較粗糙。細(xì)胞桿狀,革蘭氏染色陽性(圖3),芽孢卵圓形,中生。菌株WS3-1的生理生化特征結(jié)果見表2。結(jié)合形態(tài)特征和生理生化特征,菌株WS3-1符合解淀粉芽孢桿菌Bacillusamyloliquefaciens特性。

圖3 菌株WS3-1的形態(tài)特征Fig.3 Morphological characteristics of strain WS3-1

表2 拮抗細(xì)菌WS3-1的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain WS3-1

2.3.2 分子生物學(xué)鑒定

對菌株WS3-1的16S rDNA和gyrB序列進(jìn)行測序,基因序列片段長度分別為1450 bp和1164 bp。將測得的序列提交至GenBank,獲得登錄號分別為MT579842和MW045314。將WS3-1的16S rDNA和gyrB序列分別與 GenBank 中的序列進(jìn)行BLAST比對,發(fā)現(xiàn)與菌株WS3-1相似性最高的是Bacillusamyloliquefaciens,相似度均達(dá)99%以上。將比對獲得的同源序列和測定序列進(jìn)行同源性分析,利用MEGA6.05軟件對16S rDNA與gyrB序列進(jìn)行聯(lián)合建樹(圖4)。圖4可看出,菌株WS3-1與BacillusamyloliquefaciensBCRC14193 和BacillussiamensisKCTC13613同屬一個(gè)遺傳分枝,親緣關(guān)系十分接近。在BLAST 比對過程中,菌株WS3-1的16S rDNA 序列與Bacillusamyloliquefa-ciensBCRC14193的相似度為99.51%,與Bacillus siamensisKCTC13613 的相似度為99.44%,兩者非常接近,所以僅依靠16S rDNA 序列難以區(qū)分親緣關(guān)系接近的菌種。而菌株WS3-1的gyrB序列與BacillusamyloliquefaciensBCRC14193和BacillussiamensisKCTC13613 的相似度有較大差別,分別為99.40%和96.22%,具有很好的區(qū)分性。同時(shí)結(jié)合細(xì)菌的形態(tài)特征和生理生化特征,最終將菌株WS3-1鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。

圖4 基于16S rDNA 和gyrB 序列構(gòu)建的菌株WS3-1系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on sequences of 16S rDNA and gyrB of strain WS3-1

2.4 WS3-1抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性測定

2.4.1 熱穩(wěn)定性測定

菌株WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)不同溫度處理后的抑菌活性如圖5所示。由結(jié)果可知WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)40℃、60℃、80℃條件下處理1 h后,其對花生白絹病菌的抑菌率均在90%以上,與未經(jīng)處理(25℃)的發(fā)酵液的抑菌活性沒有顯著差異。當(dāng)溫度升高到100℃和120℃后,抑菌活性仍達(dá)到42.09%和31.92%,說明WS3-1發(fā)酵濾液中含有耐高溫的抗菌物質(zhì)。

圖5 溫度對菌株WS3-1抑菌活性的影響Fig.5 Influence of temperature on antifungal activity of strain WS3-1

2.4.2 pH 穩(wěn)定性

菌株WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)不同pH 處理后,得到的上清和沉淀的抑菌活性如表3所示。在pH為7～10的條件下,菌株WS3-1對白絹病菌的抑菌率均在84%以上,抑菌活性穩(wěn)定,不產(chǎn)生沉淀,說明WS3-1發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)受堿性條件影響較小,在堿性條件下可以穩(wěn)定存在。當(dāng)pH<7時(shí),發(fā)酵濾液開始產(chǎn)生沉淀,隨著pH 的下降,上清液的抑菌活性逐漸降低,產(chǎn)生沉淀的抑菌活性逐漸升高。當(dāng)pH=3時(shí),沉淀的抑菌率達(dá)到78.42%,而上清液的抑菌活性只有18.61%,說明在酸性條件下WS3-1發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)會出現(xiàn)沉淀現(xiàn)象。

表3 pH 對菌株WS3-1抑菌活性的影響Table 3 Influence of pH on antifungal activity of strain WS3-1

2.4.3 紫外線穩(wěn)定性

菌株WS3-1經(jīng)紫外線處理后的抑菌活性如圖6所示。隨著紫外線照射時(shí)間的增加,菌株WS3-1的抑菌活性逐漸下降,但變化不明顯。照射16 h 后,抑菌率仍達(dá)到72.07%,說明菌株WS3-1發(fā)酵濾液中的抑菌物質(zhì)具有較好的抗紫外線分解能力。

圖6 紫外照射對菌株WS3-1抑菌活性的影響Fig.6 Influence of ultraviolet on antifungal activity of strain WS3-1

3 結(jié)論與討論

芽孢桿菌是一類好氧、能產(chǎn)生內(nèi)生芽孢的革蘭氏陽性細(xì)菌,廣泛存在于土壤、水源和植物根際中,同時(shí)也是常見的植物內(nèi)生細(xì)菌。研究表明,芽孢桿菌對植物不僅具有促生作用,還具有內(nèi)生固氮和防治病害等多方面的生物學(xué)作用[22-23]。由于芽孢桿菌對人畜無害,對生態(tài)環(huán)境友好,同時(shí)自身具有較強(qiáng)的抗逆性,因此是目前極有開發(fā)應(yīng)用前景的一類生防菌。本文通過平板對峙試驗(yàn)和菌絲生長速率法篩選到一株對花生白絹病菌具有拮抗活性的細(xì)菌菌株WS3-1,該菌發(fā)酵濾液原液對白絹病菌菌絲的生長抑制率達(dá)到95.04%,同時(shí)還可抑制病菌菌核的產(chǎn)生。利用細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化特征及16S rDNA 和gyrB序列聯(lián)合分析,將該菌株鑒定為解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)。解淀粉芽孢桿菌是一種重要的生防細(xì)菌,具有較廣的抑菌譜,能夠防治多種真菌和細(xì)菌類病害。鄧建良等[24]從果園土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌YN-1,該菌的抑菌譜廣泛,對包括絲核菌和鐮刀菌在內(nèi)的多種病原菌都有較好的拮抗作用。蔣凱麗等[25]從圣女果中分離到一株解淀粉芽孢桿菌KL-1,經(jīng)研究菌株KL-1對極細(xì)鏈格孢菌、黑曲霉、青霉菌和膠孢炭疽菌等多種病原菌都有明顯的抑制作用,抑菌譜廣泛。

微生物的次級代謝產(chǎn)物是極其復(fù)雜的,代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性對活性物質(zhì)的提取、生產(chǎn)應(yīng)用都起著至關(guān)重要的影響。本文研究了菌株WS3-1次級代謝產(chǎn)物中活性物質(zhì)的穩(wěn)定性,發(fā)現(xiàn)活性物質(zhì)經(jīng)40℃、60℃、80℃處理后活性穩(wěn)定,抑菌率保持在90%以上,但當(dāng)溫度升到100℃和120℃后抑菌活性迅速下降,說明菌株WS3-1產(chǎn)生的活性物質(zhì)中含有不耐高溫物質(zhì),可能是某種蛋白酶類物質(zhì)。宋利沙等[26]對分離自腫節(jié)風(fēng)體內(nèi)的一株內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)該菌株可產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、纖維素酶和蛋白酶等多種抗菌活性物質(zhì),這些酶類可單獨(dú)或協(xié)同作用使病菌菌絲頂端膨大畸形,導(dǎo)致菌絲不能正常生長。這與本研究篩選的解淀粉芽孢桿菌WS3-1可促使白絹病菌菌絲畸形和死亡的結(jié)果相一致,推測菌株WS3-1也可產(chǎn)生上述酶類物質(zhì)破壞菌絲細(xì)胞結(jié)構(gòu)從而抑制病菌的生長。菌株WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)121℃處理20 min后仍具有一定的抑菌活性,抑菌率為31.92%,說明WS3-1產(chǎn)生的活性物質(zhì)中還包含部分耐高溫成分。同時(shí)WS3-1發(fā)酵濾液經(jīng)酸處理后上清液抑菌活性迅速下降,活性物質(zhì)出現(xiàn)了酸沉現(xiàn)象,推測菌株WS3-1活性物質(zhì)中的耐高溫成分是一種脂肽類物質(zhì)。王寶等[27]研究了一株解淀粉芽孢桿菌BEB33對香蕉枯萎病菌的生防作用,發(fā)現(xiàn)菌株BEB33發(fā)酵產(chǎn)生的脂肽類物質(zhì)可以引起病菌菌絲細(xì)胞膨大、細(xì)胞膜穿孔,從而抑制病原菌的生長。對于菌株WS3-1在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的酶類和脂肽類物質(zhì),我們將在接下來的試驗(yàn)中進(jìn)一步研究。