乙型肝炎病毒e抗原定量檢測(cè)的性能驗(yàn)證和臨床應(yīng)用探索

郭藝飛，胡堯，蔣祺蓉，黃銘穎，劉愛(ài)平，張繼明

1. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院感染科，上海 200040； 2. 復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海 200040

乙型肝炎e抗原(hepatitis B e antigen, HBeAg)由HBV 前C區(qū)或C區(qū)編碼而成，經(jīng)由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)-高爾基體結(jié)構(gòu)分泌至胞外。HBeAg既不是HBV顆粒的結(jié)構(gòu)成分，也不是HBV DNA復(fù)制所必需的，但是發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換是免疫控制的指標(biāo)，也是評(píng)估慢乙肝治療療效的重要指標(biāo)。此外，血清HBeAg的水平反應(yīng)了病毒的復(fù)制水平，且HBeAg對(duì)于維持乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)的慢性感染至關(guān)重要。血清HBeAg與HBV DNA定量之間有顯著相關(guān)性，即HBeAg陽(yáng)性的患者絕大多數(shù)表現(xiàn)出HBV DNA陽(yáng)性[1]。有研究表明，HBeAg陽(yáng)性孕婦生產(chǎn)的子女即便接受了乙肝疫苗以及免疫球蛋白的阻斷，相較于HBeAg陰性孕婦所生的子女而言，依舊具有較高的概率發(fā)生突破性HBV 感染[2]?！秮喬貐^(qū)慢性乙型肝炎(CHB)治療指南2012》里明確指出，HBeAg和HBV DNA均是乙肝患者監(jiān)測(cè)的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目[3]。2015年3月發(fā)布的WHO首部全球慢性乙肝指南里也強(qiáng)調(diào)了定期監(jiān)測(cè)慢性乙肝患者HBeAg指標(biāo)的必要性[4]。盡管目前已有大量臨床研究驗(yàn)證了HBeAg定量檢測(cè)對(duì)臨床診療的重要性，HBeAg的定量檢測(cè)還未成為常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目。為了將HBeAg定量檢測(cè)應(yīng)用于臨床，本研究對(duì)HBeAg定量檢測(cè)平臺(tái)進(jìn)行了性能驗(yàn)證，評(píng)估了定量檢測(cè)和定性檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，并對(duì)慢性乙肝患者樣本進(jìn)行HBeAg定量檢測(cè)，觀察其與血清HBV DNA水平、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase, ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase, AST)等結(jié)果的相關(guān)性，為HBeAg定量檢測(cè)在臨床診療的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 一般資料

標(biāo)本來(lái)源為2019年3月至2019年5月來(lái)本院就診的710例慢性乙型肝炎患者的血清。710例乙肝患者的HBeAg定性檢測(cè)均為陽(yáng)性，男性患者488例，女性患者222例，平均年齡(37.54±11.31)歲。根據(jù)血清學(xué)、病毒學(xué)和生物化學(xué)等檢測(cè)結(jié)果有明確臨床診斷的有98名患者，其中，78名患者處于免疫清除期，20名患者處于免疫耐受期[5]。關(guān)于98名患者的基線(xiàn)信息具體如表1所示。本研究經(jīng)復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(編號(hào)：KY2015-212)。

1.2 方法

1.2.1 HBeAg定量檢測(cè)分析性能驗(yàn)證本實(shí)驗(yàn)室首次使用雅培ARCHITECT HBeAg定量試劑在美國(guó)雅培ARCHITECT i4000SR全自動(dòng)免疫分析儀上進(jìn)行檢測(cè)。因此，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)相關(guān)指南文件EP10A3，對(duì)HBeAg定量檢測(cè)系統(tǒng)的精密度、分析靈敏度、線(xiàn)性范圍/可報(bào)告范圍、攜帶污染率進(jìn)行分析和驗(yàn)證，來(lái)評(píng)估其檢測(cè)性能是否滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)使用要求。驗(yàn)證期間，已確認(rèn)儀器運(yùn)轉(zhuǎn)良好，質(zhì)控在控。

1) 精密度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

取兩個(gè)濃度的質(zhì)控品作為驗(yàn)證材料連續(xù)檢測(cè)5天，各濃度每天重復(fù)測(cè)定5次。每濃度水平獲得25個(gè)數(shù)據(jù)。若計(jì)算的精密度小于等于廠商聲明的質(zhì)量要求，則驗(yàn)證通過(guò)。

表1 98名有明確臨床診斷患者的基線(xiàn)資料

2) 分析靈敏度驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

將ARCHITECT HBeAg定量手工稀釋液作為“0”濃度樣品，連續(xù)測(cè)定20次，重復(fù)測(cè)定已知濃度樣本(0.7 PEIU/mL)3次，記錄“0”濃度和已知濃度測(cè)定結(jié)果的相對(duì)光單位(relative light unit, RLU)值。如果計(jì)算的分析靈敏度≤廠家聲明，則驗(yàn)證通過(guò)。

3) 線(xiàn)性范圍

廠商聲明的線(xiàn)性范圍是1～700 PEIU/mL，取已知濃度的患者高值(H)、低值(L)標(biāo)本各一份(高值標(biāo)本濃度為696 PEIU/mL，低值標(biāo)本濃度為2 PEIU/mL)。將L和H按照如下方式進(jìn)行配比：5L+0H，4L+1H，3L+2H，2L+3H，1L+4H，0L+5H，組成6份驗(yàn)證物質(zhì)。測(cè)定該驗(yàn)證物質(zhì)濃度，每份重復(fù)測(cè)定2次。線(xiàn)性可允許系統(tǒng)誤差要求 ≤1/2 TEA，TEA=25%。

4) 攜帶污染率

取高濃度樣本(H)和低濃度樣本(L)各一份，將高濃度樣本分成10份，低濃度樣本分成11份，21份樣本按順序：L1-L2-L3-H1-H2-L4-H3-H4-L5-L6-L7-L8-H5-H6-L9-H7-H8-L10-H9-H10-L11連續(xù)測(cè)定。攜帶污染 =High-Low的均值-Low-Low的均值，即(L4+L5+L9+L10+L11)/ 5-(L2+L3+L6+L7+L8) / 5，攜帶污染 < 3 倍Low-Low的SD則驗(yàn)證通過(guò)。

1.2.2HBeAg定性測(cè)定

本實(shí)驗(yàn)室HBV血清標(biāo)志物檢測(cè)常規(guī)采用美國(guó)雅培ARCHITECT i4000SR全自動(dòng)免疫分析儀以及乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒。患者血清樣本經(jīng)實(shí)驗(yàn)室常規(guī)HBeAg定性檢測(cè)之后，結(jié)果判定陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)為HBeAg S/CO 值≥1.0，HBeAg S/CO 值<1.0 為陰性。

1.2.3HBeAg定量測(cè)定

取HBeAg定性檢測(cè)結(jié)果判定為陽(yáng)性的患者樣本，采用美國(guó)雅培ARCHITECT i4000SR全自動(dòng)免疫分析儀、乙型肝炎病毒e抗原測(cè)定試劑盒和乙型肝炎病毒e抗原校準(zhǔn)品。HBeAg定量檢測(cè)結(jié)果以Paul Ehrlich institute單位(PEIU/mL)表示。

1.3 HBV DNA定量測(cè)定

取HBeAg定性檢測(cè)為陽(yáng)性的患者樣本，采用美國(guó)Applied Biosystems公司的7500 Real Time PCR System和上海科華公司的乙型肝炎病毒核酸測(cè)定試劑盒。質(zhì)控品來(lái)自上海市臨床檢驗(yàn)中心。HBV DNA陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)：HBV DNA>5×102Copy/mL。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

HBeAg定量檢測(cè)的性能驗(yàn)證數(shù)據(jù)采用EP Evaluation @軟件(Release11)進(jìn)行分析。HBeAg定量和定性檢測(cè)、HBeAg定量和HBV DNA定量檢測(cè)結(jié)果的分別比對(duì)，采用MedCalc(version 19.1)統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，利用配對(duì)T檢驗(yàn)和Passing-Bablok回歸分析比較兩種方法檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性。P<0.05被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HBeAg定量檢測(cè)的性能驗(yàn)證

精密度驗(yàn)證計(jì)算低值均值為1.335 PEIU/mL，批內(nèi)精密度為2.7%，小于說(shuō)明書(shū)宣稱(chēng)的5.25%，總精密度為5.2%，小于說(shuō)明書(shū)中的7.04%，驗(yàn)證通過(guò)；精密度高值均值為99.387 PEIU/mL，高值批內(nèi)精密度為1.5%，小于說(shuō)明書(shū)的3.03%，總精密度為4.7%，小于說(shuō)明書(shū)中的5.58%，驗(yàn)證也通過(guò)。靈敏度驗(yàn)證的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)計(jì)算得靈敏度為0.014 PEIU/mL，小于廠商聲明的0.02 PEIU/mL，驗(yàn)證通過(guò)。線(xiàn)性范圍/可報(bào)告范圍驗(yàn)證結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，線(xiàn)性驗(yàn)證誤差(error)為7.0%，小于線(xiàn)性可允許系統(tǒng)誤差12.5%，且在檢測(cè)的0～619.520 PEIU/mL范圍內(nèi)成線(xiàn)性，驗(yàn)證通過(guò)。攜帶污染率數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)評(píng)估為0.010，符合廠家聲明和本院要求，驗(yàn)證通過(guò)。因此，經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，ARCHITECT HBeAg定量檢測(cè)系統(tǒng)的精密度、分析靈敏度、線(xiàn)性范圍、攜帶污染率均符合需求。

2.2 HBeAg定性和定量檢測(cè)比對(duì)分析

性能驗(yàn)證顯示HBeAg定量檢測(cè)在0～619.520 PEIU/mL范圍內(nèi)成線(xiàn)性，因此選取HBeAg定量檢測(cè)值在線(xiàn)性范圍內(nèi)的樣本共618例來(lái)對(duì)比分析HBeAg定量和定性的檢測(cè)結(jié)果。兩種方法的檢測(cè)結(jié)果均取Log10之后用對(duì)數(shù)值做統(tǒng)計(jì)分析。配對(duì)t檢驗(yàn)顯示HBeAg定量和定性檢測(cè)方法的相關(guān)性良好(r=0.997，P<0.000 1)，如圖1所示。Passing Bablok 回歸分析的回歸方程為y=-1.064+1.167x(r=0.997，P<0.000 1，95%CI=0.997～0.998)，顯示相關(guān)性良好, 具體如圖2所示。

圖1 HBeAg定性和定量檢測(cè)的相關(guān)性

圖2 Passing Bablok 回歸分析HBeAg定量和定性檢測(cè)的一致性

2.3 HBeAg定量和HBV DNA的關(guān)系

選取126例同時(shí)定量檢測(cè)了HBeAg和HBV DNA的樣本，運(yùn)用Passing and Bablok回歸分析兩種方法的相關(guān)性，回歸方程為y=2.909+1.590x(r=0.363，P<0.000 1，95%CI=1.009～3.765)，顯示HBeAg定量與HBV DNA定量檢測(cè)水平呈明顯的正相關(guān)，由表中統(tǒng)計(jì)可知，隨著HBeAg定量水平的升高，處于高病毒載量的人群占比越來(lái)越高(見(jiàn)表2和圖3)。

表2 HBeAg定量檢測(cè)和HBV DNA定量檢測(cè)的關(guān)系[n(%)]

圖3 Passing-Bablok 回歸分析HBeAg定量和HBV DNA定量檢測(cè)的相關(guān)性

2.4 不同HBeAg定量水平與病毒學(xué)指標(biāo)、血清生化學(xué)指標(biāo)的關(guān)系

在98名有明確臨床診斷的患者中選取有HBV DNA檢驗(yàn)數(shù)據(jù)的57名患者，根據(jù)HBeAg定量水平分為 0.1～1.3 PEIU/mL，1.3～20 PEIU/mL，20～250 PEIU/mL，≥250 PEIU/mL 4組, 由表中數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)可知，隨著HBeAg定量檢測(cè)值的逐漸升高，HBV DNA 病毒載量結(jié)果也相應(yīng)增加。當(dāng)HBeAg定量高于250 PEIU/ml時(shí)，可檢測(cè)的HBV DNA的比率升高(46.15%升至83.33%)，ALT或AST異常率顯著降低(92.31%降至50.00%)(見(jiàn)表3)。

表3 不同HBeAg定量水平下病毒學(xué)和血清生化學(xué)指標(biāo)的特點(diǎn)

3 討論

隨著醫(yī)療研究的進(jìn)展和醫(yī)療技術(shù)的不斷進(jìn)步, HBV血清學(xué)標(biāo)志物的檢測(cè)從定性檢測(cè)進(jìn)步到了定量檢測(cè)[6-12]，定量檢測(cè)使得一些乙肝血清學(xué)指標(biāo)有了新的臨床意義和應(yīng)用，如HBsAg定量檢測(cè)已經(jīng)被納入《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)，為乙肝診療個(gè)體化提供了新的依據(jù)[4]。近年來(lái)，關(guān)于HBeAg定量檢測(cè)與慢性乙型肝炎治療療效的相關(guān)研究越來(lái)越多。一項(xiàng)關(guān)于接受干擾素治療的HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者的回顧性研究，對(duì)比了HBV DNA和HBeAg對(duì)于治療后6個(gè)月HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)換的預(yù)測(cè)價(jià)值，發(fā)現(xiàn)：在干擾素治療24周時(shí)，HBeAg、HBV DNA水平均可預(yù)測(cè)治療后6個(gè)月的持久應(yīng)答，且HBeAg比HBV DNA能更好地預(yù)測(cè)HBeAg的血清學(xué)轉(zhuǎn)換；HBeAg水平在干擾素治療24周處于低中值(<100 PEIU/mL)時(shí)，其預(yù)測(cè)價(jià)值和HBV DNA沒(méi)有明顯差別，但是水平處于高值(>100 PEIU/mL)時(shí)，HBeAg的預(yù)測(cè)值遠(yuǎn)高于HBV DNA(96% vs 86%)。這項(xiàng)研究結(jié)果表明血清HBeAg的定量檢測(cè)可以用來(lái)補(bǔ)充或者部分替代HBV DNA作為HBeAg陽(yáng)性乙肝患者干擾素治療監(jiān)控的指標(biāo)[13]。慢性乙型肝炎患者治療過(guò)程中的HBeAg定量水平變化，也是預(yù)測(cè)核苷(酸)類(lèi)似物(nucleoside/nucleotide analogues, NAs) 治療反應(yīng)的有效工具。一項(xiàng)前瞻性研究納入76例HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者接受96周核苷(酸)類(lèi)似物治療，分別于治療前、治療后12周、24周定量監(jiān)測(cè)血清HBV表面抗原(HBV surface antigen, HBsAg)、 HBeAg、乙型肝炎核心抗體(hepatitis B core antibody, HBcAb)、HBV DNA和ALT的水平，結(jié)果顯示治療24周的HBeAg指標(biāo)下降水平和幅度可用來(lái)預(yù)測(cè)病毒學(xué)應(yīng)答和血清轉(zhuǎn)換[14]。

HBeAg是診斷有無(wú)HBV感染和傳染性的常用血清標(biāo)志物。目前臨床主要應(yīng)用酶免疫法或化學(xué)發(fā)光法來(lái)檢測(cè)HBeAg，判斷陰陽(yáng)性，用于輔助診斷HBV的感染狀態(tài)[15-17]。HBeAg定性檢測(cè)相較于定量檢測(cè)具有檢測(cè)快速、經(jīng)濟(jì)等優(yōu)點(diǎn)，在篩查乙型肝炎患者中發(fā)揮了重要作用，但是在評(píng)估及預(yù)測(cè)HBeAg陽(yáng)性慢性乙型肝炎患者治療療效方面差于定量檢測(cè)。近年來(lái)，隨著免疫技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用，HBeAg定量檢測(cè)已經(jīng)成為臨床研究常用的指標(biāo)。HBeAg和HBV DNA一起被納入《慢性乙型肝炎防治指南》(2015年版)，作為判斷HBV治療轉(zhuǎn)歸的標(biāo)志。本實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證了雅培ARCHITECT i4000SR全自動(dòng)免疫分析儀最新的HBeAg定量檢測(cè)分析性能，驗(yàn)證結(jié)果表明HBeAg定量檢測(cè)的精密度、分析靈敏度、線(xiàn)性范圍、攜帶污染率均符合廠家說(shuō)明書(shū)和本實(shí)驗(yàn)室的要求。通過(guò)對(duì)比慢性乙型肝炎患者HBeAg定性和定量?jī)煞N檢測(cè)方法的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)這兩種檢測(cè)方法具有良好的相關(guān)性。本研究也驗(yàn)證了HBeAg定量檢測(cè)結(jié)果和HBV DNA的檢測(cè)結(jié)果呈正相關(guān)且當(dāng)HBeAg定量≥250 PEIU/ml時(shí)，可檢測(cè)的HBV DNA的比率升高(46.15%升至83.33%)，ALT或AST異常率顯著降低(92.31%降至50.00%)?；贖BV DNA與HBeAg的定量檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性，可由HBeAg定量結(jié)果對(duì)HBV DNA進(jìn)行初步預(yù)測(cè)，并且當(dāng)HBeAg≥250 PEIU/ml時(shí)，ALT或AST的異常率顯著降低，ALT或者AST水平與肝臟的炎癥活動(dòng)密切相關(guān)，對(duì)臨床診斷和治療有一定的指導(dǎo)意義。綜上所述，HBeAg可以用于實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)檢測(cè)來(lái)為臨床乙型肝炎患者診療提供依據(jù)。