基于熒光法的明場(chǎng)海水葉綠素傳感器設(shè)計(jì)?

景 超曹 煊吳 寧

(齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)，山東省科學(xué)院海洋儀器儀表研究所，山東省海洋監(jiān)測(cè)儀器裝備技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，國(guó)家海洋監(jiān)測(cè)設(shè)備工程技術(shù)研究中心，山東 青島 266001)

海水中葉綠素含量不僅可以用來(lái)描述浮游植物的現(xiàn)存量，且可以作為海水富營(yíng)養(yǎng)化的指標(biāo)，對(duì)預(yù)防“赤潮”“綠潮”等海洋災(zāi)害具有重要的意義。

目前海水中葉綠素的檢測(cè)方法主要有群落計(jì)數(shù)法[1]、遙感衛(wèi)星[2－5]、分光光度法[6－8]、高效液相色譜法[9－11]等。但是，群落計(jì)數(shù)法雖然準(zhǔn)確但費(fèi)時(shí)費(fèi)力；遙感衛(wèi)星只適合大范圍、全天候監(jiān)測(cè)；分光光度與液相色譜只適合在實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行且實(shí)驗(yàn)繁瑣復(fù)雜，不能滿足葉綠素原位實(shí)時(shí)檢測(cè)。因?yàn)闊晒夥ň哂休^低檢出限、檢測(cè)靈敏度高、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、適用于現(xiàn)場(chǎng)原位檢測(cè)等優(yōu)勢(shì)，因此，熒光法[12－13]被廣泛用于海水中葉綠素的檢測(cè)研究。

目前，國(guó)外的葉綠素傳感器主要有美國(guó)YSI公司的EXO2多參數(shù)傳感器、HACH公司的HYDROLAB HL7多參數(shù)監(jiān)測(cè)儀、英國(guó)Valeport公司Hyperion-C葉綠素a熒光計(jì)、德國(guó)TriOS公司MicroFlu-chl葉綠素a分析儀、日本Alex Electronics公司的AAQ171多參數(shù)傳感器等。雖然國(guó)內(nèi)對(duì)葉綠素傳感器的研究取得了一些的進(jìn)展[14－18]，但是大多數(shù)還處于實(shí)驗(yàn)室階段，且試驗(yàn)性能與國(guó)外還有一定差距。

本設(shè)計(jì)利用正交數(shù)字鎖相放大[19－21](DLIA)技術(shù)解決了環(huán)境光干擾的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了對(duì)微弱熒光信號(hào)的提??；采用460 nm波長(zhǎng)LED照射海水中的浮游植物產(chǎn)生熒光，利用高精度光電二極管作為熒光信號(hào)的接收器件，減少了環(huán)境光干擾的問(wèn)題；同時(shí)利用軟件算法對(duì)溫度與濁度進(jìn)行校正，減少葉綠素濃度檢測(cè)的影響，提高檢測(cè)的精度。

1 傳感器原理設(shè)計(jì)

1.1 葉綠素?zé)晒鈾z測(cè)原理

物質(zhì)在在吸收可見(jiàn)光后，可以發(fā)射出不同波長(zhǎng)的光，這就是熒光。熒光分析法指通過(guò)檢測(cè)物質(zhì)受到光照后發(fā)生的熒光變化，根據(jù)熒光變化量來(lái)推測(cè)反映物質(zhì)特性的分析方法。在較弱的光強(qiáng)下，浮游植物的葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度只與葉綠素的含量有關(guān)，因此可以通過(guò)測(cè)特定光強(qiáng)下的熒光強(qiáng)度來(lái)測(cè)量葉綠素的含量。葉綠素?zé)晒鈴?qiáng)度特性滿足比爾吸收定律[22]，相對(duì)熒光強(qiáng)度:

式中:ε為摩爾吸收系數(shù)，c為葉綠素濃度，b為樣品光程，k為熒光儀器系數(shù)，φ為葉綠素?zé)晒庑?，I為激發(fā)光強(qiáng)。

由于本設(shè)計(jì)采用對(duì)數(shù)計(jì)算，對(duì)式(1)取對(duì)數(shù)得到:

當(dāng)儀器與檢測(cè)物質(zhì)確定后，A、B、D皆為常數(shù)。因此，可以通過(guò)檢測(cè)浮游植物的熒光強(qiáng)度來(lái)檢測(cè)出浮游植物中葉綠素的濃度。

葉綠素a的激發(fā)－發(fā)射光譜如圖1所示。由圖1可以看出，當(dāng)葉綠素的激發(fā)光波長(zhǎng)為460 nm附近時(shí)，發(fā)射熒光光譜的范圍在680 nm區(qū)域內(nèi)具有波峰，因此本文設(shè)計(jì)采用460 nm波長(zhǎng)的高亮度L470－02型LED作為激發(fā)光源，并在680 nm附近進(jìn)行接收，利用中心波長(zhǎng)為680 nm的窄帶濾光片來(lái)保證接熒光激發(fā)效率和接收熒光強(qiáng)度的最大化。

圖1 葉綠素a的激發(fā)－發(fā)射光譜

1.2 正交數(shù)字鎖相放大器的原理

正交數(shù)字鎖相放大器(DLIA)是基于互相關(guān)原理設(shè)計(jì)的一種微弱信號(hào)檢測(cè)設(shè)備，可以從干擾極大的噪聲中提取所需要的信號(hào)信息，能夠抑制噪聲，提高檢測(cè)的靈敏度與信噪比。本設(shè)計(jì)采用正交DLIA實(shí)現(xiàn)對(duì)微弱熒光信號(hào)的提取。

正交DLIA的原理如圖2所示，S(t)為參考信號(hào)，R(t)是待檢測(cè)的信號(hào)，外界噪聲為n(t)。假設(shè)參考信號(hào)R(t)為幅值為A，角頻率為ω，初相為θ的正弦信號(hào):

圖2 正交數(shù)字鎖相放大器原理圖

S(t)是幅值為B，周期為T(mén)的方波信號(hào):

由圖2可得:

由式(4)和式(6)得到:

由于噪聲信號(hào)與參考信號(hào)的不相關(guān)性，因此可以濾除掉噪聲信號(hào)，再經(jīng)過(guò)低通濾波之后，就可以濾除掉n>1的差頻項(xiàng)以及所有的高頻項(xiàng)，便得到所需的信號(hào):

同理，可以得:

將式(8)和式(9)代入公式(10)，便可以計(jì)算出所檢測(cè)信號(hào)的幅值與相位，從而得到檢測(cè)信號(hào)的大小。

1.3 數(shù)字鎖相放大器的設(shè)計(jì)

正交同步檢波原理如圖3所示，是對(duì)交流信號(hào)進(jìn)行相敏檢波的放大器。利用和被測(cè)信號(hào)有相同頻率和相位關(guān)系的參考信號(hào)作為比較基準(zhǔn)，只對(duì)被測(cè)信號(hào)本身和那些與參考信號(hào)同頻(或者倍頻)、同相的噪聲分量有響應(yīng)。因此，能抑制無(wú)用噪聲，改善檢測(cè)的信噪比，實(shí)現(xiàn)對(duì)微弱信號(hào)的檢測(cè)。

圖3 正交同步檢波原理圖

本文設(shè)計(jì)的數(shù)字正交鎖相放大器采用了方波乘以方波的形式，相敏檢測(cè)波形如圖4所示。首先，STM32F103單片機(jī)內(nèi)部產(chǎn)生1 kHz的方波調(diào)制信號(hào)，對(duì)光源進(jìn)行調(diào)制，同時(shí)作為參考信號(hào)。通過(guò)光電二極管接收的熒光信號(hào)R(t)，經(jīng)過(guò)I/V轉(zhuǎn)換放大之后，分別于相位差為90°的方波信號(hào)S1(t)、S2(t)進(jìn)行乘法(PSD)運(yùn)算，即:

圖4 數(shù)字相敏檢測(cè)波形圖

將得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行A/D采集和數(shù)字IIR和FIR混疊低通濾波后，送到STM32F103中進(jìn)行處理，得到的直流信號(hào)，便是葉綠素a濃度的響應(yīng)值，便得到了所檢測(cè)到的數(shù)據(jù)。

2 傳感器硬件設(shè)計(jì)

2.1 光路設(shè)計(jì)

光路系統(tǒng)結(jié)構(gòu)圖如圖5所示。光路系統(tǒng)功能:系統(tǒng)控制驅(qū)動(dòng)電路，驅(qū)動(dòng)LED產(chǎn)生波長(zhǎng)為460 nm的激發(fā)光調(diào)制信號(hào)，激發(fā)光穿過(guò)濾光片入射水體中，水體里的葉綠素受激發(fā)光照射產(chǎn)生熒光信號(hào)，除此之外，環(huán)境雜散光等外部干擾信號(hào)在此時(shí)引入。再經(jīng)過(guò)熒光濾光片，濾除掉其他波長(zhǎng)的信號(hào)，得到波長(zhǎng)為680 nm熒光信號(hào)，高精度的光電二極管將接收到的熒光信號(hào)和干擾信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)，進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)過(guò)解調(diào)放大得到所需的熒光信號(hào)。

圖5 光路系統(tǒng)結(jié)構(gòu)示意圖

為了確保葉綠素a的熒光激發(fā)效率與接收熒光強(qiáng)度的最優(yōu)化，降低研發(fā)成本，利用Zemax光學(xué)仿真軟件對(duì)光路進(jìn)行了模擬和仿真，仿真結(jié)果如圖6所示。結(jié)果表明當(dāng)激發(fā)光路與檢測(cè)光路夾角為45°時(shí)，熒光激發(fā)效率和接收效率最高。光學(xué)探頭結(jié)構(gòu)如圖7所示，由藍(lán)光LED、光電二極管、激發(fā)光源濾光片、熒光濾光片等組成。

圖6 光路仿真模擬

圖7 光學(xué)探頭結(jié)構(gòu)

2.2 電路系統(tǒng)設(shè)計(jì)

電路系統(tǒng)由LED驅(qū)動(dòng)電路、I/V轉(zhuǎn)換電路、二級(jí)放大電路、AD采集電路、信號(hào)處理電路、電刷驅(qū)動(dòng)和溫度檢測(cè)電路等組成。其中信號(hào)處理電路是整個(gè)電路的核心部分，電路系統(tǒng)的設(shè)計(jì)圖如圖8所示。

圖8 電路系統(tǒng)設(shè)計(jì)圖

選用STM32F103作為系統(tǒng)的主控芯片，主要包括通信模塊與信號(hào)處理模塊。STM32F103通過(guò)定時(shí)器產(chǎn)生一個(gè)1 kHz的方波調(diào)制信號(hào)，實(shí)現(xiàn)對(duì)激發(fā)光源LED調(diào)制；利用恒流源驅(qū)動(dòng)芯片MAX1916驅(qū)動(dòng)LED，避免了外界光的干擾，保證了激發(fā)光源LED的穩(wěn)定性；通過(guò)高精度S2386－18L光電二極管接收熒光信號(hào)，提高檢測(cè)靈敏度，降低噪聲；通過(guò)ADC功能實(shí)現(xiàn)對(duì)信號(hào)的采集，在STM32F103中進(jìn)行相敏檢測(cè)與數(shù)字濾波，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行的處理；傳感器通過(guò)RS485與上位機(jī)進(jìn)行通信，主控模塊通過(guò)SPI、GPIO等形式與外設(shè)進(jìn)行通信連接和數(shù)據(jù)交換。

I/V轉(zhuǎn)換電路通過(guò)AD8630運(yùn)算放大器實(shí)現(xiàn)。由于光電二極管產(chǎn)生的電流信號(hào)極其微弱，并受到外部噪聲的干擾，故設(shè)計(jì)電阻R1為1 MΩ，實(shí)現(xiàn)對(duì)電流信號(hào)的放大；電容C1實(shí)現(xiàn)通交隔直作用，屏蔽部分直流信號(hào)，電容C2保證輸出的穩(wěn)定性，使電路更加穩(wěn)定。放大的信號(hào)連接至LF442，二次放大對(duì)電壓信號(hào)進(jìn)行補(bǔ)償和反向，實(shí)現(xiàn)對(duì)微弱熒光信號(hào)的檢測(cè)。I/V轉(zhuǎn)換與放大電路如圖9所示。

圖9 I/V轉(zhuǎn)換與放大電路

溫度和濁度會(huì)影響對(duì)水體中葉綠素含量的檢測(cè)[23]。為了減少溫度對(duì)葉綠素檢測(cè)的影響，本文設(shè)計(jì)了溫度監(jiān)控系統(tǒng)，利用熱敏電阻監(jiān)測(cè)水溫變化，通過(guò)溫度建立數(shù)學(xué)模型，并利用軟件算法進(jìn)行溫度補(bǔ)償；此外，在光電檢測(cè)裝置前安裝了熒光濾光片，以防止光電二極管檢測(cè)到被反射或折射的激勵(lì)光信號(hào)，然后使用偏最小二乘法建立數(shù)學(xué)模型進(jìn)行校正，改善檢測(cè)精度。

為防止生物附著在光學(xué)鏡頭表面，影響檢測(cè)的效果，光學(xué)葉綠素傳感器采用機(jī)械電刷的方式對(duì)光學(xué)鏡頭進(jìn)行清潔。電刷驅(qū)動(dòng)電路如圖10所示，利用抗干擾能力強(qiáng)的電流驅(qū)動(dòng)芯片L9110控制和驅(qū)動(dòng)電機(jī)的運(yùn)行，控制著電機(jī)正轉(zhuǎn)和反轉(zhuǎn)清除掉附著的在光學(xué)鏡頭表面的水生生物，延長(zhǎng)在位時(shí)間。

圖10 電刷驅(qū)動(dòng)電路

2.3 傳感器機(jī)械結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)

本文設(shè)計(jì)的光學(xué)葉綠素傳感器內(nèi)部機(jī)械結(jié)構(gòu)和傳感器實(shí)物圖如圖11所示。儀器主要分為五個(gè)模塊，包括信號(hào)檢測(cè)模塊、熒光探頭、溫度探頭、清潔電刷、機(jī)械外殼等組成。

圖11 傳感器內(nèi)部機(jī)械結(jié)構(gòu)與實(shí)物圖

信號(hào)檢測(cè)模塊由控制板A和控制板B組成。LED驅(qū)動(dòng)電路、電刷控制電路以及電源供電電路組成控制板A；信號(hào)處理電路作為控制板B。將控制板A和信號(hào)處理電路隔離開(kāi)，可以有效避免電源不穩(wěn)定、溫度漂移導(dǎo)致信號(hào)處理不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。

傳感器的內(nèi)部結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)合理、簡(jiǎn)潔高效，方便安裝與固定，使傳感器更加適用于海水中葉綠素的檢測(cè)。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 動(dòng)態(tài)測(cè)量范圍

在實(shí)驗(yàn)室中，配置濃度梯度為:0.5μg/L、5μg/L、25μg/L、50μg/L、100μg/L、200μg/L的葉綠素標(biāo)準(zhǔn)溶液和空白(0μg/L)溶液。實(shí)驗(yàn)時(shí)，利用光學(xué)葉綠素傳感器去檢測(cè)不同濃度溶液的A/D值，每組濃度的電壓采樣15次卻平均值得到檢測(cè)數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)線性擬合，得到的葉綠素濃度曲線如圖12所示，得到的線性回歸方程為:y＝0.000 8x＋0.056 1，R2＝0.999 6，結(jié)果表明，在動(dòng)態(tài)測(cè)量范圍內(nèi)(0～200μg/L)該傳感器具有良好線性關(guān)系。

圖12 傳感器響應(yīng)測(cè)試結(jié)果

3.2 傳感器的檢出限和精密度

為了檢驗(yàn)該傳感器的性能，以人工海水為基礎(chǔ)，連續(xù)檢測(cè)空白溶液7次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，并以3SD作為傳感器的檢出限，由表1可知，檢測(cè)結(jié)果的標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.007 6，傳感器的檢出限為0.023μg/L。

表1 葉綠素傳感器的檢出限檢測(cè)數(shù)據(jù)

同時(shí)配置4μg/L、40μg/L、150μg/L三種不同濃度葉綠素標(biāo)準(zhǔn)溶液，利用葉綠素傳感器去檢測(cè)三種不同濃度的溶液，連續(xù)檢測(cè)7次，測(cè)量結(jié)果如表2所示。結(jié)果顯示，該傳感器的最大誤差在2μg/L以內(nèi)，在高中低三個(gè)濃度梯度的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.03%、0.08%、0.24%，顯示出良好的測(cè)量精密度。

表2 葉綠素傳感器實(shí)驗(yàn)誤差與精密度

3.3 碼頭比對(duì)測(cè)試

為了驗(yàn)證該葉綠素傳感器的可行性，將標(biāo)定完成的葉綠素傳感器與已檢定日本亞力克AAQ171傳感器，在青島中苑碼頭附近海域進(jìn)行對(duì)比測(cè)試，借助碼頭的浮標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)。在為期30天的現(xiàn)場(chǎng)實(shí)驗(yàn)期間，儀器工作狀態(tài)正常，信號(hào)傳輸穩(wěn)定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果如圖13所示。

圖13 30 d內(nèi)兩種傳感器實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的對(duì)比

由圖13得出，研制的葉綠素傳感器與日本亞力克AAQ171傳感器在海試試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)變化正常，且變化的動(dòng)態(tài)基本相同，具有良好的波動(dòng)相關(guān)度。圖14為兩組海試數(shù)據(jù)的比對(duì)測(cè)試，根據(jù)計(jì)算得到，其線性相關(guān)系數(shù)R＝0.824 8，表明兩組數(shù)據(jù)具有較大相關(guān)程度。

圖14 兩組數(shù)據(jù)對(duì)比測(cè)試

據(jù)此可以得到，在實(shí)際海水環(huán)境條件下，基于熒光原理研制的光學(xué)葉綠素傳感器具有較高的可靠性與準(zhǔn)確性，并且從穩(wěn)定性上來(lái)說(shuō)，要優(yōu)于日本亞力克AAQ171葉綠素傳感器。

4 結(jié)論

本文基于熒光檢測(cè)原理設(shè)計(jì)光學(xué)原位葉綠素傳感器，采用鎖相放大原理，通過(guò)對(duì)LED驅(qū)動(dòng)、I/V轉(zhuǎn)換放大、信號(hào)采集及處理等電路設(shè)計(jì)實(shí)現(xiàn)了對(duì)微弱熒光信號(hào)的提取與檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，設(shè)計(jì)的光學(xué)原位葉綠素傳感器可以準(zhǔn)確的檢測(cè)出水體中葉綠素的濃度，精度高，準(zhǔn)確度好，具有良好的抗干擾能力，適合浮標(biāo)、臺(tái)站等實(shí)時(shí)原位檢測(cè)，也可以將該葉綠素傳感器應(yīng)用于湖泊河流之中。對(duì)預(yù)防“綠潮”“赤潮”等自然災(zāi)害發(fā)生具有重要的意義。