微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞腸道微生物結(jié)構(gòu)菌群的影響

嵇宏杰，匡 偉，姚 遠(yuǎn)，何宗亮，伍冠鎖，羅奕秋，孫盼盼

（南京市畜牧家禽科學(xué)研究所，江蘇南京 210036）

目前，畜禽養(yǎng)殖逐步向規(guī)模化發(fā)展[1]。在畜禽養(yǎng)殖業(yè)中尋找抗生素有效的替代物已成為研究重點(diǎn)，腸道益生菌的開發(fā)研究成為當(dāng)前熱點(diǎn)[2]。飼料中添加微生態(tài)制劑可以提高飼料利用率[3]，減少糞尿中氮的排放，抑制有害氣體的產(chǎn)生，是實(shí)現(xiàn)源頭減排的有效手段[4]。在蛋雞的腸道中，存在多種微生物[5]，以往對(duì)蛋雞腸道微生物的研究主要有微生物培養(yǎng)和DGGE技術(shù)，這2種技術(shù)均有不足，因此高通量測(cè)序技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生。高通量測(cè)序技術(shù)能夠深入地觀察細(xì)菌多樣性。本試驗(yàn)中，通過對(duì)腸道菌群進(jìn)行高通量測(cè)序和分析，旨在研究微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞腸道微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，為蛋雞的健康養(yǎng)殖、提高腸道免疫能力、預(yù)防疾病發(fā)生以及微生態(tài)制劑的開發(fā)提供參考[6]。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)所用的微生態(tài)制劑由南京市福潤德有限公司生產(chǎn)，主要成分包括枯草芽孢桿菌（≥1×1012CFU/kg）、丁酸梭菌（≥1×1010CFU/kg）等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

選擇健康120日齡淮南麻黃雞，隨機(jī)分成4組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5只雞。各組依次添加0、0.5、1.0、2.0 g/kg的微生態(tài)制劑。基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平見表1。試驗(yàn)期為40 d。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營養(yǎng)水平Tab.1 Basal diet composition and nutritional level

試驗(yàn)在南京市畜牧家禽科學(xué)研究所種雞場(chǎng)進(jìn)行，蛋雞舍為全封閉，飼養(yǎng)模式為層疊式籠養(yǎng)。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

試驗(yàn)結(jié)束后，每組屠宰3只雞放血，取腸道（直腸和盲腸）食糜，送至南京市美吉生物公司進(jìn)行微生物群落多樣性分析。

選用引物Nobar 431F和Nobar 609R來擴(kuò)增的細(xì)菌，測(cè)序平臺(tái)為：Miseq2*300。

Miseq測(cè)序平臺(tái)先對(duì)序列質(zhì)量進(jìn)行質(zhì)控和過濾操作，然后進(jìn)行OUT聚類和物種分類學(xué)分析。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OUT代表序列進(jìn)行分類學(xué)分析，能夠顯示物種多樣性以及多組樣本之間的差異。在OUT聚類分析的基礎(chǔ)上利用MEGAN分析，能夠顯示每個(gè)層級(jí)上各樣本菌群豐度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Excel 2019軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)整理，采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，P＜0.05表示差異顯著。使用美吉生信云平臺(tái)對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 稀疏曲線與香農(nóng)指數(shù)（shannon）分析（見圖1、圖2）

通過處理使樣本序列長度不低于500 bp，以滿足數(shù)據(jù)分析的要求。圖1與圖2分別是樣本的稀疏分析圖與shannon指數(shù)分析圖（Z代表直腸組，M代表盲腸組），其中每條曲線代表1個(gè)樣本。

由圖1可知，樣本的稀疏曲線均未達(dá)到平臺(tái)期，表示隨著序列數(shù)增加相應(yīng)OUT數(shù)量也會(huì)增加。

圖1 48個(gè)試驗(yàn)樣品的稀釋曲線分析圖Fig.1 Analysis of dilution curve of 48 test samples

由圖2可知，shannon曲線趨平說明微生物多樣性已經(jīng)飽和。測(cè)序量增大或許會(huì)有新的種系，但多樣性已經(jīng)飽和，說明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量夠大，測(cè)序結(jié)果能夠充分反映微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞腸道菌群結(jié)構(gòu)的微生物物種信息。

圖2 48個(gè)試驗(yàn)樣品的shannon指數(shù)Fig.2 Shannon analysis of 48 test samples

2.2 Alpha多樣性分析（見表2~表4）

通過Alpha多樣性分析可以得到群落中物種豐度、覆蓋度和多樣性等信息。由表2可知，盲腸組腸道微生物Alpha多樣性不顯著，組間無顯著差異（P＞0.05）。

表2 微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞盲腸Alpha多樣性的影響Tab.2 Effect of microecological additives on Alpha diversity of the caecum of laying hens

由表3可知，Z1、Z2組腸道微生物shannon指數(shù)差異顯著（P＜0.05），其余組差異不顯著（P＞0.05）。

表3 微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞直腸Alpha多樣性的影響Tab.3 Effect of microecological additives on Alpha diversity of the rectum of laying hens

由 表4可知，M組與Z組在shannon、simpson、ace、chao、coverage上均存在顯著差異（P＜0.05）。

表4 腸道微生物Alpha多樣性Tab.4 Diversity alpha intestinal microflora

在蛋雞直腸和盲腸中，盲腸組shannon指數(shù)高，simpson指數(shù)低，表明微生態(tài)制劑對(duì)蛋雞盲腸微生物群落有影響，使其群落豐度增加，但對(duì)其菌群多樣性無影響。

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.3.1 微生態(tài)制劑對(duì)蛋雞腸道中微生物群落門水平上豐度變化的影響（見圖3、圖4、表5）

表5 微生態(tài)添加劑對(duì)腸道微生物群落在門水平上豐度的影響Tab.5 Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at the phylum level 單位：%

圖3 腸道微生物在門水平上的分度圖Fig.3 Phylum level division of intestinal microorganisms

圖4 腸道微生物在門水平上的熱圖Fig.4 Phylum level of intestinal microorganisms

由圖3可知，盲腸中，門水平優(yōu)勢(shì)微生物群落按其豐度排序?yàn)楹癖诰T（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）；直腸中，厚壁菌門（Firmicutes）為門水平的優(yōu)勢(shì)菌群。

由圖4可知，添加微生態(tài)制劑在蛋雞腸道中微生物群落豐度變化在門水平上主要有變形桿菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、綠彎菌門（Chlorcfiexi）、厭氧菌門（Halanaerobiaeota）、放線菌門（Actinobacteria）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、脫硫桿菌門(Desulfobacterota)、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、互養(yǎng)菌門（Synergistetes）等。

由表5可知，添加微生態(tài)制劑蛋雞腸道菌群在門水平上主要有：厚壁菌門（Firmicutes）、變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、疣微菌門（Verrucomicrobia）、放線菌門（Actinobacteria）和其他一些占比較少的細(xì)菌門類。

2.3.2 微生態(tài)制劑對(duì)蛋雞腸道中微生物群落科水平上豐度變化的影響（見圖5、圖6、表6）

圖5 腸道微生物在科水平上的分度圖Fig.5 Family level division of microorganisms

圖6 腸道微生物在科水平上的熱圖Fig.6 Family level thermogram of microorganisms

由圖5、圖6可知，毛螺菌科（22.55%~20.61%）和擬桿菌科（23.21%~18.62%）主要組成蛋雞腸道中的厚壁菌門。

由表6可知，叢毛單胞菌科（9.32%~2.56%）、莫拉菌科（4.71%~1.09%）和假單胞菌科（5.32%~4.01%）主要組成變形菌門。叢毛單胞菌科和莫拉菌科變化顯著（P＜0.05）；擬桿菌科（23.21%~18.62%）、紫單胞菌科（6.37%~4.58%）和理研菌科（3.98%~1.67%）主要組成擬桿菌門，其豐度有顯著變化（P＜0.05）；疣微菌科（26.31%~17.82%）主要組成疣微菌門，組間豐度有顯著變化（P＜0.05）。

表6 微生態(tài)添加劑對(duì)腸道微生物群落在科水平上豐度的影響Tab.6 Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at family level 單位：%

2.3.3 微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞腸道中微生物群落在屬水平上豐度變化的影響（見圖7、圖8、表7）

圖7 腸道微生物在屬水平上的分度圖Fig.7 Genus level of microecological additives

圖8 微生態(tài)添加劑腸道微生物在屬水平上的熱圖Fig.8 Genus level of heat map microorganisms

由圖7、圖8可知，擬桿菌屬（Bacteroides）和乳桿菌屬（Lactobacillus）是直腸和盲腸屬水平的優(yōu)勢(shì)菌群。

由表7可知，微生態(tài)制劑對(duì)蛋雞腸道微生物結(jié)構(gòu)菌群有顯著變化影響的菌屬有擬桿菌屬、不動(dòng)桿菌屬以及未分類的紫單胞菌賀叢毛單胞菌屬（P＜0.05）。此外還有很多分類位置未定（19.45%~16.31%）和目前數(shù)據(jù)庫里沒有信息的菌屬（24.17%~21.35%），說明微生態(tài)制劑對(duì)蛋雞腸道內(nèi)微生物菌群的影響還有待深入研究。

表7 微生態(tài)添加劑對(duì)腸道微生物群落屬水平上豐度的影響Tab.7 Effect of microecological additives on the abundance of intestinal microbial community at the level of genera 單位：%

3 討論

3.1 微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞腸道菌群在門水平上的影響

腸道微生物對(duì)蛋雞起著重要作用[7]。本研究通過對(duì)不同組的腸道食糜微生物進(jìn)行測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、變形菌門、擬桿菌門、疣微菌門和放線菌門是蛋雞腸道微生物群落在門水平上所含的細(xì)菌，與王偉唯[8]對(duì)蛋雞腸道功能的測(cè)序結(jié)果和徐家付[9]的研究中的檢測(cè)結(jié)果存在差異。王偉唯[8]研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上組成盲腸微生物有厚壁菌門（32.45%~47.86%）、變形菌門（3.28%~17.56%）、擬桿菌門（38.93%~12.54%）、疣微菌門（3.22%~1.04%）和未分類菌門（19.45%~28.37%）。徐家付[9]研究發(fā)現(xiàn)，在門水平上主要由厚壁菌門（51.06%~78.21%）、變形菌門（30.29%~49.32%）和疣微菌門（1.59%~18.75%）組成；對(duì)比這些數(shù)據(jù)在某些菌門豐度上有些許不同。此結(jié)果可能是由于不同地區(qū)的樣本在個(gè)體微生物上存在差異；不同品種和日齡的蛋雞也會(huì)出現(xiàn)這種差異[10]。

3.2 微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞腸道菌群在科和屬水平上的影響

在科和屬水平上，未知菌群的豐度最高可達(dá)19.45%和24.17%，表明當(dāng)前對(duì)蛋雞腸道微生物的研究還有待深入探討，很多細(xì)分的菌群還未被添加到數(shù)據(jù)庫中。在科和屬水平上毛螺旋菌科和瘤胃菌科的豐度很高，且在整個(gè)添加微生態(tài)制劑的試驗(yàn)中，在蛋雞腸道中基本保持恒定，與羅利龍[11]、石水琴[12]和刑爽[13]相關(guān)研究的數(shù)據(jù)基本相同。

從菌群的門、科、屬豐度熱圖聚類分析結(jié)果可知，蛋雞腸道內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的變化會(huì)隨著添加微生態(tài)制劑而變化，這與攝入的食物有關(guān)[14]。Alpha多樣性分析表明，隨著添加微生態(tài)制劑蛋雞腸道微生物多樣性會(huì)發(fā)生變化，但各種微生物之間無顯著差異，說明在給蛋雞添加微生態(tài)制劑的時(shí)候，蛋雞腸道微生物已經(jīng)完成定植[15]，但會(huì)隨著攝入食物發(fā)生改變[16]，與徐家付[9]的報(bào)道一致；但與楊梅梅[17]報(bào)道的腸道微生物群落多樣性隨著蛋雞腸道微生物結(jié)構(gòu)菌群添加微生態(tài)制劑趨于復(fù)雜的結(jié)果不一致。

本研究揭示了微生態(tài)添加劑對(duì)蛋雞腸道菌群在門、科、屬水平上的豐度情況，能夠?yàn)榈半u腸道疾病的防治和微生態(tài)制劑的開發(fā)提供參考。

4 結(jié)論

在本試驗(yàn)條件下，添加微生態(tài)制劑能夠提高腸道微生物的豐度，使梭菌族細(xì)菌豐度增加，不但可以更多地將有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化成機(jī)體必需的丙酸、乙酸和微量的丁酸，促進(jìn)雞的生長發(fā)育，增加體重；還可以預(yù)防雞感染沙門氏菌，促進(jìn)蛋雞健康生長。