古巴火烈鳥性別的鑒定

郭玉琦，劉 瀏，鄧麗玲，熊恒慶，吳 磊，陳 蓉，汪明權*

（1．武漢市動物園，湖北 武漢 430050；2．南京市紅山森林動物園，江蘇 南京 210028）

火烈鳥，又名紅鸛、紅鶴，屬于火烈鳥目，火烈鳥科，火烈鳥屬，共三屬六種，分別為大紅鸛（Phoenicopterus roseus）（古巴火烈鳥）、智利火烈鳥（Phoenicopterus chilensis）、加勒比海紅鸛（Phoenicopterus ruber）、小紅鸛（Phoeniconaias minor）、秘魯紅鸛（Phoenicoparrus jamesi）、安第斯紅鸛（Phoenicoparrus andinus）?；鹆银B外觀多呈火紅色、脖頸長而彎曲、體態(tài)優(yōu)美，深受人們喜愛?；鹆银B屬于非平胸類鳥，此類鳥不能從外觀上判斷雌雄，采用翻肛或者測定激素的方法困難較大，通常使用分子技術的手段鑒定性別。與哺乳動物不同，大多數(shù)鳥類的雌性染色體為ZW型，雄性染色體為ZZ型，因此既可以擴增W染色體上的特異序列，也可以比較Z、W上同源序列的差異。因此，擴增W染色體上特異性序列能夠區(qū)分鳥類動物的雌雄。使用較多的性別連鎖鑒定的基因主要有CHD基因和EE0.6序列。CHD基因基本上存在于所有非平胸類鳥類中，研究最為廣泛，擴增成功率最高[1]。EE0.6是在雞的W染色體上克隆的非傳統(tǒng)型基因，包含EcoR1片段和一段類似外顯子的序列ET15（很可能是一個假基因），由于其在W、Z染色體上有一段差異較大的同源序列，所以在很多鳥類性別鑒定中應用廣泛[2]。武漢動物園自引進火烈鳥后一直未能繁殖，為探究緣由，本試驗選取6對較為常用的鳥類性別鑒定引物，對武漢動物園未知性別的54只火烈鳥進行鑒定，并測試不同的反應條件和引物組也可以應用到其他鳥類的性別鑒定上，同時為武漢動物園火烈鳥的飼養(yǎng)管理和繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

54只來自武漢動物園未知性別的火烈鳥血樣；3只已知性別的南京紅山森林動物園的火烈鳥血樣。

1.2 儀器與試劑

臺式離心機（MIKRO）、PCR儀（AppliedBiosystem）、電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、紫外分析儀（BIORAD）、DNA測序儀ABI3730（AppliedBiosystem）、磁珠純化儀（Thermo）、分光光度計（Thermo）。

2×TaqPCRMasterMix（天一輝遠生物科技公司）、PCR板（AXYGEN）、磁珠法口腔拭子基因組提取試劑盒（武漢納磁生物科技公司）、Big Dye染料（AppliedBiosystem）、磁珠法PCR產(chǎn)物回收試劑盒（英芮城生化科技公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 血樣DNA的提取

血樣收集到EDTA抗凝管中，加入200μL組織消化液GHA和20μL ProteinaseK。采用武漢納磁生物科技磁珠法提取試劑盒提取血液中的DNA，產(chǎn)物經(jīng)檢測，OD值均在1.8~2.0之間，符合后續(xù)試驗要求，DNA于4℃保存。

1.3.2 引物設計

采用鳥類通用的CHD基因引物對2550F/2718R、P2/P8；3007F/3112R及EE0.6基因3對引物SINT-F/SINT-R、USP1-F/USP1-R、CPE15F/CPE15R[1-2]，引物設計見表1。對武漢動物園未知性別的54只火烈鳥和南京紅山森林動物園已知性別的3只火烈鳥DNA進行特異性擴增。

表1 引物設計Tab1 Primers design

1.3.3 PCR擴增體系

反應體系為2×PowerTaqPCRMasterMix 15μL、DNA 1μg、上下游引物各1μL、ddH2O 12μL，總體積為30μL。反應條件為95℃預變性5 min；94℃變性50 s、51.5℃退火50 s、72℃延伸50 s，循環(huán)35次；72℃末端延伸4 min，4℃保存。

1.3.4 PCR產(chǎn)物檢測

采用1%的瓊脂糖凝膠對樣品進行檢測，于凝膠成像分析儀中進行拍照，對得到的結果進行分析。

2 結果與分析

2.1 2550F/2718R引物擴增武漢和南京的火烈鳥的DNA結果（見圖1、圖2）

圖1 武漢動物園54只火烈鳥電泳圖（2550F/2718R）Fig.1 Electrophoresis of 54 flamingos in Wuhan zoo(2550F/2718R)

圖2 南京紅山森林動物園已知性別的火烈鳥電泳圖（2550F/2718R）Fig.2 Electrophoresis of known sexes flamingos in Nanjing zoo(2550F/2718R)

由圖1可知，Lane2、4、5、8、12、13、24、26、28、32、33、35、37、39、41、49、51、54均出現(xiàn)2條帶，分別在500~750 bp和400~500 bp；其他樣品只出現(xiàn)1條帶，在500~750 bp，可以預判出現(xiàn)兩條帶的18只火烈鳥為雌性，只有一條帶的36只火烈鳥為雄性，但是需要已知性別的火烈鳥進行驗證，故向南京紅山森林動物園借用3只已知性別的火烈鳥血樣進行驗證。

由圖2可知，lane1表示南京紅山森林動物園的雄性火烈鳥經(jīng)CHD基因引物（2550F/2718R）擴增結果，只有一個條帶，在500~750 bp，lane2和3代表其雌性火烈鳥擴增結果，出現(xiàn)了兩條帶，分別在500~750 bp和400~500 bp，說明不同性別的火烈鳥在CHD基因特異性引物對的擴增下的確出現(xiàn)了不同條帶，條帶大小也和武漢動物園54只火烈鳥電泳的條帶大小一致，驗證了圖1預判的結果準確，故武漢動物園有18只雌性火烈鳥，36只雄性火烈鳥，雌雄比為1∶2。

2.2 多重PCR結果（見圖3、圖4）

采用多重PCR將兩對引物同時加入反應體系中，圖3代表了混合SINT-F/SINT-R、USP1/USP3兩對引物PCR擴增結果。由圖3可知，雌性火烈鳥中出現(xiàn)了兩條帶，在450 bp和200 bp，雄性火烈鳥僅在200 bp的位置有一條帶。

圖3 混合SINT-F/SINT-R、USP1/USP3兩對引物后武漢動物園火烈鳥電泳圖Fig.3 Electrophoresis of flamingo in Wuhan zoo after mixing SINT-F/SINT-R and USP1/USP3 primers

由圖4可知，所有的火烈鳥經(jīng)USP1/USP3、CPE15F/CPE15R兩對引物擴增后基本上均出現(xiàn)兩條帶，但雌性火烈鳥的300 bp左右的條帶更加明亮，雄性火烈鳥的300 bp的條帶較暗，均在250 bp左右出現(xiàn)了第二條帶。

圖4 混合USP1/USP3、CPE15F/CPE15R兩對引物后武漢動物園火烈鳥電泳圖Fig.4 Electrophoresis of flamingo in Wuhan zoo after mixing USP1/USP3 and CPE15F/CPE15R primers

2.3 P2和P8、3007F和3112R以及EE0.6基因3對引物擴增火烈鳥DNA

5對引物單獨對火烈鳥DNA進行擴增，并未出現(xiàn)雌性火烈鳥兩條帶，雄性火烈鳥一條帶的結果，不能通過該結果判斷雌雄。

3 討論

本次試驗采用的引物對2550F/2718R是擴增CHD基因上的特異性片段，在非平胸目鳥類的性別鑒定中應用較廣，方法也較為成熟。1996年，Griffiths等[1]首次發(fā)現(xiàn)在非平胸目鳥類中均含有CHD-W基因，由于CHD-Z、CHD-W基因中外顯子相同，但內(nèi)含子大小不同，根據(jù)這一原理能夠準確鑒定鳥類的性別。擴增后雌性有2條帶、雄性為1條帶。胡銳穎等[3]采用2550F/2718R鑒定了9種86只國家一級保護鳥類的性別；陳蓉等[4]鑒定了南京紅山森林動物園中的美洲紅鹮和火烈鳥的性別。結合本試驗和其他人研究結果，推測2550F/2718R引物可以大量使用在國內(nèi)大多數(shù)珍稀鳥類的性別鑒定中，如火烈鳥、丹頂鶴、白鶴、東方白鸛等，后續(xù)也會繼續(xù)使用該引物和已經(jīng)成功摸索出的PCR條件來鑒定其他珍稀鳥類的性別，如美洲紅鹮、白骨頂雞、鵜鶘等，可以提高鳥類性別鑒定的效率。

另外，還有很多引物也能鑒定鳥類性別，如CHD基因上的P2/P8、3007F/3112R，EE0.6序列上的3對引物（SINTF/SINTR、USP1/USP3、CPE15F/CPE15R）也曾成功鑒定多種鳥類的性別[1,5-8]。本試驗選用剩下5種引物進行試驗，結果發(fā)現(xiàn)，除2550F/2718R引物能夠準確鑒別火烈鳥性別以外，其他5種引物對的電泳結果無法判定本園古巴火烈鳥的性別，與其他文獻中的結果不一致。此結果可能因為P2/P8這對引物更多試驗成功在雞、海鷗和金剛鸚鵡上[9-10]，而黑美洲鷲、烏鴉上只出現(xiàn)一條帶，雌雄鳥的電泳條帶出現(xiàn)在不同的位置；3007F/3112R在白鹡鸰和白頭翁兩種鳥類上也未能鑒定性別，雌雄均在同樣的位置出現(xiàn)條帶，僅在山雀上區(qū)別了雌雄，出現(xiàn)了兩條帶[10]。上述研究結果表明，這兩對引物在擴增不同物種的性染色體時，擴增出來的片段不一定具有特異性，有的雌雄片段大小相似，而有的鳥類雌雄片段無同源性。因此，是否能將P2/P8、3007F/3112R應用于鑒定武漢動物園其他珍稀鳥類的性別，需要進一步試驗研究。

陳武等[11]使用CPE15F/CPE15R和AWS03/USP3擴增丹頂鶴的EE0.6序列，成功鑒定了丹頂鶴的性別；Owaga[2]成功使用EE0.6基因上的引物鑒定了11種鳥類的性別，但對于雌性的相思鸚鵡和王企鵝卻無法擴增出兩條帶，說明單對引物擴增EE0.6序列存在操作缺陷，無法準確判斷鳥類的性別，因此選擇合適的引物組合較為關鍵[12]。本試驗中，對EE0.6基因上的3對引物對采用多重PCR的方法，結果顯示，SINT-F/SINT-R、USP1/USP3擴增出來的結果與預期一致，表明有18只雌性和36只雄性，條帶分別在450 bp和200 bp，與李文斌等[12]結果較相似，但采用USP1/USP3、CPE15F/CPE15R兩對引物擴增目的基因后，所有火烈鳥均出現(xiàn)了兩條帶，雖然亮度不一樣，但無法說明性別之分，與李文斌的結果有差異。考慮到胡銳穎等[3]使用EE0.6序列上的引物擴增出來的結果與我園火烈鳥擴增出來的結果一致，因此不同物種不會影響結果。多重PCR對我園火烈鳥或是其他珍稀鳥類性別鑒定上的應用還需進一步的研究。

除了采血可以提取DNA，鑒定性別外，還可以通過羽毛來提取DNA。拔羽的時候需要獲取帶毛囊的羽毛，提取DNA的量不如血樣提取的量大，但刺激較小，適用于美洲紅鹮等應激性較強的鳥類，也適合晚成雛鳥在早期的鑒定性別[13]。故需要根據(jù)不同的情形使用不同的采樣方法。

武漢動物園在2012年和2013年引進火烈鳥以后，一直未有成功繁殖的記錄，僅在2019年7~8月份下了11枚蛋，但全部為未受精蛋。我園在火烈鳥的繁殖問題上一直未有突破。本試驗初次鑒定了武漢動物園火烈鳥的性別，結果表明，雄性火烈鳥遠大于雌性，雌雄比為1∶2?；鹆银B是一夫一妻制的配對形式[14]，可能出現(xiàn)繁殖期未配對的火烈鳥對配對成功的火烈鳥夫妻進行干擾，或者打架爭執(zhí)，影響火烈鳥的整個繁殖季節(jié)[15-16]。后續(xù)會考慮隔離體重小、活力不強的雄性火烈鳥，使其雌雄比為1∶1，改善它們的配對環(huán)境，并在后續(xù)的研究中試圖引進人工翻肛采精和授精的技術，突破我園火烈鳥多年的繁殖困難。

4 結論

本研究采用分子技術的手段，使用CHD基因上的引物對2550F/2718R成功鑒定了武漢動物園火烈鳥的性別，并用南京紅山森林動物園的已知性別火烈鳥進行驗證，結果表明，我園共有18只雌性和36只雄性火烈鳥，雌雄比為1∶2，采用多重PCR的方法發(fā)現(xiàn)混合SINT-F/SINT-R、USP1/USP3兩對引物能夠鑒定出火烈鳥的性別。