氨基酸發(fā)酵尾液菌體蛋白的高效提取

徐太海，趙蘭坤，孫欽波，王小平，劉世周，李紫璇

（1．大慶師范學(xué)院，黑龍江 大慶 163712；2．黑龍江省油田應(yīng)用化學(xué)與技術(shù)重點實驗室，黑龍江 大慶 163712；3．呼倫貝爾東北阜豐生物科技有限公司，內(nèi)蒙古 呼倫貝爾 162650）

氨基酸生產(chǎn)企業(yè)提取了必要的氨基酸后，產(chǎn)生大量的發(fā)酵尾液，氨基酸廢水直接排放會嚴(yán)重污染環(huán)境，如何經(jīng)濟(jì)有效地處理尾液是眾多氨基酸生產(chǎn)廠家所面臨的重要問題[1]。發(fā)酵尾液中含有大量的菌體蛋白等營養(yǎng)物質(zhì)，菌體蛋白占氨基酸廢水中有機(jī)成分的30%~40%。如果可以高效回收廢液中的谷氨酸菌體蛋白，不僅可以物盡其用，還可減輕對環(huán)境的污染[2]。

目前，氨基酸尾液中菌體蛋白的提取主要有以下幾種方法。碟片分離技術(shù)主要是使用碟片分離機(jī)來分離混合物質(zhì)[3]，轉(zhuǎn)鼓內(nèi)有一組互相套疊在一起的碟形零件——碟片[4]，碟片可提高沉降速度[5]。超濾法主要是指利用半透膜的微孔結(jié)構(gòu)，在一定外界壓力的作用下，使水中的一些物質(zhì)透過膜，從而實現(xiàn)對物質(zhì)的選擇性分離、回收的膜分離方法。體積相對膜表面微孔徑較大的物質(zhì)會被截留下來成為濃縮液，從而實現(xiàn)提取的目的[6]。膜分離技術(shù)除了能分離固體的溶質(zhì)以外，也可以對溶液中溶解的氣體進(jìn)行分離[7]，常用的超濾膜種類有聚砜膜等[8]。超濾法單位體積內(nèi)有效膜面積較小、膜要求較高，一般需要做在無紡布上以增加其機(jī)械性能[9]。絮凝沉淀法在提取濃縮液中加入絮凝沉淀劑以吸附架橋和電中和方式與蛋白果膠等發(fā)生分子間相互作用，使之沉降，除去溶液中的粗粒子已達(dá)到分離的效果[10]。由于碟片分離法其耗能高，超濾法的成本較高，很少在大型工廠使用，因此絮凝沉淀法去除菌體蛋白是目前大多數(shù)工廠選擇的方式。廢水中含有的有機(jī)化合物是厭氧微生物、兼性厭氧菌等需要處理的主要對象[11]。厭氧微生物將工業(yè)廢水中的有機(jī)物轉(zhuǎn)變成無機(jī)物以及少量細(xì)胞物質(zhì)[12]。由于厭氧生物技術(shù)對環(huán)境條件有著較高要求，單獨厭氧生物技術(shù)處理工業(yè)廢水還難以有效推廣，應(yīng)積極與其他工藝技術(shù)結(jié)合起來應(yīng)用[13]。

綜上所述，絮凝沉淀法是最常用的菌體蛋白提取方法，工業(yè)上大多數(shù)使用聚丙烯酸鈉。合成有機(jī)高分子絮凝劑具有用量小、絮凝能力強(qiáng)、沉淀速度快等優(yōu)點，在水處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[14]。影響絮凝沉淀效果的因素有很多，如pH值過高或過低都會影響菌體蛋白的提取[15]，過高或過低的旋轉(zhuǎn)速度也會使絮凝效果受到一定的影響[16]。本研究主要是對絮凝沉淀法的3個影響因素進(jìn)行探索，通過改變其熱維持時間、加熱溫度以及攪拌時間3個因素條件，檢測其蛋白收率，確定提取菌體蛋白的最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

谷氨酸高濃度尾液由呼倫貝爾東北阜豐生物科技有限公司提供。

試驗所用儀器見表1。

表1 試驗儀器Tab.1 Experimental apparatus

1.2 試驗方法

從車間提取發(fā)酵尾液正常生產(chǎn)時物料的pH值3.0~4.0，調(diào)節(jié)來水料液與儲存罐料液的pH值應(yīng)該在3.0~4.5之間，對存儲罐里高段濃污和低段濃污進(jìn)行調(diào)節(jié)，主要是為了調(diào)節(jié)pH值，防止pH值過高或過低；另外還要檢查用藥量情況。將化藥罐溫度控制在40~60℃，提取菌體蛋白時要控制噴射器的溫度在40~60℃[17]。單因素試驗設(shè)計如下：

（1）熱維持時間。

將加熱維持時間分為5、10、15、20、25 min，觀察上清液的透光度及其在10 min內(nèi)過濾液的體積，并記錄數(shù)據(jù)。

（2）加熱溫度。

控制菌體蛋白的溫度分別為40、45、50、55、60℃，在絮凝劑的濃度為2‰下進(jìn)行，溫度梯度差為5℃的試驗。觀察菌體變性絮凝效果，記錄數(shù)據(jù)。

（3）攪拌時間。

在溫度控制在50℃，絮凝劑濃度控制在2‰的條件下，分別使攪拌時間為3、6、9、12、15 min進(jìn)行絮凝沉淀，觀察菌體變性絮凝效果，記錄數(shù)據(jù)。

將處理后的發(fā)酵尾液進(jìn)行過濾，將濕蛋白放入烘箱內(nèi)進(jìn)行烘干，等待測量計算。

計算蛋白回收率，以每個單因素的最適水平左右兩側(cè)各選一水平并記錄[18]，菌體蛋白回收率計算公式如下：

菌體蛋白收率=干菌體重量/發(fā)酵廢液中菌體蛋白重量×100% （1）

將記錄好的數(shù)據(jù)整理后進(jìn)行整體分析，再結(jié)合單因素試驗結(jié)果，進(jìn)行L9（34）正交試驗，選擇最優(yōu)組合。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗結(jié)果

2.1.1 熱維持時間對菌體蛋白分離和過濾效果的影響（見表2）

由表2可知，隨著加熱時間的逐漸延長，上清液的透光度及其過濾的效果越好。在20 min時，雖然上清液的透光度依舊上升，但是其過濾體積有很明顯的下降趨勢；在25 min時，上清液透光度和過濾體積均有所下降。過濾體積越大說明有越多的菌體蛋白絮凝沉淀。過濾體積變小，說明菌體蛋白呈流動絮狀，有可能是加熱時間過長，使原本已經(jīng)形成的絮凝團(tuán)溶解開，與水溶液混合在一起，無法形成絮凝團(tuán)，水與流動狀態(tài)的菌體蛋白難以分離，因此過濾出來的體積少。由此可知，加熱時間在15 min時，上清液的澄清度及其過濾效果最好。因此，取其左右兩邊水平分別為10、15、20 min進(jìn)行正交試驗。

表2 熱維持時間對菌體蛋白分離和過濾效果的影響Tab.2 Influence of heat maintenance time on isolation and filtration effect of thallus protein

2.1.2 加熱溫度對菌體蛋白分離的影響（見表3）

由表3可知，在固定絮凝劑的濃度為2‰下，當(dāng)溫度為40、45℃時，絮凝體積松散，絮凝效果差。當(dāng)提取菌體蛋白的溫度達(dá)到50、55、60℃時，絮凝效果開始有明顯變化，絮凝團(tuán)開始變得大且結(jié)實，絮凝效果好，蛋白收率分別為7.54、7.32及6.93 g/L。由此可知，加熱溫度在50℃時，絮凝效果最好，取其左右兩邊水平分別為45、50、55℃進(jìn)行正交試驗。

表3 加熱溫度對菌體蛋白分離的影響Tab.3 Influence of heating temperature on isolation of thallus protein

2.1.3 攪拌時間對菌體蛋白分離的影響（見表4）

由表4可知，隨著攪拌時間的逐漸延長，絮凝體積開始逐漸由松散變得結(jié)實，絮凝團(tuán)由小變大，蛋白提取率也逐漸增大。但是，當(dāng)攪拌時間達(dá)到12 min時，絮凝體積開始變得松散，絮凝效果差，絮凝團(tuán)開始由大變小，蛋白提取率也開始下降。由此可知，攪拌時間在9 min的時候菌體變性絮凝狀況最好，蛋白收率也最高。因此，取其左右兩邊的水平分別為6、9、12 min進(jìn)行正交試驗。

表4 攪拌時間對菌體蛋白分離的影響Tab.4 Influence of stirring time on isolation of thallus protein

2.2 正交試驗結(jié)果（見表5、表6）

表5 菌體蛋白提取的因素與水平Tab.5 Factors and levels of bacterial protein extraction

表6 菌體蛋白提取影響因素的正交試驗結(jié)果Tab.6 Orthogonal test results of factors affecting bacterial protein extraction

由表6可知，各組試驗結(jié)果數(shù)據(jù)相差不大，蛋白提取率最大為7.29 g/L，最小為6.86 g/L，故選擇極差分析法。影響蛋白收率的因素主次順序為：熱維持時間、攪拌時間、加熱溫度（溫度過低的絮凝效果較差，超過45℃直到55℃，絮凝效果變化不大甚至有所降低）。試驗得出的優(yōu)水平為A2B1C3，但是從表中可以看出，C3與C2相差很小。綜合企業(yè)實際情況以及對能源節(jié)約的方面考慮選擇C2，從而可以得出最優(yōu)組合是A2B1C2。

3 結(jié)論

當(dāng)熱維持時間15 min、加熱溫度45℃、攪拌時間9 min時，菌體蛋白的收率最高。