半日花屬片段化居群的遺傳現(xiàn)狀及保護(hù)啟示

蘇志豪，卓 立，姜小龍，公延明

(1.中國(guó)科學(xué)院新疆生態(tài)與地理研究所干旱區(qū)生物地理與生物資源重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊 830011; 2.新疆師范大學(xué)圖書館，新疆 烏魯木齊 830011; 3.中南林業(yè)科技大學(xué)林木遺傳育種實(shí)驗(yàn)室，湖南 長(zhǎng)沙 410004)

半日花屬(Helianthemum)為半日花科旱生小灌木，是古地中海植物區(qū)系孑遺種，其主要分布于新疆伊犁河谷的伊寧、鞏留、特克斯、博樂等地，在內(nèi)蒙古主要分布于鄂爾多斯西部的桌子山山麓地區(qū)。半日花屬呈島狀殘遺分布，主要生長(zhǎng)于海拔1 000～1 400 m的荒漠石質(zhì)殘丘坡地上，株高10～15 cm，叢幅大約20 cm，結(jié)構(gòu)緊密，呈灰綠色團(tuán)狀，具有較高的園藝觀賞價(jià)值，在西北地區(qū)常用作庭園栽培觀賞植物，并且能適應(yīng)極度干旱生境，也是用于干旱草原和礫質(zhì)荒漠防風(fēng)固沙的優(yōu)良物種[4]。據(jù)早期植物志記載，分布于內(nèi)蒙古的半日花和新疆的半日花被視為同一種(HelianthemumsongaricumSchrenk)[1]。趙一之等根據(jù)染色體數(shù)目以花的外部形態(tài)、花粉形態(tài)的差異將分布于內(nèi)蒙古的半日花居群獨(dú)立成為一個(gè)新種——鄂爾多斯半日花(HelianthemumordosicumY.Z.Zhao, Z.Y.Zhu, et R.Cao)，并認(rèn)為內(nèi)蒙古的鄂爾多斯半日花是由準(zhǔn)噶爾半日花(H.songaricum)進(jìn)化衍化而來(lái)[2]。本文前期用葉綠體測(cè)序，驗(yàn)證了新疆伊犁地區(qū)與內(nèi)蒙古地區(qū)的半日花居群存在顯著的遺傳分歧，研究結(jié)果支持趙一之先生等人將內(nèi)蒙古半日花(H.ordosicum)獨(dú)立成新種鄂爾多斯半日花的觀點(diǎn)[3]。

半日花屬目前分布面積十分狹小，由于開礦、樵采、放牧等人類活動(dòng)過(guò)度干擾，導(dǎo)致其生境極度破碎化，居群數(shù)量急劇減少，生長(zhǎng)發(fā)育和繁殖受到限制，實(shí)生苗日趨減少，天然更新日趨惡化[5]。半日花屬已被列入中國(guó)生物多樣性保護(hù)行動(dòng)計(jì)劃植物種優(yōu)先保護(hù)名錄，為國(guó)家二級(jí)保護(hù)植物[6]。如果不采取積極有效的保護(hù)措施，很有可能造成這一優(yōu)良防風(fēng)固沙物種遺傳多樣性及遺傳種質(zhì)的迅速丟失，致使其難以適應(yīng)未來(lái)氣候環(huán)境變化，使種群從目前的漸危逐步走向滅絕。瀕危植物有效的保護(hù)措施以準(zhǔn)確的系統(tǒng)學(xué)分類以及掌握遺傳學(xué)基本信息為前提。由于前期使用葉綠體基因片段數(shù)量少，獲得的變異位點(diǎn)數(shù)量有限，對(duì)于半日花屬下物種的遺傳特征并未準(zhǔn)確掌握，且半日花屬系統(tǒng)分類缺乏核DNA數(shù)據(jù)，因此，半日花屬的分類及遺傳特征的研究需要結(jié)合更多的葉綠體信息位點(diǎn)、核基因位點(diǎn)來(lái)進(jìn)一步進(jìn)行闡述。葉綠體微衛(wèi)星(cpSSRs)技術(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果多態(tài)性高，穩(wěn)定可靠，重復(fù)性好，廣泛應(yīng)用于居群遺傳學(xué)研究中[7-9]，結(jié)合雙親遺傳的核DNA標(biāo)記，將會(huì)為物種進(jìn)化歷程的研究提供更多遺傳學(xué)信息[10]。本文用葉綠體微衛(wèi)星及ITS序列研究半日花屬遺傳結(jié)構(gòu)，探討分布于內(nèi)蒙古西鄂爾多斯的半日花居群是否代表新的分類單元H.ordosicum以及半日花屬下兩個(gè)種的遺傳結(jié)構(gòu)現(xiàn)狀，以期為半日花屬遺傳保護(hù)提供啟示。

1 材料與方法

1.1 材料

本研究根據(jù)標(biāo)本館標(biāo)本信息記載(Chines Virtual Herbarium)、科研報(bào)告、科研論文，2010—2014年搜集了半日花屬在新疆伊犁河谷、準(zhǔn)噶爾盆地及內(nèi)蒙古西鄂爾多斯的分布信息，共采集到半日花屬15個(gè)居群，其中伊犁河谷8個(gè)(1～8)，準(zhǔn)噶爾盆地博樂1個(gè)(9)，內(nèi)蒙古西鄂爾多斯6個(gè)(表1，圖1)。

表1 半日花屬居群采集地位置及遺傳變異分布

圖1 半日花屬居群采集地位置分布

野外采集點(diǎn)的經(jīng)緯度、海拔高度用GPS定位儀記錄。每個(gè)植株個(gè)體采集新鮮葉片，用硅膠保存，存4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 研究方法

本實(shí)驗(yàn)葉片DNA的提取采用改進(jìn)的2 × CTAB法[11]。提取到的總DNA純度與濃度用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)。葉綠體微衛(wèi)星引物參考Soubani等發(fā)表的半日花屬3個(gè)葉綠體微衛(wèi)星多態(tài)性引物mtrnSf-trnGr，mtrnL2-trnF和mtrnL5-trnL3[12]，ITS2序列參考Sun等研究所用引物[13]。本實(shí)驗(yàn)PCR體系為25 μL，其中包括25 ng DNA模板，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L dNTPs，10 mmol/L Tris-HCl，50 mmol/L KCl，0.5 unit Taq酶，5 μmol/L雙向引物。葉綠體微衛(wèi)星PCR反應(yīng)程序如下：95 ℃ 4 min；30個(gè)循環(huán)(92 ℃ 45 s，57 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)；72 ℃延伸10 min；ITS2序列PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min；35個(gè)循環(huán)(94 ℃ 30 s，52 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min)；72 ℃延伸8 min。PCR反應(yīng)在PTC-100 DNA上進(jìn)行。葉綠體微衛(wèi)星PCR產(chǎn)物在測(cè)序儀ABI 3730XL上分離，片段大小在軟件Geneious 7.0[14]上分析；ITS2序列用SEQUENCHER 4.8(Gene Codes,Ann Arbor,MI,USA)編輯，用CLUSTALW軟件排列[15]，手工校正。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)于每個(gè)葉綠體衛(wèi)星引物所得到片段，按大小排列并組合得到最終單倍型變異。成對(duì)居群間遺傳距離(FST)用軟件GenAlEx 6.5計(jì)算[16]。根據(jù)此遺傳距離，進(jìn)行分子方差分析，計(jì)算遺傳變異在居群內(nèi)以及居群間的分配比例，采用10 000次置換進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)[16]。利用居群成對(duì)遺傳距離，在軟件MEGA 6中用UPGMA法構(gòu)建居群間親緣關(guān)系樹狀圖[17]。

2 結(jié)果與分析

2.1 等位基因和ITS序列分析

3個(gè)葉綠體微衛(wèi)星標(biāo)記共檢出13個(gè)多態(tài)信息位點(diǎn)，其中mtrnSf-trnGr 3個(gè)信息位點(diǎn)(133,134,135)，mtrnL2-trnF 4個(gè)信息位點(diǎn)(219,222,223,224)，mtrnL5-trnL3 6個(gè)信息位點(diǎn)(238,239,240,242,243,244)。將信息位點(diǎn)組合起來(lái)，154個(gè)個(gè)體共得到9個(gè)單倍型(H1～H9)。ITS2序列排列后長(zhǎng)度為449 bp,在173 bp處發(fā)現(xiàn)一個(gè)替代信息位點(diǎn)(G/T)，在15個(gè)居群116個(gè)個(gè)體中，共有兩個(gè)核基因型(A和B)被檢測(cè)出。

2.2 遺傳變異地理分布

半日花屬9個(gè)單倍型中，H1～H4只分布于新疆地區(qū)，H5～H9只分布于內(nèi)蒙古地區(qū)。在新疆地區(qū)9個(gè)居群中，單倍型H1廣布于其中的6個(gè)居群，分別是居群JMC，HST，KKS，ZYC，KB，KLBL；單倍型H2只分布于居群JMC中；單倍型H3分布于伊犁河谷的居群LK以及河谷北部的居群BL；單倍型H4只分布于伊犁河谷的居群BSD。在內(nèi)蒙古西鄂爾多斯6個(gè)居群中，單倍型H5、H6廣布于所有的居群，單倍型H7、H8只分布于居群KBQ，單倍型H9 只分布于居群QPJ。核基因型A只分布于新疆地區(qū)，核基因型B只分布于內(nèi)蒙古西鄂爾多斯高原(圖2)。

圖2 半日花屬葉綠體單倍型及核基因型地理分布

2.3 遺傳結(jié)構(gòu)

在UPGMA樹中，半日花屬居群分為兩個(gè)大分支，新疆的居群聚為一支，內(nèi)蒙古的居群聚為一支。新疆的9個(gè)居群被分為兩大分支：分支1包括居群HST，KKS，ZYC，KB，KLBL，JMC；分支2由兩個(gè)內(nèi)在分支構(gòu)成，一個(gè)包括居群BL和LK，另一個(gè)包括居群BSD。內(nèi)蒙古的居群也被分為兩大分支，一支為KBQ，另一支為QPJ，HN，QLS，MX，QLG(圖3)。

圖3 UPGMA法構(gòu)建的半日花屬居群親緣關(guān)系

分子方差分析表明，半日花屬79%(p<0.001)的遺傳變異發(fā)生于群體間，只有21%的遺傳變異發(fā)生于居群內(nèi)部；將所有居群按地理區(qū)域劃分，67%的遺傳變異發(fā)生于地區(qū)間；在新疆地區(qū)，93%的遺傳變異發(fā)生于居群間；在內(nèi)蒙古地區(qū)，22%的遺傳變異發(fā)生于居群間(圖4)。

圖4 半日花屬分子方差分析

3 討論

3.1 新疆地區(qū)與內(nèi)蒙古地區(qū)半日花居群的遺傳分歧

核基因型與葉綠體單倍型數(shù)據(jù)均表明，新疆地區(qū)的半日花居群與內(nèi)蒙古地區(qū)的半日花居群發(fā)生了明顯的遺傳分歧。半日花屬內(nèi)兩個(gè)區(qū)分明顯的血統(tǒng)分支澄清了長(zhǎng)期以來(lái)半日花屬下分類模糊的問題，支持趙一之先生等人的將內(nèi)蒙古半日花居群獨(dú)立成新種鄂爾多斯半日花的觀點(diǎn)。在早第三紀(jì)，我國(guó)西北荒漠地區(qū)地形、氣候與現(xiàn)今相比，區(qū)別很大。古地中海植物區(qū)系的一些物種，如半日花，可能沿著古地中海遺跡，經(jīng)河西走廊，擴(kuò)散到阿拉善荒漠[18-19]。在晚第三紀(jì)，伴隨青藏高原的隆起，西北地區(qū)氣候變得干旱[20-21]。進(jìn)入第四紀(jì)，北半球冰川開始發(fā)育，寒冷氣候在0.6～0.8 Ma到達(dá)極點(diǎn)[22]。在氣候劇烈變化過(guò)程中，西北地區(qū)很多植物物種正在逐漸滅絕消失[25]。氣候的劇變可能使得分布于河西走廊的半日花居群滅絕，導(dǎo)致半日花居群在新疆、內(nèi)蒙古地區(qū)呈間斷分布。半日花單倍型網(wǎng)狀圖可以支持這一假設(shè)，圖中新疆、內(nèi)蒙古兩地區(qū)單倍型由若干個(gè)缺失單倍型相聯(lián)結(jié)。半日花居群在河西走廊地區(qū)的缺失造成兩地區(qū)的基因流中斷。此外，兩地區(qū)雖同屬西部干旱區(qū)，但氣候差異明顯。伊犁河谷同中亞相聯(lián)結(jié)，氣候與中亞相似，夏季炎熱干旱，冬季溫和濕潤(rùn)，而內(nèi)蒙古西鄂爾多斯屬典型荒漠干旱氣候[23]。兩地區(qū)不同氣候可能孕育不同的遺傳變異，可能是其顯著遺傳差異的另一重要因素。

3.2 半日花屬遺傳結(jié)構(gòu)

葉綠體微衛(wèi)星數(shù)據(jù)表明準(zhǔn)噶爾半日花居群間發(fā)生了顯著的遺傳分歧，鄂爾多斯半日花居群間也發(fā)生了一定程度的遺傳分歧。分子方差、居群親緣關(guān)系UPGMA樹也支持兩物種種下居群間的遺傳分歧。居群親緣關(guān)系UPGMA樹均表明，準(zhǔn)噶爾半日花居群BL，LK和BSD顯著地區(qū)別于該地區(qū)其他居群；鄂爾多斯半日花居群KBQ顯著地區(qū)別于該地區(qū)其他居群。新疆、內(nèi)蒙地區(qū)半日花屬下物種顯著的遺傳分歧與多重因素相關(guān)。(1)半日花產(chǎn)種率低。在胚和胚乳的發(fā)育過(guò)程中存在多種異常現(xiàn)象。例如，有些發(fā)育正常胚乳找不到胚；有些胚在多細(xì)胞原胚階段后停止分化；大多數(shù)胚珠沒有授精；正常發(fā)育胚珠少，使得產(chǎn)種率極低從而傳播能力十分有限[24]。此外，在干旱的氣候條件下，半日花種子萌發(fā)率很低[24-25]。(2)半日花居群生境呈破碎化。伊犁河谷被不同走向的山脈分為大小不等河谷[26]，準(zhǔn)噶爾半日花居群分布于不同的河谷之中；同樣，鄂爾多斯半日花居群也分布于桌子山不同的山谷中。山谷間的地理障礙，加上有限的種子傳播能力，限制了半日花居群間的基因流，增加了居群之間的遺傳分歧。(3)準(zhǔn)噶爾半日花與鄂爾多斯半日花居群都為小居群，小居群也能影響居群的遺傳結(jié)構(gòu)。小居群易于發(fā)生遺傳漂變，近交幾率增加。近交會(huì)顯著降低居群的雜合度[27]，遺傳漂變使得等位基因流失[28]，居群的等位基因構(gòu)成發(fā)生變化，使得居群間出現(xiàn)明顯的遺傳分歧。

3.3 半日花屬遺傳保護(hù)的啟示

生境片段化是眾多陸地生態(tài)系統(tǒng)植物面臨的嚴(yán)峻生存考驗(yàn)[29]。生境片段化降低了植物遺傳多樣性水平及其對(duì)自然選擇的適應(yīng)能力，有導(dǎo)致植物滅絕的風(fēng)險(xiǎn)[29]。本研究發(fā)現(xiàn)，片段化生境已導(dǎo)致半日花居群遺傳多樣性降低，應(yīng)及時(shí)對(duì)其進(jìn)行保護(hù)，據(jù)此提出以下保護(hù)策略：(1)由于半日花殘遺居群及個(gè)體都非常少，對(duì)其所有分布區(qū)、所有居群、個(gè)體都應(yīng)加以保護(hù)；(2)加大宣傳力度，防止人為活動(dòng)如過(guò)度放牧、樵采對(duì)天然居群的危害，建立相關(guān)自然保護(hù)區(qū)保護(hù)其自然生境；(3)對(duì)天然居群進(jìn)行人工復(fù)壯，對(duì)于小居群，可以搜集原居群種子，育苗后移植到原居群以擴(kuò)大其規(guī)模，對(duì)于適應(yīng)生長(zhǎng)但已滅絕的生境，還應(yīng)在附近居群搜集種子，培育種苗，重建恢復(fù)間斷居群間的基因流；(4)構(gòu)建核心種質(zhì)資源，使其種質(zhì)具有最大遺傳代表性，并選擇合適地點(diǎn)，建立種質(zhì)資源圃，對(duì)其居群進(jìn)行遷地保護(hù)。