“紅火球”紫薇組培快繁與抗褐化研究

李芳菲，楊利平，劉資華，時(shí) 群，陳麗文，何貴整，楊 瓊

(1.欽州市林業(yè)科學(xué)研究所，廣西 欽州 535099；2.廣西國有欽廉林場，廣西 欽州 535000)

紫薇(LagerstroemiaindicaLinn.)屬千屈菜科紫薇屬落葉灌木或小喬木，其樹桿被微微觸動(dòng)，枝梢就顫動(dòng)不已，故又名癢癢樹[1]。紫薇樹姿優(yōu)美，花多絢麗，在夏季開花，花期長，抗逆性和滯塵能力強(qiáng)，對空氣中的二氧化硫、氟化氫及氮?dú)獾染哂休^強(qiáng)的吸附能力，并具有藥用價(jià)值，是集觀賞、環(huán)境保護(hù)、藥用于一體的木本花卉樹種[2-3]。曾有詩句贊美紫薇：“誰道花無紅百日，紫薇長放半年花”、“獨(dú)占芳菲當(dāng)夏景,不將顏色托春風(fēng)”?！凹t火球”紫薇是從美國引進(jìn)的優(yōu)良新品，花期6—9月，頭狀花序，花色鮮紅艷麗，遠(yuǎn)看猶如一團(tuán)團(tuán)火球，呈現(xiàn)花團(tuán)錦簇之盛況；具有耐旱、耐低溫、抗病性強(qiáng)、可多次開花等優(yōu)良性狀[4]，觀賞價(jià)值高，有重要的研究和推廣價(jià)值，應(yīng)用前景廣闊。

我國于2004年首次從美國引進(jìn)“紅火球”紫薇，隨后，一些專家和學(xué)者開展了不同的研究。但對“紅火球”紫薇繁殖研究局限于播種、扦插和嫁接等[5-6]。通過種子建立再生體系后代容易產(chǎn)生變異，因此不宜采用播種育苗的方式繁殖雜交品種[7]；扦插、嫁接等繁殖速度慢，不能滿足市場需求。組培快繁技術(shù)能保持繁殖材料及新植株的優(yōu)良種性，且繁殖速度快，繁殖系數(shù)高[8]，進(jìn)行“紅火球”紫薇組培快繁技術(shù)研究具有重要意義及應(yīng)用前景。而“紅火球”紫薇內(nèi)含酚類物質(zhì)較多，在組織培養(yǎng)中容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，特別是初代培養(yǎng)時(shí)外植體褐化嚴(yán)重，能否克服褐化問題是組培成功與否的關(guān)鍵。本研究以“紅火球”紫薇莖段為外植體進(jìn)行組培快繁，旨在建立其無菌體系和探索抗褐化最佳配方，為“紅火球”紫薇的規(guī)?；庇凸S化生產(chǎn)提供良好技術(shù)保障。

1 試驗(yàn)材料

以“紅火球”紫薇當(dāng)年生半木質(zhì)化嫩枝莖段為試驗(yàn)材料，莖段采自廣西欽州市林業(yè)科學(xué)研究所紫薇園的健壯母株。

2 試驗(yàn)方法

2.1 外植體預(yù)處理及消毒

在天氣晴朗時(shí)，采集當(dāng)年生健壯、半木質(zhì)化的“紅火球”紫薇嫩枝，去掉葉片(保留2～4 mm長的葉柄基部)，剪成約3 cm左右?guī)б秆康那o段，用自來水沖洗，在1%洗潔精溶液中浸泡5 min，用軟毛刷輕輕刷洗莖段表面,再用自來水沖洗干凈。將預(yù)處理好的外植體置于超凈工作臺(tái)上，按試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案進(jìn)行消毒。本試驗(yàn)選擇75%酒精和0.1%升汞兩種常規(guī)消毒劑，采用兩種消毒方式(0.1%升汞、75%酒精+0.1%升汞)，其中75%酒精消毒時(shí)間為10 s，0.1%升汞消毒時(shí)間分別為6、8、10、12 min。然后用無菌水沖洗4～5次，剪掉外植體兩端切口，接種到 1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上。每瓶接種1個(gè)莖段，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次，每3 d觀察一次，10 d后統(tǒng)計(jì)褐化率和污染率。

2.2 無菌芽誘導(dǎo)

采用上述試驗(yàn)篩選出的最佳消毒方法進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)。分別于4、6、9月3個(gè)不同時(shí)間段取材，剪取不同長度莖段(1、2、3、4 cm)接種到1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中，每瓶接種1個(gè)莖段，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次，每3 d觀察一次，15 d后統(tǒng)計(jì)褐化率、污染率、腋芽萌發(fā)率。

在1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基上設(shè)計(jì)不同無機(jī)鹽濃度(1/2 MS、MS)、不同添加物(L-半胱氨酸 1.5 g/L、VC 2.0 g/L、AC 0.2 g/L)，深入探索抗褐化最佳配方。每瓶接種1個(gè)莖段，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次，每3 d觀察一次，30 d后統(tǒng)計(jì)褐化率、腋芽萌發(fā)率、生長情況。

2.3 增殖和生根培養(yǎng)

從上述試驗(yàn)中篩選出最優(yōu)培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L，分別添加不同濃度的生長調(diào)節(jié)劑6-BA(0.3、0.5、1.0、1.5 mg/L)、NAA(0.1、0.2 mg/L)。選取長勢一致且健壯的無菌芽，切取長度為2～3 cm的莖段(帶2～3個(gè)芽)接種到培養(yǎng)基上，每瓶接種3個(gè)莖段，每個(gè)處理接種10瓶，重復(fù)3次，每7 d觀察一次，45 d后統(tǒng)計(jì)增殖、生根情況。

2.3.1培養(yǎng)基配置

以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)不同濃度的大量元素、生長調(diào)節(jié)劑以及其他添加物。誘導(dǎo)、增殖培養(yǎng)基均添加0.38%瓊脂粉、3%蔗糖，pH 5.6。分裝后的培養(yǎng)基在121 ℃高壓滅菌鍋滅菌20 min，靜置冷卻備用。

2.3.2培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度保持在(25±2)℃：空氣濕度為70%～80%，光照強(qiáng)度為1 500～3 000 lx，光照時(shí)間為12 h/d。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同消毒組合及消毒時(shí)間對外植體抗褐化及滅菌效果的影響

不同消毒組合、消毒時(shí)間對“紅火球”紫薇外植體抗褐化及滅菌效果影響很大，而且8個(gè)消毒處理的褐化率均較高(表1)。

表1 不同消毒組合及消毒時(shí)間對外植體抗褐化及滅菌效果的影響

由表1可知，相同條件下，隨著消毒時(shí)間的增加，外植體的褐化率逐漸升高，污染率則逐漸降低，而且主要是霉菌和細(xì)菌污染。用0.1%升汞消毒12 min時(shí)，褐化最嚴(yán)重，褐化率達(dá)90.4%。采用75%酒精消毒10 s，再用0.1%升汞消毒10 min時(shí)，褐化較輕，褐化率為73.3%，污染也較輕，污染率為10%。因此處理7是“紅火球”紫薇外植體的最佳消毒方法。

3.2 不同取材時(shí)間及不同莖段長度對抗褐化及腋芽萌發(fā)的影響

取材時(shí)間對褐化率、污染率、萌發(fā)率都有極顯著的影響。炎熱夏季(6月)采集的外植體木質(zhì)化程度高，內(nèi)含酚類物質(zhì)、內(nèi)生菌、表面污染物均較多，因此，褐化率、污染率均相對較高，其次是秋季(9月)。春季(4月)氣溫相對較低，有利于抗褐化，而且半木質(zhì)化嫩枝生長時(shí)間較短，內(nèi)含酚類物質(zhì)、內(nèi)生菌、表面污染物均較少，因此褐化率、污染率相對較低，但萌發(fā)率相對較高?？梢?，春季(4月)采集腋芽莖段培養(yǎng)效果最理想(表2)。

選擇適宜的外植體長度是組織培養(yǎng)是否成功的重要環(huán)節(jié)之一。從表2可以看出，在同一時(shí)間段采集的外植體，其褐化率隨著莖段長度的增加而逐漸降低，萌發(fā)率則逐漸升高。但當(dāng)莖段長度達(dá)到4 cm時(shí)，由于受高污染率的影響，萌發(fā)率降低。可見，外植體莖段不宜太短或太長，最適宜長度為2～3 cm。

表2 不同取材時(shí)間及不同莖段長度對抗褐化及腋芽萌發(fā)的影響

經(jīng)過綜合比較，春季(4月)采集“紅火球”紫薇3 cm長腋芽莖段培養(yǎng)效果最好。

3.3 不同無機(jī)鹽濃度及添加物組合對抗褐化及腋芽萌發(fā)的影響

不同無機(jī)鹽濃度及添加物組合對抗褐化及腋芽萌發(fā)的影響結(jié)果見表3。

由表3可知，吸附劑、抗氧化劑均能不同程度地抑制外植體褐化。吸附劑、抗氧化劑的抗褐化效果依次為：VC>L-半胱氨酸>AC。但添加物組合使用比單獨(dú)使用抗褐效果更好，當(dāng)添加物組合為VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L時(shí)，抗褐效果最好，褐化率為50.2%。

表3 不同無機(jī)鹽濃度及添加物組合對抗褐化及腋芽萌發(fā)的影響

1/2 MS與MS培養(yǎng)基均是添加吸附劑、抗氧化劑后抗褐化效果更好，特別在較低濃度的1/2 MS中，褐化率更低。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，低濃度無機(jī)鹽有利于抗褐化。當(dāng)無機(jī)鹽濃度為1/2 MS而添加物組合為VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L時(shí)，褐化率低至50.2%，萌發(fā)率高達(dá)66.6%，無菌芽長勢好。因此，“紅火球”紫薇誘導(dǎo)抗褐化最佳配方為1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L。

3.4 不同生長調(diào)節(jié)劑及濃度組合對增殖及生根的影響

生長調(diào)節(jié)劑的種類、濃度及其組合是影響“紅火球”紫薇繼代增殖的關(guān)鍵因素。生長調(diào)節(jié)劑濃度太低對增殖作用不明顯，濃度太高則抑制不定芽的生長。6-BA濃度為0.3 mg/L且與濃度為0.1 mg/L的NAA配比時(shí)，不定芽增殖系數(shù)較低，植株纖弱；6-BA濃度升高至1.5 mg/L且與濃度為0.1 mg/L的NAA配比時(shí)，不定芽的生長受到抑制，植株矮小，部分葉片變黑，部分幼苗褐化，出現(xiàn)死亡現(xiàn)象；當(dāng)6-BA濃度為0.5 mg/L且與濃度為0.2 mg/L的NAA配比時(shí)，增殖系數(shù)高，植株健壯，長勢佳(表4)。

表4 不同生長調(diào)節(jié)劑及濃度組合對增殖和生根的影響

不定芽在培養(yǎng)基1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L中能“一步”成苗，而且長勢好，芽增殖系數(shù)為4.2，苗高為4.3 cm，生根率為99.7%。綜合考慮，確定1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L為“紅火球”紫薇最佳抗褐化的“一步法”壯苗生根培養(yǎng)基。

4 結(jié)論與討論

1)“紅火球”紫薇內(nèi)含酚類物質(zhì)較多，接種外植體易發(fā)生褐變，有效控制褐變是其組培快繁的關(guān)鍵技術(shù)。外植體變褐主要是由傷口處分泌的酚類化合物引起。被切割的外植體在滅菌、接種后，切面細(xì)胞中酚類物質(zhì)被氧化成有毒醌類物質(zhì)，致使切面迅速變成棕褐色或暗褐色，這些褐色物會(huì)逐漸擴(kuò)散到培養(yǎng)基中，抑制細(xì)胞內(nèi)其他酶的活性，毒害整個(gè)外植體組織[9]。

2)對外植體進(jìn)行消毒處理是抗褐化、防污染的重要手段。該試驗(yàn)中,將外植體進(jìn)行預(yù)處理后，用75%酒精滅菌10 s，再用0.1%升汞滅菌10 min為最佳消毒方法。

3)外植體采集的時(shí)間、莖段大小對抗褐化及腋芽萌發(fā)的影響很大。春季(4月)氣溫相對較低，有利于抗褐化，而且半木質(zhì)嫩枝生長時(shí)間較短，內(nèi)含酚類物質(zhì)、內(nèi)生菌、表面污染物均較少，所以，此時(shí)采集腋芽莖段培養(yǎng)效果最好。為降低褐化率，應(yīng)剪取較長腋芽莖段。莖段太短小，相對傷口面積(傷口面積/莖段長度)就越大，組織內(nèi)部代謝平衡受到干擾的程度越大，褐化率就越高[10]。但莖段過長時(shí)，內(nèi)生菌及表面污染物多，難以徹底滅菌，容易污染。試驗(yàn)表明，“紅火球”紫薇腋芽莖段長度約3 cm最適宜。

4)降低無機(jī)鹽濃度、調(diào)整生長調(diào)節(jié)劑的種類及其濃度、在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑和吸附劑等，均能有效防止褐化。試驗(yàn)結(jié)果表明,最佳抗褐化誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.1 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L；最佳抗褐化的“一步法”壯苗生根培養(yǎng)基為1/2 MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.2 mg/L+VC 2.0 g/L+L-半胱氨酸1.5 g/L。

5)用“一步法”組培快繁“紅火球”紫薇，芽增殖系數(shù)為4.2，苗高為4.3 cm，生根率為99.7%，能縮短成苗周期，節(jié)約成本，是“紅火球”紫薇規(guī)?；庇凸S化生產(chǎn)的可行方法。