白藜蘆醇調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路影響人前列腺癌PC3細(xì)胞株凋亡的研究*

冉亨勇，蒲 軍，李明輝，何 毅

(1.邛崍市醫(yī)療中心醫(yī)院腫瘤科，四川邛崍 610000；2.西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院泌尿外科，四川瀘州 646000)

白藜蘆醇(Resveratrol，Res)化學(xué)名為3，4′，5-三羥基-1，2-二苯乙烯，是一種天然抗氧化物和環(huán)氧合酶(cyclooxygenase，COX)抑制劑。Res在預(yù)防慢性炎性疾病、抗冠心病、癌癥預(yù)防等方面發(fā)揮重要作用[1]，其機(jī)制與清除自由基，抑制COX-2表達(dá)，誘導(dǎo)一氧化氮合成酶合成，抑制脂氧合酶與蛋白激酶C表達(dá)，抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等有關(guān)[2]。男性前列腺癌發(fā)病率較高，美國(guó)前列腺癌發(fā)病率位居男性腫瘤第2位，我國(guó)前列腺癌發(fā)病率也較高[3]。炎癥與前列腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，急性或慢性炎癥不僅會(huì)導(dǎo)致癌變，還參與前列腺癌進(jìn)展[4]。Toll樣受體(toll-like receptor，TLR)是人體參與炎癥的主要受體，其中TLR4能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子或上調(diào)抗凋亡信號(hào)等一系列效應(yīng)[5]。TLR4信號(hào)通路參與前列腺癌、乳腺癌、結(jié)腸癌等多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程，主要與促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的抗原性、增強(qiáng)機(jī)體對(duì)其免疫清除能力、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、免疫逃逸、凋亡抵抗和侵襲能力等有關(guān)。已有研究報(bào)道，TLR4在人前列腺癌PC3細(xì)胞中通過(guò)核因子-κB(NF-κB)信號(hào)通路促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)和白細(xì)胞介素(IL)-8的分泌，影響人前列腺癌PC3細(xì)胞的生存[6]。盡管Res對(duì)前列腺癌有防治作用，但較少有研究探討其影響前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用與調(diào)節(jié)TLR4/NF-κB信號(hào)通路的關(guān)系，故本研究探討Res是否通過(guò)抑制TLR4/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)蛋白和炎性因子表達(dá)影響前列腺癌細(xì)胞凋亡，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

RPMI1640培養(yǎng)基(美國(guó)Hyclone公司)，胎牛血清(浙江天杭生物科技股份有限公司)，Res(成都普思生物科技股份有限公司)；TAK242(美國(guó)Sigma公司)；CCK-8試劑盒、Hochest33342熒光染色試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)研究所)；兔抗人β-actin、TLR4、NF-κB、Bcl-2、Bax單克隆抗體及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體(英國(guó)Abcam公司)；IL-6和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組

人前列腺癌PC3細(xì)胞株購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生物研究所，選用RPMI1640培養(yǎng)基，加入10%胎牛血清后在37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)。Res純度為99%，超聲助溶于超純水中。實(shí)驗(yàn)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，將細(xì)胞分為陰性對(duì)照組，Res高、中、低劑量組，TLR4阻斷劑組。陰性對(duì)照組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，不做其他處理；Res各劑量組分別給予40、20、10 μmol/L Res處理48 h；TLR4阻斷劑組給予1 μg/mL TAK242處理48 h。

1.2.2CCK-8法檢測(cè)Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞增殖的影響

細(xì)胞常規(guī)胰酶消化后制成懸液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×106/L，將細(xì)胞接種于96孔板中，每孔90 μL，在37 ℃、5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)48 h，細(xì)胞處理后每孔加入CCK8試劑10 μL繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)各孔吸光度值(A值)，計(jì)算細(xì)胞生長(zhǎng)存活率，細(xì)胞存活率=A給藥組/A陰性對(duì)照組×100%。

1.2.3Hochest33342熒光染色檢測(cè)人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞凋亡

收集細(xì)胞懸浮液于1 mL培養(yǎng)基中，加入10 μL Hochest33342儲(chǔ)存液(100 mg/L，蒸餾水溶解)，染色15 min；將細(xì)胞置于冰上冷卻后，離心，去上清液，將細(xì)胞重懸于1 mL磷酸鹽緩沖液(PBS)中，加人5 μL碘化丙啶(PI)儲(chǔ)存液(1 g/L，蒸餾水溶解)，混勻，避光放置10 min后熒光顯微鏡觀(guān)察。

1.2.4Western blot檢測(cè)人前列腺癌PC3細(xì)胞株TLR4、NF-κB、Bcl-2及Bax蛋白表達(dá)

細(xì)胞處理后棄上清液，每孔加入50 μL裂解液裂解細(xì)胞，提取蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法檢測(cè)蛋白濃度，計(jì)算樣品加樣量。制備十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)膠，每孔上樣20 μL，100 V電泳90 min，200 mA轉(zhuǎn)膜90 min，5%牛血清清蛋白(BSA)封閉1.h，一抗按1∶1 000稀釋后同膜一起轉(zhuǎn)入抗體封閉盒內(nèi)，4 ℃孵育過(guò)夜，TBST洗膜4次，每次10 min。加入二抗1∶2 000，孵育1 h，洗膜4次，每次10 min，電化學(xué)發(fā)光(ECL)顯色液顯影，以β-actin為內(nèi)參，蛋白條帶灰度值用Image proplus6.0軟件測(cè)定，根據(jù)TLR4/β-actin和NF-κB/β-actin條帶灰度值比值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.2.5ELISA法檢測(cè)人前列腺癌PC3細(xì)胞株IL-6和TNF-α表達(dá)

每孔調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105/L，接種于96孔板，處理細(xì)胞后取細(xì)胞上清液按1 000×g離心10 min，每孔加入樣品稀釋液40 μL，待測(cè)樣品10 μL，酶標(biāo)板輕輕晃動(dòng)，37 ℃孵育30 min，撕掉封板膜，棄去液體，甩干，加滿(mǎn)洗滌液，靜置30 s后甩干，反復(fù)3次，每孔加入酶標(biāo)液50 μL，37 ℃孵育30 min，洗滌3次，加顯色液A 50 μL，顯色液B 50 μL，搖勻，37 ℃避光顯色，加終止液50 μL，空白調(diào)零，酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)下檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株增殖的影響

Res各劑量組人前列腺癌PC3細(xì)胞株的細(xì)胞存活率為70.10%～78.35%；與陰性對(duì)照組相比，10 μmol/L及以上Res劑量組能抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞株增殖，呈劑量依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 Res對(duì)人前列腺PC3細(xì)胞株增殖影響

2.2 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示陰性對(duì)照組細(xì)胞呈淺藍(lán)色，凋亡細(xì)胞較少；Res各劑量組可見(jiàn)凋亡細(xì)胞呈亮藍(lán)色，并可見(jiàn)細(xì)胞核固縮、核碎裂等現(xiàn)象。Res各劑量組抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)，各劑量組Bcl-2/Bax比值降低，除Res 10 μmol/L組外，與陰性對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1、2，表2。

A：陰性對(duì)照組；B：TLR4阻斷劑組；C：Res 40 μmol/L組；D：Res 20 μmol/L組，E：Res 10 μmol/L組。圖1 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞凋亡的影響(Hochest33342熒光染色，×400)

圖2 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞Bcl-2/Bax表達(dá)的影響

2.3 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞TLR4及NF-κB表達(dá)的影響

Res各劑量組、TLR4阻斷劑組TLR4相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；Res 20、40 μmol/L劑量組、TLR4阻斷劑組NF-κB相對(duì)表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；Res各劑量組與TLR4阻斷劑組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖3、表2。

圖3 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株細(xì)胞TLR4及NF-κB表達(dá)的影響

表2 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株TLR4、NF-κB表達(dá)及Bcl-2/Bax的影響

2.4 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株炎性因子表達(dá)的影響

與陰性對(duì)照組比較，Res各劑量組IL-6、TNF-α水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表3。

表3 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

續(xù)表3 Res對(duì)人前列腺癌PC3細(xì)胞株IL-6和TNF-α表達(dá)的影響

3 討 論

前列腺癌是目前男性發(fā)病率較高的腫瘤之一，尤其在北美和歐洲地區(qū)[7]。目前其治療仍以手術(shù)、化療等方式為主。盡管近年來(lái)不斷有新的化療藥物被批準(zhǔn)用于治療前列腺癌，如多西他賽、卡巴西他賽，但前列腺癌仍是男性因癌癥死亡的第五大原因，占男性癌癥病死率的6.6%[8]；而在亞洲國(guó)家，前列腺癌1年、5年和10年存活率分別為81.0%、61.9%和36.2%[9]。

大量臨床試驗(yàn)表明，中藥在預(yù)防前列腺癌方面具有積極作用，許多從中草藥提取的化合物已被證明可通過(guò)不同途徑抑制前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展，有望在未來(lái)用于前列腺癌的臨床治療[10]。Res的抗炎、抗氧化和抗腫瘤作用一直是腫瘤防治的研究熱點(diǎn)，目前已有研究證實(shí)Res對(duì)癌癥的防治具有有益作用，而且不良反應(yīng)少。一項(xiàng)為期10年的流行病學(xué)研究表明，通過(guò)食用葡萄而非葡萄酒攝入Res的女性患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)降低了50%以上[11]。Res的一些Ⅰ期和Ⅱ期臨床試驗(yàn)也正在進(jìn)行中。本研究結(jié)果顯示，10 μmol/L及以上濃度的Res即可抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞株的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示Res具有抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞株生長(zhǎng)，促進(jìn)其凋亡的作用。

凋亡蛋白Bcl-2/Bax是反映凋亡發(fā)生、發(fā)展的經(jīng)典蛋白，因此進(jìn)一步分析Res對(duì)凋亡蛋白Bcl-2/Bax是否產(chǎn)生影響。Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡，延長(zhǎng)細(xì)胞生存期的作用。Bax則是促進(jìn)細(xì)胞凋亡蛋白，具有對(duì)抗Bcl-2蛋白抑制細(xì)胞凋亡的作用。Bcl-2與Bax形成二聚體的比例決定了細(xì)胞凋亡與存活的狀態(tài)，即當(dāng)Bcl-2/Bax比值增加，細(xì)胞存活率高，Bcl-2/Bax比值降低，細(xì)胞存活率則降低[12]。本研究結(jié)果顯示，Res能抑制Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)Bax表達(dá)，降低了Bcl-2/Bax比例，提示Res促進(jìn)人前列腺癌細(xì)胞凋亡的作用與此有關(guān)。

臨床前研究表明，慢性炎癥與前列腺癌進(jìn)展有關(guān)，如在前列腺腫瘤標(biāo)本和切除的組織中發(fā)現(xiàn)慢性炎癥，其他分子、實(shí)驗(yàn)和臨床的證據(jù)也表明慢性炎癥和前列腺癌風(fēng)險(xiǎn)呈正相關(guān)[13]，提示炎癥可能是前列腺癌發(fā)生的驅(qū)動(dòng)因素。炎性介質(zhì)被認(rèn)為是參與前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的因素，有可能成為治療干預(yù)的靶點(diǎn)；而炎癥相關(guān)的白細(xì)胞局部浸潤(rùn)、信號(hào)分子(包括細(xì)胞因子和趨化因子)產(chǎn)生，則與下游效應(yīng)器如NF-κB、Wnt通路激活有關(guān)[14]。TLR4信號(hào)通路也是參與炎癥發(fā)生、發(fā)展的重要通路，已有研究顯示前列腺癌細(xì)胞中TLR2、4、9的激活可能促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)[15]。故本研究進(jìn)一步分析Res是否通過(guò)影響TLR4通路蛋白表達(dá)，影響下游炎性因子，從而達(dá)到抑制前列腺癌細(xì)胞增殖的作用。因此，檢測(cè)了TLR4、NF-κB、IL-6和TNF-α的表達(dá)。結(jié)果顯示，Res干預(yù)后前列腺癌細(xì)胞中TLR4蛋白表達(dá)水平明顯降低，與使用TLR4抑制劑相似，同時(shí)下游NF-κB蛋白表達(dá)水平和炎性因子(IL-6、TNF-α)表達(dá)水平也明顯降低，提示Res抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)可能與阻斷TLR4，以及抑制下游NF-κB蛋白表達(dá)和炎性因子IL-6和TNF-α表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，Res能抑制人前列腺癌PC3細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，可能與抑制TLR4、NF -κB蛋白，下調(diào)Bcl-2/Bax比值，減少炎性因子IL-6和TNF-α表達(dá)有關(guān)，其是否涉及其他信號(hào)通路尚有待進(jìn)一步研究。