昆布多糖修復(fù)小鼠皮膚屏障作用研究*

安立輝，劉洋成，段艷梅，牛美月，項(xiàng) 崢△

(1.沈陽市第七人民醫(yī)院皮膚科，沈陽 110000；2.遼寧大學(xué)藥學(xué)院，沈陽 110036)

皮膚由于大面積與外界物質(zhì)接觸，其損傷經(jīng)常發(fā)生，有關(guān)皮膚組織修復(fù)的研究也層出不窮。然而，關(guān)于昆布多糖對皮膚的修復(fù)效果的研究較為缺乏。昆布多糖是一種存在于海帶科植物海帶或翅藻科植物昆布干燥葉中的天然活性成分，其藥理作用在很大程度上與其含有的多糖類物質(zhì)有關(guān)。目前認(rèn)為昆布多糖主要有3種類型：褐藻酸鹽(alginate)、褐藻淀粉(laminarin)和褐藻糖膠(fucoidan)。另外，昆布中還含有不同比例的半乳糖、木糖、葡萄糖醛酸和少量蛋白質(zhì)[1-2]。研究發(fā)現(xiàn)，昆布多糖具有調(diào)節(jié)免疫功能、抗腫瘤、抗凝血、抗放射等多種藥理作用[3-7]。昆布多糖修復(fù)皮膚損傷的作用原理主要是增高巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，誘導(dǎo)產(chǎn)生白細(xì)胞介素-1(IL-1)，激活巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其細(xì)胞溶解性[7]。而巨噬細(xì)胞作為皮膚組織修復(fù)的主要因素[8]，能夠分泌多種細(xì)胞因子促進(jìn)皮膚的再次生長、膠原沉積、血管生成及毛囊再生[9-10]。目前，越來越多因外界因素導(dǎo)致的皮膚損傷影響著人們的正常生活，據(jù)統(tǒng)計，每年全球皮膚損傷患者以千萬計[11-13]。本文將通過建立小鼠背部皮膚損傷模型，初步探討不同昆布多糖的皮膚修復(fù)效果，為后續(xù)的劑型及其他研究奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物

昆明種小鼠及飼養(yǎng)所需維持飼料、墊料均購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司。

1.1.2儀器與試劑

奧林巴斯CX23生物顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；智能皮膚評測儀Gpskin barrier(北京安德普泰醫(yī)療科技有限公司)；手術(shù)專用剪刀、直尺、昆布多糖(北京索萊寶科技有限公司)；凝膠敷料[商品名：清得佳，施樂輝醫(yī)用產(chǎn)品國際貿(mào)易(上海)有限公司]；戊巴比妥鈉、聚維酮碘(沈陽萊博科貿(mào)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1小鼠破損皮膚造模

選取40只體重20～30 g的雄性健康昆明小鼠，腹腔注射戊巴比妥鈉水溶液10 mL。待小鼠進(jìn)入麻醉狀態(tài)后，固定小鼠，剪去其背部中央直徑3 cm左右的圓形區(qū)域毛發(fā)，經(jīng)聚維酮碘消毒后在脫毛區(qū)域剪去直徑1.5 cm的圓形皮膚組織，建立小鼠皮膚受損模型。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組與取樣

將40只小鼠通過完全隨機(jī)分組法分為：空白對照組(造模，n=10)，陽性對照組(凝膠敷料+造模，n=10)，30%昆布多糖組(30%昆布多糖+造模，n=10)和70%昆布多糖組(70%昆布多糖+造模，n=10)，每天早上10:00及晚上6：00各給藥1次并測量皮膚水分，給藥方式為直接涂抹至破損皮膚處。每3天測量1次小鼠傷口直徑，用相機(jī)拍攝小鼠皮膚愈合情況。在給藥第21天對40只小鼠進(jìn)行標(biāo)記并處死，用外科手術(shù)剪刀沿著小鼠創(chuàng)面皮膚邊緣剪下皮膚，磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次后，平鋪在濾紙中間，10%甲醛溶液固定，制作病理切片觀察各組小鼠皮膚修復(fù)情況。

1.2.3觀察與測量指標(biāo)

每天肉眼觀察小鼠新生皮膚，重點(diǎn)關(guān)注其皮膚顏色、透明程度及毛發(fā)生長情況等，并使用智能皮膚評測儀Gpskin barrier測量損傷處皮膚屏障評分(該款智能皮膚評測儀評分制為100分制)和皮膚水分流失評分(按儀器說明書進(jìn)行操作，評分標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一為儀器默認(rèn)標(biāo)準(zhǔn))；在皮膚創(chuàng)口愈合過程中，每天測量創(chuàng)口面積，計算創(chuàng)口愈合面積，以創(chuàng)口愈合率表示創(chuàng)口愈合效果，創(chuàng)口愈合率=創(chuàng)口愈合面積/原創(chuàng)口面積×100%。鏡下觀察小鼠皮膚病理切片[蘇木素-伊紅(HE)染色]并攝像記錄，隨機(jī)選擇3個不同視野觀察毛囊及“腺泡樣”結(jié)構(gòu)數(shù)量。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

本研究所有數(shù)據(jù)均采用Excel2016軟件進(jìn)行分析處理，采用SigmaPlot 14.0軟件制作數(shù)據(jù)圖表。

2 結(jié) 果

2.1 傷口愈合觀察

第1天各組小鼠皮膚創(chuàng)面組織均浸潤呈鮮紅色，傷口直徑1.5 cm左右，背部可見筋膜，傷口邊緣有少量出血，因麻醉藥物作用與傷口影響小鼠行動遲緩。3 d后空白對照組小鼠皮膚組織表皮干燥，無壞死或腐肉組織，無異味；陽性對照組小鼠創(chuàng)面有少量結(jié)痂，干燥無特殊氣味；實(shí)驗(yàn)組小鼠皮膚創(chuàng)面組織干燥且有裂口，有少量分泌物，創(chuàng)面粘有少量敷料。7 d時空白對照組創(chuàng)面縮小，創(chuàng)面干燥，無分泌物，創(chuàng)口有很薄的結(jié)痂；陽性對照組傷口直徑明顯縮短，創(chuàng)口有結(jié)痂；實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)口無分泌物，無異味，創(chuàng)口表面有薄層結(jié)痂。10 d時陽性對照組創(chuàng)面直徑持續(xù)縮短，空白對照組結(jié)痂收縮相對緩慢；實(shí)驗(yàn)組創(chuàng)面直徑明顯縮小，創(chuàng)面浸潤，系小鼠舔舐所致，無感染。15 d時對照組創(chuàng)面都愈合至0.5 cm，傷口有較厚圓狀結(jié)痂，對合好，無感染，新生皮膚有少量毛發(fā)長出；實(shí)驗(yàn)組小鼠創(chuàng)面直徑為0.8 cm，創(chuàng)面皮膚組織干燥，新生皮膚組織毛發(fā)較對照組更多，見圖1。21 d時實(shí)驗(yàn)組與對照組小鼠創(chuàng)面完全愈合，無感染，見圖2。

A：創(chuàng)口處結(jié)痂；B：少量新生毛發(fā)。圖1 皮膚鏡下創(chuàng)口結(jié)痂狀態(tài)

A：造模成功后；B：陽性對照組給藥21 d后；C：30%昆布多糖組給藥21 d后；D：空白對照組給藥21 d后；E：70%昆布多糖組給藥21 d后。圖2 造模成功后及給藥21 d后各組皮膚狀態(tài)

2.2 小鼠皮膚創(chuàng)口愈合率分析

陽性對照組從初期開始皮膚創(chuàng)口愈合率優(yōu)于其他組，在第11天皮膚創(chuàng)口愈合率達(dá)到90%以上；而空白對照組皮膚創(chuàng)口愈合率在第17天達(dá)到90%。分析各組皮膚創(chuàng)口愈合率顯示：陽性對照組>70%昆布多糖組>30%昆布多糖組>空白對照組，見圖3。

圖3 各組小鼠皮膚創(chuàng)口愈合率

2.3 小鼠皮膚創(chuàng)口愈合率分析

陽性對照組從初期開始皮膚屏障評分優(yōu)于其他組，在第12天皮膚屏障恢復(fù)到了較高水平，皮膚屏障評分達(dá)到90分以上；而空白對照組皮膚屏障評分在第18天達(dá)到90分。分析各組皮膚屏障評分顯示：陽性對照組>70%昆布多糖組>30%昆布多糖組>空白對照組，見圖4。

圖4 各組小鼠皮膚屏障評分

2.4 小鼠皮膚水分流失評分分析

陽性對照組小鼠皮膚水分流失評分較低，其降低小鼠皮膚水分流失效果較好，在第10天降低至10分以下；空白對照組則在第16天降到10分以下，分析各組保護(hù)皮膚水分流失效果：陽性對照組>70%昆布多糖組>30%昆布多糖組>空白對照組，見圖5。

圖5 各組小鼠皮膚水分流失評分

2.5 小鼠皮膚病理切片分析

分析小鼠皮膚病理切片的毛囊及腺泡樣結(jié)構(gòu)數(shù)量：陽性對照組>70%昆布多糖組>30%昆布多糖組>空白對照組，見圖6。

A：陽性對照組；B：30%昆布多糖組；C：空白對照組；D：70%昆布多糖組；黑色箭頭標(biāo)注為毛囊，綠色箭頭標(biāo)注為腺泡。圖6 各組小鼠皮膚病理切片(HE染色，×400)

3 討 論

昆布多糖具有抗腫瘤、抗凋亡、抗炎、抗凝血、抗氧化等多種生物活性[14-20]。并且，昆布多糖經(jīng)過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)修飾、硫酸化和多種新加工工藝處理后，其生物活性還可以得到進(jìn)一步提高，具有廣闊的研究前景。作為一種來源于天然食品的有效成分，昆布多糖逐漸受到學(xué)界關(guān)注，其中含量豐富的生物活性多糖近年來已成為國內(nèi)外眾多學(xué)者的研究熱點(diǎn)。日本、中國香港等國家(地區(qū))已開發(fā)出工業(yè)化生產(chǎn)昆布多糖的技術(shù)，并且其提取工藝在不斷的研發(fā)完善中。昆布多糖的皮膚屏障功能修復(fù)作用可用于各種物理、化學(xué)因素導(dǎo)致的皮膚屏障受損，亦可用于皮膚疾病伴發(fā)的皮膚屏障受損；同時，昆布多糖作為一種提取自海洋植物的活性成分，其來源廣泛、自然儲量充足。因此，昆布多糖具有非常重要的應(yīng)用開發(fā)價值和廣闊的市場前景，有希望制成廉價、高效的皮膚修復(fù)制劑，造福廣大皮膚損傷患者。

傷口愈合過程復(fù)雜，涉及多種機(jī)制，主要包括5個階段：(1)炎癥導(dǎo)致止血及血栓形成；(2)纖維組織增生和新生血管形成；(3)肉芽組織增生；(4)上皮化再生；(5)新的細(xì)胞外基質(zhì)和組織重塑的形成。本實(shí)驗(yàn)探討了昆布多糖對小鼠皮膚屏障的修復(fù)效果，發(fā)現(xiàn)昆布多糖具有明顯的皮膚損傷修復(fù)作用，可加快受損皮膚組織的修復(fù)速度，其中70%昆布多糖組的皮膚損傷修復(fù)效果明顯強(qiáng)于30%昆布多糖組，且兩組效果均明顯強(qiáng)于空白對照組。此外，由于小鼠皮膚病理切片內(nèi)出現(xiàn)毛囊及“腺泡樣”結(jié)構(gòu)的數(shù)量是損傷皮膚修復(fù)過程中皮膚修復(fù)質(zhì)量的標(biāo)志[21-22]，由此可知，皮膚病理切片結(jié)果表明陽性對照組小鼠損傷皮膚修復(fù)效果最佳，實(shí)驗(yàn)組次之，空白組修復(fù)效果最差。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)對不同含量昆布多糖的皮膚修復(fù)效果進(jìn)行了對比研究，可為進(jìn)一步研究昆布多糖皮膚修復(fù)作用的機(jī)制、劑型及臨床應(yīng)用等方向奠定基礎(chǔ)。