HLA DRB1?0901多態(tài)性與常見過敏原致過敏反應(yīng)易感性的關(guān)系

周道平 區(qū)宇潔 薛曉芳 郭菁 甄英鵬 陸偉桃 張玲 莫桂玲

1廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院（廣州510730）；2廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司（廣州510320）

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）?DRB1*0901 位點（ rs2395185）位于HLA?DRB1 的配體結(jié)合口袋，是與生物活性相關(guān)的氨基酸殘基。該位點已在多種疾病，如肺癌、淋巴瘤等的關(guān)聯(lián)分析研究中被報道［1?3］，并且，有報道rs2395185 與tIgE 水平升高［4］、系統(tǒng)性紅斑狼瘡的抗核抗體陽性相關(guān)［5］。因此，該位點可能與機體自身免疫相關(guān)。但是，該位點與中國人群過敏性皮膚病的關(guān)系未見報道。本研究探討rs2395185位點的多態(tài)性與廣州地區(qū)居民19 種皮膚過敏原的關(guān)系，為今后過敏相關(guān)皮膚疾病的個性化治療提供精準(zhǔn)干預(yù)的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2016年11月至2021年4月廣州開發(fā)區(qū)醫(yī)院、廣州市黃埔區(qū)紅十字會醫(yī)院皮膚科收治的過敏性皮膚病患者304 例，年齡2～81歲，平均年齡33.1 歲。其中男125 例，女179 例。患者均按《中國臨床皮膚病學(xué)》相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)診斷并確診。患者的主要癥狀有蕁麻疹、濕疹等。所有受試者均為2 周內(nèi)未用皮質(zhì)類固醇激素和3 d 內(nèi)停用抗組織胺藥的患者，排除合并慢性疾病或嚴(yán)重代謝性疾病、既往有皮膚病史的患者。受試者之間無直接親屬關(guān)系，本研究通過本院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者或家屬均簽署知情同意書。

1.2 血液過敏原檢測 采集受試者外周血，分離血清1 mL，采用免疫印跡法檢測過敏原，包括19種過敏原：戶塵螨、屋塵、蟑螂、貓毛皮屑、狗毛皮屑、莧、混合草（肯塔基藍(lán)草/草地羊茅/果園草/小糠草/黑麥草/梯牧草/黃花茅）、桑樹、霉菌（點青霉/交鏈孢霉/煙曲霉/分枝孢霉）、樹花粉（櫟樹/榆樹/梧桐/柳樹/楊樹）、雞蛋白、牛奶、牛肉、蝦、蟹、貝、腰果、芒果、菠蘿，檢測儀器為phadia Immuno CAP250 過敏原檢測系統(tǒng)（瑞典法瑪西亞公司），檢測試劑為過敏原特異性抗體IgE 檢測試劑盒UniCAP（瑞典法瑪西亞公司）。檢測結(jié)果分為6級，0 級為不過敏（陰性），1 級為可疑或輕度過敏，2 級為輕度過敏，3 級為中度過敏，4 級為中到重度過敏，5 級以上為重度過敏。

1.3 HLA DRB1*0901（rs2395185）基因位點檢測 采用PCR 測序技術(shù)檢測外周血HLA DRB1*0901（rs2395185）基因位點。采集受試者外周靜脈血5 mL，置于EDTA?Na2 抗凝管中，?80 ℃冰箱保存。采用全血DNA 純化試劑盒HiPure FFPE DNA Kit（廣州美基生物科技有限公司）進(jìn)行DNA 提取，操作步驟嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。PCR 引物和測序引物委托蘇州泓迅生物科技股份有限公司進(jìn)行合成，引物序列如下：PCR 上游引物0901?SNP?F1：5′?GTCCTGTGGCCCTCTGATATT?3′；PCR 下游引物0901?SNP?R1：5′?ATTGGATTGTTGGGGTTCACAAG?3′；測序引物：0901?SNP?SF：5′?TCCCTATTTCAA TAAGCAGCACCACC?3’。PCR 反應(yīng)體系為：dNTP 2.5 μL，DNA 100 ng，0901?SNP?F1（10 μM）1 μL，0901?SNP?R1（10 μM）1 μL，2×Phanta Max Master Mix（南京諾唯贊生物科技有限公司）25 μL，ddH2O 補足到50 μL。PCR 條件為：預(yù)變性94 ℃3 min；變性94 ℃20 s，退火60 ℃20 s，延伸72 ℃30 s，35 個循環(huán)；72 ℃5 min；12 ℃保存。PCR 產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳分離后，按Gel Extraction Kit D2500 膠回收試劑盒（廣州美基生物科技有限公司）說明書純化。純化的產(chǎn)物送測序公司進(jìn)行測序鑒定rs2395185 基因型。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件。驗證HLA DRB1*0901（rs2395185）位點是否符合哈德?溫伯格平衡，采用直接計數(shù)法統(tǒng)計各位點的基因型頻率和等位基因頻率，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。計算顯性模型、隱形模型、累積模型（共顯型模型），方法如下：G 為野生型等位基因，顯性模型：G/G 加G/T 基因型人數(shù)與T/T 基因型人數(shù)比較；隱性模型：G/G 與G/T 加T/T 基因型人數(shù)比較；累積模型：G/G、G/T 及T/T 基因型人數(shù)三者比較。

2 結(jié)果

2.1 19 種過敏原陽性患者基因多態(tài)性檢測結(jié)果 304 例受試者中，rs2395185 G/G 基因型為150例（49.3%），G/T 基因型為128 例（42.1%），T/T 基因型為26 例（8.6%），最小基因頻率T＝0.296。19 種過敏原中任一種檢測陽性患者中，僅在戶塵螨、雞蛋白、混合草過敏原陽性患者中檢出T/T 基因型。各種過敏原陽性患者基因多態(tài)性檢測結(jié)果見表1。

表1 過敏原陽性患者rs2395185 基因多態(tài)性檢測結(jié)果Tab.1 Gene polymorphism of rs2395185 in patients with positive allergen例（%）

2.2 rs2395185 基因型與3 種過敏原檢測結(jié)果的關(guān)系分析 根據(jù)戶塵螨、雞蛋白、混合草3 種過敏原檢測結(jié)果是否陽性，把患者分成兩組，分析組間基因型分布及基因模型差異，結(jié)果見表2。rs2395185 位點基因型均符合哈德?溫伯格平衡（PHWE＞0.05）。將T/T 基因型設(shè)為對照，G/G 基因型、G/T 基因型在戶塵螨檢測陽性的患者中頻率均高于陰性患者，兩組間的基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），遺傳模型分析發(fā)現(xiàn)顯性遺傳模型（G/G+G/Tvs.T/T）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），G 基因型可能與戶塵螨過敏相關(guān)；G/G、G/T基因型攜帶可能是戶塵螨過敏的危險因素（OR＝

表2 rs2395185 基因型與3 種過敏原檢測結(jié)果的關(guān)系分析Tab.2 Relationship between genotype of rs2395185 and three kinds of allergens例（%）

2.940，95%CI：1.167～7.407；OR＝2.889，95%CI：1.136～7.348）。而雞蛋白、混合草檢測陽性患者與陰性患者的G/G、G/T 基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。

2.3 rs2395185 基因型與過敏原反應(yīng)嚴(yán)重程度的關(guān)系 將過敏原檢測結(jié)果分級為1、2 級的患者作為輕度過敏組，結(jié)果分級為3 級以上的患者作為中、重度過敏組，將T/T 基因型設(shè)為對照，G/T 基因型在兩組間的基因型分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＝0.027），G/T 基因型可能是過敏原反應(yīng)嚴(yán)重程度的危險因素（OR＝8.681，95%CI：1.077～69.989）；遺傳模型分析發(fā)現(xiàn)隱性遺傳模型（G/Gvs.G/T+T/T）差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.01）。見表3。

表3 rs2395185 基因型與過敏原反應(yīng)嚴(yán)重程度的關(guān)系Tab.3 Relationship between genotype of rs2395185 and severity of allergic reaction例（%）

3 討論

人類白細(xì)胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）基因群是調(diào)控人體特異性免疫應(yīng)答、決定疾病易感性個體差異的主要基因系統(tǒng)［6］，HLA 分子肽結(jié)合槽是由等位基因編碼的，等位基因的多態(tài)性如果改變了結(jié)合槽的結(jié)構(gòu)，HLA 分子肽和T 細(xì)胞的相互作用就會受到影響，從而控制了外源性及自身抗原免疫應(yīng)答反應(yīng)的特異性，使得不同的HLA 基因型對多種疾病的易感性不同［7?10］。

Ⅰ型超敏反應(yīng)可引發(fā)過敏性疾病，與HLA?Ⅱ類基因多態(tài)性關(guān)系密切［11?13］。有學(xué)者認(rèn)為HLA?Ⅱ類位點的基因可以調(diào)節(jié)環(huán)境中普通過敏原的IgE 免疫反應(yīng)。研究表明HLA? DRB1* 0701 與TCR A/D 等位基因?qū)τ谡{(diào)節(jié)IgE 的產(chǎn)生有協(xié)同作用。最早研究HLA 基因多態(tài)性的報道認(rèn)為DRB1*1501（DR2）相關(guān)的單倍型與豚草花粉所引起的過敏反應(yīng)有關(guān)。另外，也有報道表明HLA?DR 和HLA?DQ 等位基因與花粉過敏、食物過敏的易感相關(guān)［14?15］。關(guān)于食物過敏，有研究認(rèn)為HLA?DRB1*08、HLA?DRB1*08/12 tyr 16 和HLA?DQB1*04 基因型與花生過敏有明顯相關(guān)性［16?17］，HLA?DQ 基因的rs9271588 位點與小麥過敏有明顯相關(guān)性［18］。

HLA DRB1*09：01（rs2395185）位于HLA ?DRB1 的配體結(jié)合口袋，是與HLA?DRB1 生物活性相關(guān)的氨基酸殘基。該位點已在多種疾病的關(guān)聯(lián)分析研究中被報道。WANG 等［1］對肺癌發(fā)生風(fēng)險SNP 的研究發(fā)現(xiàn)，HLA?DRB1*09：01 與APOBEC3A表達(dá)增加和APOBEC 突變率升高相關(guān)。WANG等［2］采用前瞻性隊列研究方法，探討日常烹飪時間與單核苷酸多態(tài)性（SNPs）對肺癌發(fā)病率的聯(lián)合影響，發(fā)現(xiàn)位于6p21.32 的rs2395185 和rs3817963與肺癌發(fā)病率顯著相關(guān)；與攜帶rs2395185GG 或rs3817963TT 基因型、不烹飪的受試者相比，每天烹飪時間超過2 小時且攜帶rs2395185GT+TT 基因型的受試者患肺癌的風(fēng)險增加2.48 倍。另外，KENNEDY 等［3］在非西班牙裔白人男性中報道rs2395185 多態(tài)性與兒童淋巴瘤發(fā)病風(fēng)險有強關(guān)聯(lián)。VINCE 等［4］在非洲人群中發(fā)現(xiàn)HLA?DRB1*09：01 與總IgE 水平升高相關(guān)。 TERAO 等［5］對于日本女性系統(tǒng)性紅斑狼瘡易感性的研究顯示，rs2395185 的T 等位基因與抗核抗體（ANA）陽性顯著相關(guān)。對于哮喘的全基因組關(guān)聯(lián)研究顯示rs2395185 的次要等位基因T 是哮喘的風(fēng)險等位基因［19］，但也是潰瘍性結(jié)腸炎的保護(hù)性等位基因［20］。因此，筆者推測rs2395185 位點可能與機體自身免疫相關(guān)。但是，該位點與中國人群過敏反應(yīng)發(fā)病風(fēng)險的相關(guān)性未見報道。

本研究對于廣州地區(qū)居民的rs2395185 基因型進(jìn)行了分析，結(jié)果表明，人群的最小等位基因頻率（T＝0.296）和1000Genomes、HapMap（T＝0.293）基本一致，但是與韓國人群（T＝0.378）、中東卡塔爾人群（T＝0.356）等有一定差異，說明該位點的多態(tài)性存在一定的種族差異。本次研究統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示，皮膚科就診患者陽性率最高的過敏原為戶塵螨、雞蛋白、樹花粉。對于皮膚科就診患者過敏原發(fā)病風(fēng)險與rs2395185 基因型關(guān)系分析結(jié)果顯示，戶塵螨過敏原檢測結(jié)果陽性、陰性患者間rs2395185 的G/G 基因型、G/T 基因型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），與戶塵螨過敏的發(fā)病風(fēng)險可能有關(guān)。對三種遺傳模型分析比較得出，G/G、G/T 基因型以顯性遺傳方式影響戶塵螨過敏（P＝0.015），存在G/G、G/T 基因型的患者戶塵螨過敏風(fēng)險更高。而雞蛋白、混合草檢測陽性患者與陰性患者的G/G、G/T 基因型分布差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P> 0.05），因此rs2395185 與這兩種過敏原所致的過敏反應(yīng)發(fā)病風(fēng)險可能不相關(guān)。另外，對rs2395185 基因型與過敏原反應(yīng)嚴(yán)重程度關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果顯示輕度過敏與中重度過敏患者的G/T基因型在兩組間的基因型分布差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P< 0.05），G/T 基因型可能是過敏原反應(yīng)嚴(yán)重程度的危險因素。

綜上所述，本研究在廣州地區(qū)居民中，對于HLA DRB1*09：01（rs2395185）位點與19 種常見過敏原所致的皮膚過敏反應(yīng)的關(guān)系進(jìn)行了研究，該位點多見于對肺癌等疾病的研究，在免疫相關(guān)疾病中少見報道。結(jié)果表明，廣州地區(qū)居民戶塵螨皮膚過敏發(fā)病風(fēng)險可能與rs2395185 位點G/G、G/T多態(tài)性有關(guān)；19 種過敏原過敏的嚴(yán)重程度可能與rs2395185 位點G/T 多態(tài)性有關(guān)。本課題的局限性在于：樣本量有限，因此除了陽性率最高的戶塵螨、雞蛋白、樹花粉外，其他各種過敏原檢出的陽性病例較少、難以結(jié)合SNP 基因型進(jìn)行分析；研究僅限于廣州地區(qū)；未能收集更詳細(xì)的臨床癥狀數(shù)據(jù)；除了年齡、性別外，未能收集到如職業(yè)接觸、生活環(huán)境等其他皮膚病相關(guān)致病因素的數(shù)據(jù)；未能檢測更多種類的過敏原。后續(xù)研究將收集更多不同地區(qū)、不同職業(yè)、接觸其他過敏原的人群樣本，以驗證該位點與皮膚過敏反應(yīng)發(fā)生風(fēng)險的關(guān)系是否具有地區(qū)及職業(yè)接觸差異、該位點與其他過敏原是否有關(guān)。