抗生素前處理及分析技術(shù)研究進(jìn)展

劉忠玲，王 欣，姚美英，于 維

（吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院, 長(zhǎng)春 130012）

抗生素類藥物是一類用于干擾其它生物細(xì)胞發(fā)育功能的天然或人工合成物質(zhì)，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，增強(qiáng)細(xì)菌細(xì)胞膜通透性，干擾細(xì)菌蛋白質(zhì)合成以及抑制細(xì)菌核酸復(fù)制轉(zhuǎn)錄而達(dá)到治療作用。臨床中，藥代動(dòng)力學(xué)/藥效學(xué)與抗菌功效的關(guān)系取決于藥物的配置，感染的細(xì)菌和位置[1]，合理抗生素使用能夠極大程度減少ICU患者死亡率[2]，然而，聯(lián)合使用抗生素間的藥物作用、毒性、過敏、抗生素抵抗等不良因素也逐步浮現(xiàn)，而且，抗生素劑量直接關(guān)系到頻繁抗生素使用的危重癥患者安全以及耐藥菌株的發(fā)展。另一方面，兒童用藥效果受生長(zhǎng)和成熟相關(guān)的生理變化的影響[3]，新生兒的患者間藥代動(dòng)力學(xué)差異明顯，代謝率和酶含量不同的患者用藥效果差異明顯，如何合理用藥重要性日益顯著。因此，抗生素治療個(gè)體化發(fā)展勢(shì)在必行，抗生素監(jiān)測(cè)作為評(píng)估用藥的基本方法，勢(shì)在必行。WHO在2014年也對(duì)抗生素限制提出了相關(guān)政策和約束。

1 抗生素檢測(cè)研究重要性

抗生素檢測(cè)不僅在一定程度上避免副作用和毒性，更可以為合理用藥提供數(shù)據(jù)支持，Scaglione等[4]在充分測(cè)定病原體和抗生素指標(biāo)之后，選擇相應(yīng)計(jì)量抗生素，其肺炎根除率明顯增強(qiáng)。許多研究表明，標(biāo)準(zhǔn)劑量方案往往導(dǎo)致危重病人血液中不同種類化合物偏高。例如，Taccone等[5]在一項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重膿毒癥和膿毒性休克患者，頭孢他啶僅為28%，頭孢吡肟為16%，美羅培南為75%，而雷西林—他唑巴坦僅占44%，即使包括急性腎功能衰竭患者（27%）。其它研究也發(fā)現(xiàn)重癥患者體內(nèi)抗生素濃度部分比例較高、部分不足的情況[6]。最近，歐洲聯(lián)盟委員會(huì)發(fā)布了一份文件“人類健康中謹(jǐn)慎使用抗菌藥物的指南”[7]，其中倡議廣泛開展抗生素檢測(cè)，改善對(duì)耐藥病原體和危及生命的感染的診斷測(cè)試。目前，抗生素檢測(cè)領(lǐng)域已有大規(guī)模微量抗生素聯(lián)合檢測(cè)的論文，如磺胺類[8]、氟喹諾酮類[9]、β-內(nèi)酰胺類[5]、大環(huán)內(nèi)酯類[10]、氨基糖苷類[11]、四環(huán)素類[12]等。Lefeuvre等[13]同時(shí)檢測(cè)血液中15種抗生素，包括青霉素（阿莫西林、苯唑西林、哌拉西林和替卡西林)、頭孢菌素（頭孢吡肟、頭孢噻肟、頭孢他啶和頭孢曲松）、碳青霉烯類(厄塔培南、亞胺培南和美羅培南），林可酰胺（克林霉素），喹諾酮類（氧氟沙星和環(huán)丙沙星）和他唑巴坦，線性范圍0.5～32 mg/L，最低檢出限為0.02～0.1 mg/L，符合抗生素聯(lián)合檢測(cè)的相關(guān)要求。

2 抗生素前處理技術(shù)進(jìn)展

臨床用藥中抗生素聯(lián)合分析要求其檢測(cè)范圍廣、靈敏且穩(wěn)定，如何純化與分離待測(cè)樣品至關(guān)重要，例如，血液、尿液、糞便。液相微萃取技術(shù)[14]始于1990年，由于分子結(jié)構(gòu)、大小、物理化學(xué)性質(zhì)及藥物濃度的巨大差異，傳統(tǒng)單一抗生素分析的前處理技術(shù)不能滿足聯(lián)合抗生素分析，尤其是對(duì)于化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的同類抗生素更具有很大困難。從直接進(jìn)樣到調(diào)節(jié)pH優(yōu)化[15]再到不同種類的固相萃取住分離[16]與液相微萃取[17]，克服不同基質(zhì)對(duì)被分析物測(cè)定影響，被廣泛應(yīng)用在抗生素監(jiān)測(cè)中。

2.1 固相萃取法

血液、尿液與糞便等基質(zhì)相對(duì)復(fù)雜，有機(jī)溶劑萃取能夠在一定程度上純化樣品，降低雜質(zhì)峰干擾，所以在這類基質(zhì)前處理中SPE和SPME經(jīng)常被使用。其過程主要分為活化、上樣、淋洗和洗脫四部分，通過使用不同材料可以針對(duì)不同結(jié)構(gòu)的抗生素達(dá)到最大的純化、分離和富集效果。不同種類的SPE柱如Oasis、Bond柱在抗生素分析中長(zhǎng)被使用[18]。2018年Olga等[19]利用C18柱上進(jìn)行固相萃取用于定量測(cè)定血漿和尿液中阿霉霉素，進(jìn)而開展藥代動(dòng)力學(xué)及藥物監(jiān)測(cè)療法的研究，在臨床中將其應(yīng)用于監(jiān)測(cè)小兒癌癥患者中的阿奇霉素含量測(cè)定并評(píng)估醫(yī)護(hù)人員暴露量。李龍等[20]在固相萃取基礎(chǔ)上建立注射器內(nèi)膜固相萃取裝置，以熒光胺為衍生劑，實(shí)現(xiàn)同步化衍生萃取體系測(cè)定磺胺甲惡唑。趙穎雅等[21]通SPE板萃取測(cè)量胎糞中的抗生素暴露量，進(jìn)而評(píng)估懷孕期間累積的抗生素暴露量對(duì)胎兒生長(zhǎng)的影響。Malgorzata等[22]利用C18固相微萃取柱實(shí)現(xiàn)人血中11種抗生素檢測(cè)及其藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究，通過基質(zhì)輔助激光解吸/電離 飛行時(shí)間質(zhì)譜 （MALDI /TOF-MS）對(duì)目標(biāo)化合物的定性及定量分析。

2.2 液相萃取法

隨著液相萃取技術(shù)發(fā)展，萃取劑用量少、快速、簡(jiǎn)便、微型化的萃取技術(shù)已逐漸成為主流，在其基礎(chǔ)上發(fā)展的液相微萃取[23]、液液分散微萃取[24]等技術(shù)逐漸在抗生素檢測(cè)前處理中廣泛應(yīng)用，尤其對(duì)于血液中磷脂基質(zhì)干擾，液相萃取無(wú)疑為最好的選擇。2020年最新實(shí)驗(yàn)表明，Natalia等[25]利用液液萃取技術(shù)結(jié)合表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)成功用于檢測(cè)尿液中磺胺甲惡唑，實(shí)驗(yàn)酸化稀釋的尿液并通過氯仿提取和抑制背景信號(hào)，使用銀納米顆粒作為底物在30 min內(nèi)全部檢測(cè)流程，其最低檢出限低至1.7 μg/mL。依據(jù)萃取溶劑與基質(zhì)的接觸方式，液液分散微萃取主要分為三大類：1）單滴微萃取；2）中空纖維膜微萃??；3）分散液液微萃取。基于各種萃取技術(shù)在抗生素實(shí)際檢測(cè)中基質(zhì)復(fù)雜程度及被分析物特點(diǎn)加以不同輔助手段亦可在一定程度上提升前處理效果，例如，微波輔助、超聲輔助、空氣輔助、渦流輔助及離子液體等[26]。Vincenzo等[27]對(duì)醫(yī)院獲得性肺炎患者血漿中抗生素進(jìn)行分析，血樣處理中加入氯化鈉和氫氧化鈉進(jìn)行預(yù)處理，將1-十二烷醇作為萃取溶劑，將注射器作為萃取容器反復(fù)抽拉，過程中萃取溶劑以小液滴形式分散在基質(zhì)中進(jìn)行萃取，離心后，1-十二烷醇的浮在表面上的有機(jī)液滴固化，利用有機(jī)溶劑溶解分析。賈少東等[28]利用有機(jī)液滴固化和分散液-液微萃取聯(lián)合應(yīng)用定量人尿中5種大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，結(jié)果表明最低檢測(cè)限為10～40 ng/mL，日內(nèi)和日間精度小于8.7%和12.6%，絕對(duì)回收率值約為100%。

2.3 雙水相體系萃取

雙水相體系分離基質(zhì)中利用被分析抗生素在兩相間的分配系數(shù)不同，而進(jìn)行純化與富集的一種技術(shù)，近年來(lái)廣泛在生物大分子提取及檢測(cè)中廣泛應(yīng)用。常見的雙水相體系包括高分子聚合物雙水相、表面活性劑雙水相、小分子有機(jī)溶劑雙水相及離子液體雙水相。王蕓等[29]就抗生素在乙醇/ 2-丙醇-硫酸銨兩相分配行為和分配機(jī)理進(jìn)行詳細(xì)闡述，結(jié)果顯示四環(huán)素鹽酸鹽在pH=1.52時(shí)，該雙水相體系分配系數(shù)和回收率可以達(dá)到30.03%和87.70%，也進(jìn)一步驗(yàn)證了小分子有機(jī)溶劑雙水相體系在分析方面的應(yīng)用原理與前景。Afshin等[32]利用氯化膽堿/磷酸鉀雙水相體系萃取頭孢氨芐，并優(yōu)化了兩相配比、鹽離子效應(yīng)及溫度，實(shí)現(xiàn)了以分離為目的的高質(zhì)量藥物分離、提取與分析。

3 抗生素樣品檢測(cè)技術(shù)

危重癥患者多種類、覆蓋性檢測(cè)尤為重要，這需要相應(yīng)匹配的檢測(cè)技術(shù)，目前，不同基質(zhì)中抗生素檢測(cè)取得長(zhǎng)足的發(fā)展，在靈敏度及穩(wěn)定性方面都得以極大提升，尤其質(zhì)譜等高精度檢測(cè)儀器的應(yīng)用，使得低含量抗生素分析及代謝研究的得以廣泛應(yīng)用。通過分析2015年至今抗生素在人體體液、代謝等方面的分析檢測(cè)技術(shù)（見圖1），結(jié)果顯示HPLC是抗生素檢測(cè)的主流技術(shù)。

圖1 2015年至今人體體液、代謝領(lǐng)域抗生素檢測(cè)技術(shù)分布

3.1 色譜分析方法

高效液相色譜（HPLC）技術(shù)在一定程度上可以實(shí)現(xiàn)多種目標(biāo)物質(zhì)的有效分離，同時(shí)針對(duì)抗生素種類及結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，搭配串聯(lián)不同類型檢測(cè)器是目前最常使用的分析手段。近年來(lái)，MS[33]、二極管陣列（DAD）[34]、紫外（UV）、熒光（FLD）[35]、電化學(xué)檢測(cè)器[36]等檢測(cè)器都是抗生素分析中經(jīng)典分析技術(shù)，其中MS由于其靈敏度高且可用于結(jié)構(gòu)及代謝分析等優(yōu)勢(shì)成為目前最常用的檢測(cè)器。尤其是對(duì)聯(lián)合使用抗生素分析，Giancarlola Marca等[37]利用LC/MS定量?jī)和裳呱系睦芜虬?，并?yàn)證其在干血斑紙上的穩(wěn)定性可維持至少1個(gè)月。Detosterd等[38]利用甲醇沉淀血漿蛋白并進(jìn)行MS檢測(cè)重癥細(xì)菌感染患者中美洛培南，頭孢吡肟中12種抗生素。在最新研究中，Marta等[39]利用液相色譜-四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜法測(cè)定尿樣中的苯酚類抗生素及其葡萄糖醛酸代謝產(chǎn)物，使用β-葡萄糖醛酸苷酶和硫酸酯酶酶解以區(qū)分游離形式和結(jié)合形式，利用分散液微萃取進(jìn)行前處理，結(jié)果顯示最低檢出限低至29.6～3 pg/mL，極大程度提高檢出限。通過減少填充物粒徑，形成超高效液相色譜進(jìn)行抗生素測(cè)定可以提高分析方法的效率，同時(shí)減少分析時(shí)間和溶劑消耗量，Sophie等[40]利用MS在2.75 min內(nèi)同時(shí)測(cè)定人血清中阿莫西林，阿奇霉素等7種抗生素。然而，由于質(zhì)譜儀器對(duì)于流動(dòng)相要求較高，價(jià)格昂貴，并且一些前處理技術(shù)中使用的萃取溶劑會(huì)對(duì)儀器造成一定影響，因此并不具有廣泛適用性。

紫外檢測(cè)器作為最廣泛使用的經(jīng)典檢測(cè)器，許多抗生素在紫外區(qū)均有較強(qiáng)的吸收，例如，磺胺類抗生素通常選取270～280 nm吸收波長(zhǎng)[41]，氟喹諾酮類抗生素255～275 nm[42]，β-內(nèi)酰胺類抗生素210～304 nm[43]，Paola等[44]利用紫外檢測(cè)器在220 nm、298 nm波長(zhǎng)下同時(shí)測(cè)定血漿樣品中萬(wàn)古霉素、美羅培南、哌拉西林和他唑巴坦的血漿水平，這些都是ICU治療中的單藥或聯(lián)合使用的抗菌劑。Nadine等[43]利用UV檢測(cè)器進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類抗生素血液藥物監(jiān)測(cè)中哌拉西林，美羅培南，頭孢他啶和氟氯西林等因素影響，結(jié)果顯示β-內(nèi)酰胺血漿樣品可以在-80 ℃下可保存 9～13個(gè)月，美羅培南和哌拉西林的化合物在4 h和6 h 后幾乎全部降解。熒光檢測(cè)器在β-內(nèi)酰胺類抗生素[45]、磺胺類抗生素[22]檢測(cè)中也經(jīng)常使用，其測(cè)定結(jié)果也能夠達(dá)到較低檢出限，但對(duì)于一些熒光信號(hào)低等抗生素在檢測(cè)前通常采取衍生化處理，由于操作復(fù)雜，且需要衍生化并不被常規(guī)使用。DAD檢測(cè)器在任意波長(zhǎng)中均可等到相應(yīng)色譜圖但相較于FLD靈敏度低。

3.2 免疫分析法

免疫分析技術(shù)是目前最適合實(shí)驗(yàn)室推廣且日常可操作性強(qiáng)的檢測(cè)技術(shù)，其靈敏度高、專一性強(qiáng)、適用于批量檢測(cè)檢測(cè)等技術(shù)在臨床檢測(cè)中被廣泛應(yīng)用，包括放射性免疫、發(fā)光免疫、酶聯(lián)免疫吸附[46]和免疫傳感器等。目前，大部分抗生素均已建立免疫測(cè)定法，如四環(huán)素、磺胺二甲基嘧啶、氯霉素等。韓帥娟等[47]利用膠體金的比色試紙法測(cè)定血液和尿液磺胺類和四環(huán)素類等26種藥物，其最低檢出限分別為3～4 ng/mL；和4.5～6 ng/mL，回收率在78.4%～112.6%之間。

3.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法分離抗生素是以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力，不同組分抗生素在毛細(xì)管中由于淌度和分配行為上的差異而實(shí)現(xiàn)分離。Thi Ngoc等[48]使用電容耦合非接觸式電導(dǎo)率毛細(xì)管電泳儀測(cè)定越南重癥患者中多利培南，美羅培南，亞胺培南和厄他培南四種碳青霉烯類抗生素，實(shí)驗(yàn)中使用CE-C4D藥物控制及質(zhì)量監(jiān)測(cè)工具，其最低檢出限為0.36 mg/L和0.45 mg/L。Prasanta等[49]總結(jié)此項(xiàng)技術(shù)從藥物質(zhì)控角度分析不同原理毛細(xì)電泳設(shè)備實(shí)現(xiàn)青霉素、氟喹諾酮、大環(huán)內(nèi)酯類和林可酰胺四類多種抗生素快速分析，這類方法不僅增加了檢驗(yàn)方式便攜性，而且滿足經(jīng)濟(jì)性等要求。

3.4 薄層色譜

薄層色譜用于定性和定量分析的最簡(jiǎn)單的色譜分離技術(shù)之一。它適用于測(cè)定易降解且光譜與其降解產(chǎn)物強(qiáng)烈重疊的化合物。Khalid等[50]利用TLC-光度法和分光光度法在堿誘導(dǎo)下測(cè)定頭孢西丁鈉降解產(chǎn)物，結(jié)果顯示以甲醇為溶劑層色譜-光度法靈敏度較以水為溶劑一階導(dǎo)數(shù)分光光度法靈敏度高。陳麗王雙英等[51]總結(jié)薄層色譜的基礎(chǔ)上結(jié)合生物自顯技術(shù)應(yīng)用，將色譜層（吸附劑或紙）置于接種過細(xì)菌的瓊脂盤上或置于細(xì)菌懸浮液中，再進(jìn)行培養(yǎng)，尋找抗細(xì)菌、抗真菌藥物及進(jìn)行藥品質(zhì)控。

4 結(jié)語(yǔ)

近年來(lái)，不斷有各種前處理技術(shù)被開發(fā)用于藥物分析中，涉及毒性、代謝、藥物濃度檢測(cè)等不同用途中，就分析過程而言，前沿前處理技術(shù)在實(shí)際消耗量及通量方面都有很大程度進(jìn)步。當(dāng)今，大部分的抗生素檢測(cè)都在HPLC串聯(lián)質(zhì)譜進(jìn)行，在代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)分析及精準(zhǔn)定量方面都顯示其優(yōu)勢(shì)，但設(shè)備及維護(hù)成本相對(duì)較高，隨著檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，高效、靈敏、便攜的檢測(cè)設(shè)備及方法將被相繼開發(fā)，小型化檢測(cè)設(shè)備研究將成為在藥物臨床監(jiān)測(cè)領(lǐng)域重點(diǎn)，隨著研究深入發(fā)展，抗生素分析及前處理將取得較大進(jìn)步并直接引導(dǎo)臨床用藥精準(zhǔn)化、個(gè)體化化發(fā)展。