樺褐孔菌醇提物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的保護(hù)作用

付雯雯，劉學(xué)瑩，崔賀銘，張玉瑩，于 萍，李沅耕，鄔 丹，高 洋，武 毅*

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021；2.日本國神奈川縣川崎市納米醫(yī)療創(chuàng)新中心，川崎 210-0821）

心肌缺血是一種具有高發(fā)病率和高病死率的心血管疾病，重建血液供應(yīng)是治療心肌缺血的主要手段，但血流恢復(fù)過程中產(chǎn)生的嚴(yán)重刺激進(jìn)一步加重了心肌損傷[1]，可能導(dǎo)致患者產(chǎn)生心肌頓挫和心律失常等，發(fā)生心肌缺血再灌注（MI/R）損傷的病理現(xiàn)象[2]。研究[3-4]表明，心肌缺血再灌注損傷的發(fā)生可能與MI/R過程中產(chǎn)生大量活性氧及其引起的氧化應(yīng)激、鈣超載和心肌細(xì)胞凋亡和炎癥等有關(guān)。因此，有效緩解心肌缺血再灌注損傷具有重要意義。樺褐孔菌（inonotus obliquus）是一種生長在白樺樹上的可食用真菌，其主要生物活性成分為多糖、多酚、黑色素和三萜等[5]。研究[6-7]顯示樺褐孔菌具有抗腫瘤、降血脂、調(diào)節(jié)代謝紊亂和抗氧化等作用，但樺褐孔菌在心肌缺血再灌注損傷中的作用研究較少。本實(shí)驗(yàn)旨在探究樺褐孔菌醇提物對大鼠心肌缺血再灌注損傷的影響，并初步探討其潛在的保護(hù)作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 試劑與儀器

樺褐孔菌（inonotus obliquus）采集自吉林??；AST試劑盒、LDH試劑盒、CK-MB試劑盒、SOD試劑盒、MDA試劑盒、GSH-px試劑盒和CAT試劑盒購自南京建成生物工程研究所。彩色多普勒超聲便攜機(jī)GE Vivid I（GE Healthcare），電熱鼓風(fēng)干燥箱101A-3E（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司），電子天平ALC-10.4（上海精密科學(xué)儀器公司），離心機(jī)TDL-40B（上海安亭科學(xué)儀器廠），高速低溫離心機(jī)D37520（Heraeus）；制冰機(jī)SIM-F140（SANYO），低溫冰柜U570（NBS），酶標(biāo)儀PC384（Molecular Devices），電動玻璃勻漿機(jī)DY89-I（寧波新芝科器研究所）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物

雌性健康Wistar大鼠125只，體質(zhì)量230～250 g，購自遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，合格證號：SCXK（遼）-2015-0001。

1.3 樺褐孔菌醇提物制備

精密稱重樺褐孔菌2 500 g，在室溫下浸入12.5 L蒸餾水中過夜，在80 ℃下提取2.5 h，再通過3層紗布過濾后收集上清液，重復(fù)2次。旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮濾液，然后在60 ℃下干燥，壓碎過80目篩子以獲得初提物。將初提物加入12.5 L 95%乙醇，在75 ℃下提取2.5 h。通過3層紗布過濾收集上清液，重復(fù)萃取2次。收集濾液并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，然后在60 ℃下干燥，壓碎并過80目篩子以獲得樺褐孔菌醇提物備用。

1.4 實(shí)驗(yàn)分組

將Wistar大鼠隨機(jī)分為5組：假手術(shù)組，模型組，樺褐孔菌醇提物150、300、600 mg·kg-1劑量組，每組25只大鼠。假手術(shù)組和模型組大鼠每天灌胃給予0.5% CMC-Na，樺褐孔菌醇提物組大鼠每天灌胃給予相應(yīng)劑量的樺褐孔菌醇提物，每天1次，連續(xù)給藥7 d。

1.5 模型建立方法

各組大鼠末次給予樺褐孔菌乙醇提取物1 h后，進(jìn)行手術(shù)操作：將大鼠麻醉后，固定在手術(shù)臺上進(jìn)行開胸，使大鼠心臟暴露，于其下2 mm處，用0號手術(shù)線對各組大鼠冠狀動脈左前降支進(jìn)行結(jié)扎，結(jié)扎2 h后，拉松結(jié)扎線，進(jìn)行再灌注2 h，建立MI/R模型，對于假手術(shù)組大鼠，只進(jìn)行手術(shù)操作，不進(jìn)行結(jié)扎。MI/R模型建立成功后，檢測大鼠心臟功能、心肌梗死面積、血液生化學(xué)等相關(guān)指標(biāo)。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 心臟功能檢測 再灌注2 h后，腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠。應(yīng)用彩色多普勒超聲便攜機(jī)檢測大鼠心臟功能相應(yīng)指標(biāo)。各指標(biāo)參數(shù)以雙盲方式進(jìn)行測量，測量結(jié)果為連續(xù)3個(gè)心動周期的平均值。

1.6.2 心肌梗死面積檢測 再灌注2 h后，處死大鼠剖取心臟，測定心肌梗死面積。用生理鹽水對大鼠心腔進(jìn)行清洗，切除心房，對左心室濕重進(jìn)行稱量，再將左心室進(jìn)行切片，將切片樣本放置于0.5%NBT磷酸緩沖液中浸沒，在37 ℃水浴條件下孵育20 min。染色結(jié)束后取出切片標(biāo)本進(jìn)行觀察。心肌梗死的面積百分比計(jì)算=缺血心肌組織重/左心室濕重×100%。

1.6.3 心肌三酶的測定 再灌注2 h后，采集大鼠腹主動脈血1 mL，將血液樣本靜置2 h后，用離心機(jī)以2 000 r·min-1進(jìn)行離心，10 min后分離出血清。按照試劑盒說明書的方法檢測大鼠血清肌酸激酶同工酶（CK-MB）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）及乳酸脫氫酶（LDH）活性。

1.6.4 心肌組織中氧化應(yīng)激指標(biāo)測定 再灌注2 h，采血結(jié)束后，取出大鼠心臟用于進(jìn)行大鼠心肌組織勻漿的制備。用預(yù)冷生理鹽水反復(fù)清洗大鼠的心肌組織，將殘留的血液去除后，將心肌組織用濾紙拭干，進(jìn)行稱質(zhì)量。在樣本中加入生理鹽水，在低溫條件下用玻璃勻漿機(jī)獲取勻漿樣本。用離心機(jī)進(jìn)行離心，轉(zhuǎn)速為3 500 r·min-1，時(shí)間為15 min，移取上清液分裝至潔凈的EP管中，在-80 ℃的環(huán)境下保存。樣本制備完成后，按照試劑盒說明書的方法檢測心肌組織中超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-px）活性和丙二醛（MDA）含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 進(jìn)行分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較采用Student’st-test，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠心臟功能比較

見表1。

表1 各組大鼠心臟功能比較（±s，n= 8）

表1 各組大鼠心臟功能比較（±s，n= 8）

注：與假手術(shù)組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01

組別 劑量/（mg·kg-1） LVIDd/mm LVIDs/mm LVEF/% LVFS/%假手術(shù)組 — 4.00±0.54 2.50±0.54 85.63±3.66 48.88±5.89模型組 — 6.25±1.16## 4.38±0.52## 51.75±6.39## 24.13±5.00##樺褐孔菌醇提物組150 5.25±0.46△ 3.63±0.52△ 63.25±4.83△△ 31.50±4.34△△300 5.13±0.83△ 3.50±0.53△△ 70.13±4.76△△ 37.25±5.06△△600 5.00±0.76△ 3.38±0.52△△ 72.38±4.27△△ 39.13±5.19△△

2.2 各組大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比較

見表2。

表2 各組大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比較（±s，n= 10）

表2 各組大鼠血清中CK-MB、AST和LDH活性比較（±s，n= 10）

注：與假手術(shù)組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別劑量/（mg·kg-1）CK-MB/（ng·mL-1）AST/（U·L-1）LDH/（U·L-1）假手術(shù)組 — 74.40±9.51 27.66±3.13 11 472.22±881.40模型組 — 130.98±13.97## 67.04±5.39## 15 144.22±509.96##樺褐孔菌醇提物組150 92.62±12.81△△ 52.39±7.34△△ 13 581.09±672.32△△300 80.78±12.36△△ 48.19±8.05△△ 13 329.67±835.27△△600 77.15±12.45△△ 41.79±7.12△△ 13 071.21±663.15△△

2.3 各組大鼠心肌組織中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比較

見表3。

表3 各組大鼠心肌組織中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比較（±s，n= 10）

表3 各組大鼠心肌組織中MDA含量和SOD、CAT、GSH-px活性比較（±s，n= 10）

注：與假手術(shù)組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量 /（ mg·kg-1） MDA/（nmol·mgprot-1） SOD/（U·mgprot-1） CAT/（U·mgprot-1） GSH-px/（U·mgprot-1）假手術(shù)組 — 1.40±0.24 321.97±55.66 3.82±0.56 7.99±0.95模型組 — 2.60±0.29## 237.05±30.75## 2.66±0.24## 4.35±0.64##樺褐孔菌醇提物組150 2.06±0.19△△ 279.94±50.61△ 3.21±0.48△△ 6.69±0.94△△300 1.74±0.37△△ 289.28±26.50△△ 3.61±0.53△△ 6.79±1.59△△600 1.70±0.38△△ 295.10±38.85△△ 3.68±0.46△△ 7.03±0.86△△

2.4 各組大鼠心肌梗死面積比較

見表4。

表4 各組大鼠心肌梗死面積比較（±s，n= 10）

表4 各組大鼠心肌梗死面積比較（±s，n= 10）

注：與假手術(shù)組比較，## P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01

組別 劑量 /（mg·kg-1） 梗死面積/%假手術(shù)組 — 0.00±0.00模型組 — 38.13±4.72##樺褐孔菌醇提物組150 25.42±5.69△△300 22.56±4.20△△600 21.07±5.26△△

3 討論

再灌注是臨床上治療心肌缺血的有效手段，然而在心肌缺血再灌注過程中，心肌細(xì)胞經(jīng)歷了缺氧/復(fù)氧及PH突然變化，血管阻塞，導(dǎo)致氧化應(yīng)激等現(xiàn)象發(fā)生，從而誘導(dǎo)心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡，對心臟結(jié)構(gòu)造成破壞[8]。因此，開發(fā)新的治療藥物以減少再灌注過程對心肌組織產(chǎn)生的進(jìn)一步損傷具有重要的理論和現(xiàn)實(shí)意義。近年來，從傳統(tǒng)醫(yī)藥中發(fā)現(xiàn)新型治療藥物成為研究熱點(diǎn)，研究[9-10]表明傳統(tǒng)醫(yī)藥在對抗心肌缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用。樺褐孔菌是生長在西伯利亞的可食用真菌，早在16世紀(jì)就開始被用來防治多種疾病。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)，其有良好的抗氧化、抗炎等藥理作用。研究[13]表明，樺褐孔菌能有效抑制心肌細(xì)胞的凋亡，提高心肌細(xì)胞活力。研究結(jié)果顯示，與模型組比較，樺褐孔菌醇提物各劑量組能明顯改善大鼠心臟功能，減小心肌梗死面積，表明樺褐孔菌醇提物在缺血再灌注過程中對心肌組織具有保護(hù)作用。

在心肌缺血再灌注過程中，產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致機(jī)體氧自由基的產(chǎn)生和清除的平衡被打破，使得機(jī)體進(jìn)入氧化應(yīng)激狀態(tài)，對心肌造成損傷[14-15]。氧化應(yīng)激狀態(tài)下，大量的氧自由基會導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化對膜磷脂造成損壞，對心肌細(xì)胞膜完整性造成破壞，使心肌酶從胞內(nèi)漏出。因此血清中的心肌酶的活性水平可以反映心肌細(xì)胞受損的程度[16-17]。在氧化應(yīng)激條件下，發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，并最終產(chǎn)生MDA[18]。MDA是脂質(zhì)過氧化的標(biāo)志物，它可以進(jìn)一步引起蛋白質(zhì)，核酸和其他生物大分子的交聯(lián)聚合，從而進(jìn)一步損害細(xì)胞，同時(shí)它的含量也用作反應(yīng)氧化應(yīng)激程度的指標(biāo)[19]。SOD、CAT、GSH-px是機(jī)體的抗氧化酶，可以清除體內(nèi)的氧自由基，其活性水平代表了機(jī)體清除氧自由基及對抗氧化應(yīng)激的能力[20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，樺褐孔菌醇提物各劑量組能顯著降低血清中CK-MB、AST和LDH活性，同時(shí)降低SOD、CAT、GSH-px活性，增強(qiáng)MDA含量，表明樺褐孔菌醇提物可以抑制氧化應(yīng)激產(chǎn)生的脂質(zhì)過氧化，并增強(qiáng)機(jī)體氧自由基的清除能力。

綜上所述，樺褐孔菌醇提物可以對抗心肌缺血再灌注損傷過程中產(chǎn)生的氧化應(yīng)激反應(yīng)，增強(qiáng)心肌細(xì)胞對氧自由基的清除能力，對心肌細(xì)胞起保護(hù)作用。