益腎通絡(luò)方抑制EGFR及下游信號途徑對膜性腎病大鼠腎臟保護(hù)作用的研究

陳素枝，楊鳳文，李永章，宋 蕾，王廣建，檀 淼，袁國棟，楊 冰，張 堯，趙 方，檀金川*

益腎通絡(luò)方抑制EGFR及下游信號途徑對膜性腎病大鼠腎臟保護(hù)作用的研究

陳素枝1，楊鳳文1，李永章1，宋 蕾2，王廣建1，檀 淼3，袁國棟1，楊 冰4，張 堯4，趙 方4，檀金川1*

1. 河北省中醫(yī)院，河北 石家莊 050011 2. 天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617 3. 河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院，河北 石家莊 050011 4. 河北中醫(yī)學(xué)院，河北 石家莊 050200

探究益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）及足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響。SD大鼠尾iv陽離子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）建立膜性腎病大鼠模型，給予益腎通絡(luò)方和鹽酸貝那普利進(jìn)行干預(yù)，檢測各組大鼠24 h尿蛋白（urine total protein，UTP）、血清中白蛋白（albumin，ALB）和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平；觀察各組大鼠腎組織病理變化；采用TUNEL法檢測各組大鼠腎組織足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況；采用免疫組化法檢測各組大鼠腎組織磷酸化EGFR（p-EGFR）和剪切型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）的表達(dá)情況；采用Western blotting法檢測各組大鼠腎組織p-EGFR、Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)情況。與對照組比較，模型組大鼠24 h UTP以及血清中TC水平明顯升高（＜0.01），ALB水平顯著降低（＜0.01）；腎小球基底膜、足細(xì)胞結(jié)構(gòu)發(fā)生改變；腎組織足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯增多（＜0.01）；腎組織p-EGFR、Rac1、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，益腎通絡(luò)方中、高劑量組大鼠24 h UTP以及血清中TC水平明顯降低（＜0.01），ALB水平明顯升高（＜0.01）；腎組織病理損傷得到改善；腎組織足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡明顯減少（＜0.05、0.01），腎組織p-EGFR、Rac1、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯降低（＜0.05、0.01）。益腎通絡(luò)方可以減輕膜性腎病大鼠腎臟病理損傷，抑制腎組織足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與抑制EGFR及下游Rac1/c-jun、c-fos/FasL信號途徑有關(guān)。

益腎通絡(luò)方；膜性腎?。槐砥どL因子受體；足細(xì)胞；腎小管上皮細(xì)胞；凋亡

膜性腎病是成人腎病綜合征的最常見原因，近年來我國膜性腎病的發(fā)病率急劇增加[1]，可能超過IgA腎病成為我國發(fā)病率最高的一種腎病[2]。目前研究認(rèn)為膜性腎病是一種自身免疫性疾病[3-4]，由免疫攻擊形成抗原抗體免疫復(fù)合物沉積于腎小球上皮細(xì)胞下，導(dǎo)致足細(xì)胞損傷。

本課題組通過前期對膜性腎病病機(jī)的深入研究，結(jié)合中醫(yī)“絡(luò)病”理論逐漸形成“腎絡(luò)瘀阻”的病機(jī)理論，并在該病機(jī)理論指導(dǎo)下創(chuàng)立益腎通絡(luò)方。前期研究證實(shí)益腎通絡(luò)方在輔助提高膜性腎病臨床療效、緩解臨床癥狀、減少激素及免疫抑制劑不良反應(yīng)等方面發(fā)揮重要優(yōu)勢[5]，其作用機(jī)制與防止膜性腎病大鼠足細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白Ezrin、Synaptopodin降解，維持足細(xì)胞骨架及足突結(jié)構(gòu)的完整性有關(guān)[6]。前期研究發(fā)現(xiàn)，膜性腎病中不僅存在足細(xì)胞損傷，還存在腎小管上皮細(xì)胞損傷，益腎通絡(luò)方可以同時(shí)減少足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡，推測膜性腎病中可能存在1個(gè)同時(shí)介導(dǎo)腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的信號途徑，且益腎通絡(luò)方對該信號途徑可能具有調(diào)節(jié)作用。本研究采用尾iv陽離子牛血清白蛋白（cationic bovine serum albumin，C-BSA）建立膜性腎病大鼠模型，探討益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）及下游信號級聯(lián)反應(yīng)的作用，為其臨床推廣提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

清潔級雄性SD大鼠74只，體質(zhì)量（180±20）g，8周齡，由河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物許可證號SYXK（冀）2008-0026。動(dòng)物于河北中醫(yī)學(xué)院SPF級實(shí)驗(yàn)中心環(huán)境中適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)河北中醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號DWLL2020046）。

1.2 藥品與試劑

益腎通絡(luò)方配方顆粒購自廣東一方制藥有限公司，由黃芪（批號5063231）20 g、炒白術(shù)（批號505207T）15 g、黨參（批號5060421）15 g、仙靈脾（批號411420T）15 g、當(dāng)歸（批號5061851）15 g、莪術(shù)（批號5061671）12 g、水蛭（批號504432T）9 g、地龍（批號5062171）12 g、絞股藍(lán)（批號407347T）15 g組成；鹽酸貝那普利片（批號FA20150902，10 mg/片）購自深圳信立泰藥業(yè)股份有限公司；C-BSA（批號A7906）購自北京索萊寶科技有限公司；弗式不完全佐劑（批號BJ-012-0392）購自美國Sigma公司；山羊抗大鼠IgG抗體（批號20147-1）、FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體（批號111-095-003）購自美國KPL公司；磷酸化EGFR（p-EGFR）抗體（批號AF3004）、Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1，Rac1）抗體（批號AF4200）、c-jun抗體（批號AF6090）、剪切型半胱氨酸蛋白酶-3（cleaved Caspase-3）抗體（批號AF7022）、FasL抗體（批號AF0157）、c-fos抗體（批號AF0132）和β-actin抗體購自美國Affinity公司；兔抗大鼠p-EGFR多克隆抗體（批號ab40815）、兔抗大鼠cleaved Caspase-3多克隆抗體（批號ab52072）、TUNEL試劑盒（批號ab206386）購自英國Abcam公司；HRP標(biāo)記的IgG抗體（批號sc-2357）購自美國Santa Cruz Biotechnology公司。

1.3 儀器

TP 1020型脫水機(jī)、包埋機(jī)、RM2016型切片機(jī)（德國Leica公司）；多功能真彩色細(xì)胞圖象分析管理系統(tǒng)（美國Media Cybernetics公司）；3K30型高速低溫離心機(jī)（美國Sigma公司）；BX51T-PHD-J11型顯微鏡（日本Olympus公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；7170A型全自動(dòng)生化分析儀（日本日立公司）。

2 方法

2.1 造模、分組與給藥

隨機(jī)取12只SD大鼠作為對照組，其余大鼠參照Border法[7]制備膜性腎病模型：1 mg C-BSA溶于0.5 mL 0.9%氯化鈉溶液，并與等體積弗氏不完全佐劑充分乳化，分別于大鼠雙前肢腋下及雙腹股溝處sc 1 mL乳化劑進(jìn)行預(yù)免疫，隔日1次，每周3次，預(yù)免疫1周；預(yù)免疫結(jié)束后，大鼠尾iv乳化劑（16 mg/kg）進(jìn)行正式免疫[8]，隔日1次，每周3次，正式免疫4周；對照組大鼠尾iv等體積0.9%氯化鈉溶液。造模結(jié)束后隨機(jī)取造模大鼠2只進(jìn)行腎臟病理檢查，確認(rèn)造模成功。造模期間造模組大鼠死亡1只，將剩余的59只造模組大鼠隨機(jī)分為模型組11只、鹽酸貝那普利（10 mg/kg）組以及益腎通絡(luò)方低、中、高劑量（6.61、13.22、26.44 g/kg）[6]組，每組12只。各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mg/kg），對照組和模型組ig等體積蒸餾水，1次/d，連續(xù)4周。

2.2 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠24 h尿蛋白（urine total protein，UTP）、血清中白蛋白（albumin，ALB）和總膽固醇（total cholesterol，TC）水平的影響

分別于造模前、造模后、給藥后收集各組大鼠24 h尿液，記錄尿量，離心后取上清液，檢測24 h UTP。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，大鼠ip 10%水合氯醛麻醉，股動(dòng)脈采血，離心取上清，采用全自動(dòng)生化分析儀檢測血清中ALB和TC水平。

2.3 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織病理變化的影響

取各組大鼠腎組織，于2.5%戊二醛固定液中固定，梯度乙醇脫水后包埋、固化，采用超薄切片機(jī)切片（厚70 nm），加入FITC標(biāo)記的兔抗山羊IgG抗體孵育，于顯微鏡下觀察IgG熒光沉積情況并拍照；取各組大鼠腎組織切片，進(jìn)行3%醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色，于透射電鏡下觀察并拍照。

2.4 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

取各組大鼠腎組織，按TUNEL試劑盒說明書檢測足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡情況。

2.5 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織p-EGFR和cleaved Caspase-3表達(dá)的影響

取各組大鼠腎組織，于10%中性甲醛固定液中固定，脫水、二甲苯透明后切片（厚4 μm），常規(guī)脫蠟至水，抗原修復(fù)，加入3% H2O2清除過氧化物酶活性，滴加50 μL山羊血清封閉，滴加p-EGFR和cleaved Caspase-3多克隆抗體孵育，滴加山羊抗大鼠IgG抗體，加入DAB染液顯色，蘇木素復(fù)染3 min，封片，于顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織p-EGFR和cleaved Caspase-3表達(dá)情況。

2.6 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織p-EGFR、Rac1、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

取各組大鼠腎組織，加入RIPA裂解液提取蛋白，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5% BSA封閉1.5 h，加入p-EGFR、Rac1、c-jun、cleaved Caspase-3、FasL、c-fos和β-actin抗體，4 ℃孵育過夜；加入HRP標(biāo)記的IgG抗體，37 ℃孵育1 h，加入ECL發(fā)光液顯影，采用Image J軟件分析條帶。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠24 h UTP、血清ALB和TC水平的影響

如表1所示，與對照組比較，模型組大鼠24 h UTP以及血清中TC水平明顯升高（＜0.01），ALB水平顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方中、高劑量組及鹽酸貝那普利組大鼠24 h UTP 以及血清中TC水平明顯降低（＜0.01），ALB水平明顯升高（＜0.01）。

表1 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠24 h UTP及血清ALB、TC水平的影響()

與對照組比較：**＜0.01；與模型組比較：#＜0.05##＜0.01；與鹽酸貝那普利組比較：△＜0.05△△＜0.01，下表同

**< 0.01control group;#< 0.05##< 0.01model group;△< 0.05△△< 0.01benazepril hydrochloride group, same as below tables

3.2 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織病理變化的影響

如圖1所示，對照組大鼠腎小球基底膜未見IgG熒光沉積，模型組大鼠腎小球基底膜可見大量IgG熒光沉積，益腎通絡(luò)方中、高劑量組和鹽酸貝那普利組腎小球基底膜可見少量IgG熒光沉積，益腎通絡(luò)方低劑量組腎小球基底膜IgG熒光沉積較多。

如圖2所示，對照組腎小球基底膜、足細(xì)胞結(jié)構(gòu)未見異常改變；模型組大鼠腎小球基底膜增厚明顯，上皮下大量電子致密物沉積，足突融合嚴(yán)重；益腎通絡(luò)方中、高劑量組和鹽酸貝那普利組腎小球結(jié)構(gòu)均有所改善。

3.3 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

如圖3和表2所示，對照組大鼠腎小管上皮細(xì)胞和腎小球足細(xì)胞未見凋亡細(xì)胞；與對照組比較，模型組大鼠腎小管上皮細(xì)胞凋亡率顯著升高（＜0.01），每個(gè)腎小球切面足細(xì)胞凋亡數(shù)明顯升高（＜0.01）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方中、高劑量組和鹽酸貝那普利組腎小管上皮細(xì)胞凋亡率和每個(gè)腎小球切面足細(xì)胞凋亡數(shù)明顯減少（＜0.05、0.01）。

圖1 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織IgG熒光沉積的影響

圖2 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織超微結(jié)構(gòu)的影響

圖3 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響

表2 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡的影響()

3.4 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織p-EGFR和cleaved Caspase-3表達(dá)的影響

如圖4和表3所示，對照組大鼠腎小管和腎小球僅有少量p-EGFR和cleaved Caspase-3表達(dá)；模型組可見p-EGFR和cleaved Caspase-3在腎小管和腎小球均有明顯表達(dá)（＜0.01）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方中、高劑量組和鹽酸貝那普利組p-EGFR和cleaved Caspase-3表達(dá)明顯減少（＜0.01）。

3.5 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織p-EGFR、Rac1、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

如圖5和表4所示，與對照組比較，模型組大鼠腎組織p-EGFR、Rac1、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，益腎通絡(luò)方中、高劑量組及鹽酸貝那普利組大鼠腎組織p-EGFR、Rac1、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.05、0.01），益腎通絡(luò)方低劑量組大鼠腎組織c-jun蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。

圖4 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織p-EGFR (A) 和cleaved Caspase-3 (B) 表達(dá)的影響

表3 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織p-EGFR和cleaved Caspase-3表達(dá)的影響()

圖5 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織p-EGFR、Rac1、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響

表4 益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠腎組織p-EGFR、Rac1、c-jun、c-fos、FasL和cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)的影響()

4 討論

根據(jù)中醫(yī)“絡(luò)病”理論，腎小球疾病屬于中醫(yī)腎絡(luò)之病。腎之絡(luò)脈是內(nèi)外之邪侵襲的通路與途徑，膜性腎病發(fā)病時(shí)，正邪相爭產(chǎn)生濕濁瘀毒等病理產(chǎn)物留伏于腎絡(luò)，絡(luò)脈細(xì)小，易入難出，易積成形，日久痹阻腎絡(luò)，致腎絡(luò)瘀阻。本課題組在“腎絡(luò)瘀阻”病機(jī)指導(dǎo)下創(chuàng)立益腎通絡(luò)方，臨床療效顯著。益腎通絡(luò)方方中黃芪、黨參、炒白術(shù)健脾益氣，補(bǔ)氣升提，脾健精微得升，水濕得運(yùn)，升清降濁同時(shí)利濕消腫；仙靈脾溫腎陽，固腎氣，腎陽得溫能行其溫陽化氣利水之功，腎氣得固能行其封藏固攝之本，使精微得固，水濕得化；絞股藍(lán)袪濁化痰，使有形之邪得除，脾陽得振，氣機(jī)得復(fù)，絡(luò)脈得通；四藥配伍應(yīng)用，扶人體之本虛，袪留伏之濁邪；莪術(shù)、當(dāng)歸破血行氣、逐瘀消癥，祛腎絡(luò)有形之瘀滯；地龍、水蛭入絡(luò)搜剔、松透病根，通經(jīng)活絡(luò)，絡(luò)脈暢通，邪有出路；諸藥合用健脾氣、補(bǔ)腎氣、袪痰邪、化瘀濁、通腎絡(luò)，扶正不留邪，祛邪不傷正。血漿蛋白為人體精微物質(zhì)，由后天脾臟運(yùn)化而成；UTP由脾腎虧虛，精微下注所致；血脂因痰濁凝聚而致；氣虛絡(luò)瘀，終致腎臟病理損傷。本研究結(jié)果顯示，益腎通絡(luò)方在降低UTP、升高ALB及調(diào)節(jié)血脂方面有較好的療效，并能夠在一定程度上減少足細(xì)胞和腎小管細(xì)胞凋亡、改善腎組織病理損傷，表明益腎通絡(luò)方緊扣病機(jī)、遣方得當(dāng)、組方合理、療效顯著。

EGFR是酪氨酸激酶ErbB受體家族的成員[9]。EGFR激活導(dǎo)致其胞質(zhì)部分中特定的酪氨酸殘基自磷酸化，從而引起下游信號傳導(dǎo)[9]。酪氨酸殘基充當(dāng)激活細(xì)胞內(nèi)途徑各種信號分子的?？课稽c(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡[9]。在各種類型的腎小球腎炎腎活檢組織中均觀察到EGFR表達(dá)，且在膜性腎病和局灶節(jié)段性腎小球硬化中其表達(dá)更為明顯，EGFR可能與早期硬化性病變的形成有關(guān)[10]。在大鼠腎小球上皮細(xì)胞中，亞溶解型C5b-9誘導(dǎo)EGFR的酪氨酸磷酸化，并導(dǎo)致細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶2（extracellular regulated kinase 2，ERK2）級聯(lián)反應(yīng)[11]；在糖尿病腎病模型中足細(xì)胞EGFR的表達(dá)和激活是腎臟加速損傷的介質(zhì)[12]。以上研究表明腎組織中EGFR的異常激活會導(dǎo)致腎臟病變，但其具體致病機(jī)制尚不清楚。

EGFR酪氨酸激酶被激活后，能夠通過啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號級聯(lián)反應(yīng)，從而導(dǎo)致多種生物化學(xué)變化。EGFR介導(dǎo)的主要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及c-jun氨基末端激酶（c-jun-terminal kinase，JNK）的激活[13]，Rac1是EGFR介導(dǎo)的JNK激活的上游信號分子[14-15]，EGFR的失調(diào)使Rac1活性增加。Rac1是Rho鳥苷三磷酸酶家族成員之一，參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡的調(diào)節(jié)。Rac被激活后，可以啟動(dòng)JNK級聯(lián)反應(yīng)，使JNKs完全活化；活化的JNK可以通過死亡受體途徑介導(dǎo)細(xì)胞凋亡，即激活下游轉(zhuǎn)錄因子c-jun、c-fos，上調(diào)促凋亡蛋白FasL等的表達(dá)[16]。c-jun和c-fos二聚化成活化蛋白-1（activated protein-1，AP-1）[17]，Ap-1是細(xì)胞內(nèi)一類轉(zhuǎn)錄激活因子，通過調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、死亡、存活和分化[18]。Ap-1成熟的靶標(biāo)是編碼FasL基因[18]，F(xiàn)asL作為細(xì)胞外配體與其跨膜受體Fas結(jié)合后，F(xiàn)as受體三聚化而活化，激活的受體與Fas相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated death domain protein，F(xiàn)ADD）結(jié)合，并募集Caspase-8前體使之水解活化成Caspase-8，繼而激活凋亡效應(yīng)因子Caspase-3，啟動(dòng)細(xì)胞凋亡[19]。

本研究結(jié)果顯示，尾iv C-BSA后大鼠出現(xiàn)低蛋白血癥、蛋白尿、腎小球基底膜免疫復(fù)合物沉積，并且出現(xiàn)腎小球足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡，提示造模成功；模型組腎小管細(xì)胞及腎小球磷酸化EGFR表達(dá)增多，提示EGFR的激活參與了膜性腎病的病理損傷；隨著EGFR的激活，其下游的Rac1表達(dá)相應(yīng)升高，引起JNK通路相關(guān)蛋白c-jun、c-fos表達(dá)升高，進(jìn)而使編碼轉(zhuǎn)錄FasL蛋白表達(dá)增多，最終引起細(xì)胞凋亡，表現(xiàn)為cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)顯著升高，提示EGFR的激活參與膜性腎病發(fā)病過程。中、高劑量益腎通絡(luò)方能夠下調(diào)EGFR信號途徑相關(guān)蛋白，減少足細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞凋亡，提示益腎通絡(luò)方對膜性腎病大鼠的治療作用與抑制EGFR及其下游級聯(lián)信號反應(yīng)有關(guān)。低劑量益腎通絡(luò)方對EGFR通路相關(guān)蛋白表達(dá)無明顯影響，高劑量益腎通絡(luò)方與中劑量益腎通絡(luò)方無明顯差異，這可能與動(dòng)物攝取、吸收、生物轉(zhuǎn)化等過程受限有關(guān)，也可能與組方中某些藥材用量及功效不同有關(guān)。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)EGFR信號傳導(dǎo)失調(diào)與膜性腎病腎臟病理狀況有關(guān)，干預(yù)EGFR途徑可能是治療慢性腎臟疾病的潛在手段。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Yishen Tongluo Recipe protects kidney in rats with membranous nephropathy by inhibiting EGFR and downstream signal pathway

CHEN Su-zhi1, YANG Feng-wen1, LI Yong-zhang1, SONG Lei2, WANG Guang-jian1, TAN Miao3, YUAN Guo-dong1, YANG Bing4, ZHANG Yao4, ZHAO Fang4, TAN Jin-chuan1

1. Hebei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050011, China 2. Tianjin University of Traditional Chinese Medicine, Tianjin 301617, China 3. The Fourth Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang 050011, China 4. Hebei College of Traditional Chinese Medicine, Shijiazhuang 050200, China

To explore the effect of Yishen Tongluo Recipe (益腎通絡(luò)方) on epidermal growth factor receptor (EGFR), apoptosis of podocytes and renal tubular epithelial cells in renal tissue of rats with membranous nephropathy.SD rats were tail iv cationic bovine serum albumin (C-BSA) to establish a rat model of membranous nephropathy. Yishen Tongluo Recipe and benazepril hydrochloride were given for intervention. The level of 24 h urine total protein (UTP), levels of albumin (ALB) and total cholesterol (TC) in serum of rats in each group were tested; Pathological changes of kidney tissues in rats of each group were observed; TUNEL method was used to detect podocytes and renal tubular epithelial cell apoptosis in kidneys tissue of rats in each group; Immunohistochemical method was used to detect the expressions of phosphorylated EGFR (p-EGFR) and cleaved Caspase-3 in renal tissues of rats in each group; Western blotting was used to detect expressions of p-EGFR, Ras-related C3 botulinum toxin substrate 1 (Rac1), c-jun, c-fos, FasL and cleaved Caspase-3 protein.Compared with control group, 24 h UTP and TC level in serum of rats in model group were significantly increased (< 0.01), ALB level was significantly reduced (< 0.01); Glomerular basement membrane and podocyte structure were changed; Apoptosis of podocytes and renal tubular epithelial cells in kidney were significantly increased (< 0.01); Expressions of p-EGFR, Rac1, c-jun, c-fos, FasL and cleaved Caspase-3 in renal tissue were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, 24 h UTP and TC level in serum of rats in medium- and high-dose Yishen Tongluo Recipe groups were significantly reduced (< 0.01), and ALB level was significantly increased (< 0.01); Pathological damage of kidney tissue was improved; Podocytes and renal tubular epithelial cell apoptosis in renal tissue were significantly reduced (< 0.05, 0.01); Expressions of p-EGFR, Rac1, c-jun, c-fos, FasL and cleaved Caspase-3 in renal tissue were significantly reduced (< 0.05, 0.01).Yishen Tongluo Recipe alleviates pathological damage of kidney in rats with membranous nephropathy, inhibit the apoptosis of renal podocytes and renal tubular epithelial cells, mechanism of which may be related to the inhibition of EGFR and downstream Rac1/c-jun, c-fos/FasL signal pathways.

Yishen Tongluo Recipe; membranous nephropathy; epidermal growth factor receptor; podocytes; renal tubular cells; apoptosis

R285.5

A

0253 - 2670(2021)16 - 4913 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.016

2021-01-30

河北省自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目（H2020423049）；河北省中醫(yī)藥管理局科研計(jì)劃項(xiàng)目（2021008）

陳素枝（1989—），女，主治醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)治療慢性腎臟病的研究。Tel: 18830657300 E-mail: 781506436@qq.com

檀金川（1964—），男，主任醫(yī)師，醫(yī)學(xué)博士，從事中西醫(yī)治療慢性腎臟病的研究。Tel: 13831187910 E-mail: 781506436@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]