基于IL-6/JAK2/STAT3通路探討補(bǔ)腎化痰方改善去勢(shì)大鼠骨丟失的作用機(jī)制

譚張奎，向 楠，張 妍，熊夢(mèng)欣，薛瑤珺，黃詩(shī)怡，周廣文

基于IL-6/JAK2/STAT3通路探討補(bǔ)腎化痰方改善去勢(shì)大鼠骨丟失的作用機(jī)制

譚張奎1，向 楠2，張 妍1，熊夢(mèng)欣1，薛瑤珺1，黃詩(shī)怡1，周廣文3*

1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430065 2. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，湖北 武漢 430065 3. 湖北中醫(yī)藥大學(xué)針灸骨傷學(xué)院，湖北 武漢 430065

探究補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠骨丟失和IL-6/Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）通路的影響。SD雌性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、戊酸雌二醇（0.184 mg/kg）組以及補(bǔ)腎化痰方低、中、高劑量（4.7、9.4、18.8 g/kg）組，除對(duì)照組外，其他組均采用手術(shù)切除卵巢，制作絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥模型。術(shù)后1周給予戊酸雌二醇和補(bǔ)腎化痰方進(jìn)行干預(yù)，給藥12周后取材。采用Micro CT檢測(cè)各組大鼠肱骨骨密度和骨礦物質(zhì)含量；采用蘇木素-伊紅（HE）染色法觀察各組大鼠股骨組織病理變化；采用堿性磷酸酶染色法考察各組大鼠骨髓成骨細(xì)胞數(shù)量；采用ELISA法檢測(cè)各組大鼠血清中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-17水平；采用qRT-PCR法檢測(cè)各組大鼠股骨組織、、和mRNA表達(dá)情況；采用Western blotting法檢測(cè)各組大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)情況。與對(duì)照組比較，模型組大鼠肱骨骨密度和骨礦物質(zhì)含量顯著降低（＜0.01）；骨小梁減少、稀疏，脂肪細(xì)胞增多；血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平顯著升高（＜0.01）；股骨組織、、和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；IL-6、IL-6R、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）。與模型組比較，各給藥組骨密度和骨礦物質(zhì)含量顯著增加（＜0.05、0.01）；骨小梁增多，且結(jié)構(gòu)較完整，脂肪細(xì)胞減少；補(bǔ)腎化痰方中、高劑量組大鼠骨髓成骨細(xì)胞數(shù)顯著增多（＜0.05、0.01）；各給藥組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平顯著降低（＜0.01），戊酸雌二醇組以及補(bǔ)腎化痰方中、高劑量組大鼠血清中IL-17水平顯著降低（＜0.01）；股骨組織、、和mRNA表達(dá)水平顯著降低（＜0.01），IL-6、IL-6R、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著降低（＜0.01）。補(bǔ)腎化痰方能夠改善去勢(shì)大鼠骨丟失，其機(jī)制可能與抑制IL-6/JAK2/STAT3通路有關(guān)。

補(bǔ)腎化痰方；骨丟失；絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥；去勢(shì)大鼠；IL-6/JAK2/STAT3通路

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是指絕經(jīng)后女性卵巢功能衰退且雌激素水平降低，骨形成減少，骨吸收增強(qiáng)，骨吸收大于骨形成失去平衡，出現(xiàn)以骨量減少、骨強(qiáng)度降低、骨顯微結(jié)構(gòu)退變、骨脆性增加為特征的一種代謝性骨疾病[1]，臨床上常表現(xiàn)為骨痛、脊柱變形甚至骨折等。據(jù)我國(guó)最新的骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）流行病學(xué)調(diào)查顯示，50歲以上和65歲以上人群OP患病率分別為19.2%、32.0%。隨著我國(guó)人口老齡化日益嚴(yán)重，低骨量人群即OP的高危人群數(shù)量逐年上升，50歲以上人群低骨量率為46.4%，且PMOP患病率顯著高于歐美國(guó)家[2]。目前治療PMOP的藥物主要有抗骨吸收劑（如雙膦酸鹽、迪諾塞麥、降鈣素、雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑）、促骨形成劑（如特立帕肽）等。

中醫(yī)將PMOP歸屬為“骨痿”“骨痹”“骨枯”等范疇，骨碎補(bǔ)總黃酮、淫羊藿苷和人工虎骨粉等均具有一定的抗骨質(zhì)疏松作用。湖北中醫(yī)名師向楠教授從“腎主骨生髓”的理論出發(fā)，結(jié)合多年臨床經(jīng)驗(yàn)，認(rèn)為本病在腎精不足前提下，易滋生痰濁之邪[3-6]，提出補(bǔ)腎化痰的治則；并結(jié)合《本草綱目》補(bǔ)骨脂丸與《丹溪心法》黃瓜蔞丸加減而成補(bǔ)腎化痰方[7]，其臨床療效顯著。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎化痰方可以提高PMOP模型大鼠的骨密度，促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化，抑制成脂分化[8-9]，改善PMOP大鼠骨免疫失衡狀態(tài)[10]，降低大鼠血清中白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）水平[11]。研究發(fā)現(xiàn)，IL-6對(duì)于雌激素缺乏的小鼠骨丟失是必不可少的，表明IL-6在骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[12]。本研究考察補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織IL-6/Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子3（signal transducers and activators of transcription 3，STAT3）通路的影響，為其機(jī)制探究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雌性SD大鼠90只，體質(zhì)量（220±30）g，6月齡，購(gòu)自湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究中心，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（鄂）2015-0018。動(dòng)物飼養(yǎng)于湖北中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，室溫（20±2）℃，光照通風(fēng)適宜，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)201909005）。

1.2 藥材

補(bǔ)腎化痰方由菟絲子30 g、淫羊藿10 g、補(bǔ)骨脂15 g、全瓜蔞15 g、紅曲12 g、凈山楂20 g組成；以上藥材采購(gòu)于湖北省中醫(yī)院藥房，經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)陶春暉副教授鑒定分別為旋花科植物菟絲子Lam.的種子、箭葉淫羊藿(Sieb. et Zucc.) Maxim.的干燥葉、葫蘆科植物栝樓Maxim.的干燥成熟果實(shí)、真菌類子囊菌綱曲霉目曲霉科紅曲Went.、薔薇科植物山里紅Bge. varN. E. Br.的干燥成熟果實(shí)，均符合《中國(guó)藥典》2015年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

戊酸雌二醇（批號(hào)374A，2 mg/片）購(gòu)自拜耳醫(yī)藥保健有限公司廣州分公司；Trizol（批號(hào)15596-026）購(gòu)自美國(guó)Ambion公式；RIPA裂解液（批號(hào)P0013B）、BCA蛋白定量試劑盒（批號(hào)P0010）購(gòu)自上海碧云天；HiScript Reverse Transcriptase (RNase H)、5×HiScript Buffer、50×ROX Reference Dye 2（批號(hào)R101-01/02）、SYBR Green Master Mix（批號(hào)Q111-02）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；甲醇、NaCl、KCl（批號(hào)分別為10014118、10019318、10016318）購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；兔多抗IL-6、IL-6R、STAT3、磷酸化STAT3（p-STAT3）抗體（批號(hào)分別為Df6087、Df2530、Af6494、Af3295）購(gòu)自江蘇親科生物研究中心有限公司；兔單抗JAK2、p-JAK2抗體（批號(hào)分別為3230、3776）購(gòu)自美國(guó)CST公司；HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體、HRP標(biāo)記的羊抗兔抗體、HRP標(biāo)記的兔抗大鼠抗體（批號(hào)分別為BA1051、BA1054、BA1058）購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；大鼠TNF-α、IL-6 ELISA試劑盒（批號(hào)分別為E-EL-R0019c、E-EL-R0015c）購(gòu)自武漢伊萊瑞特生物科技有限公司；BCIP/NBT堿性磷酸酯酶顯色試劑盒（批號(hào)PR1100）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。

1.4 儀器

Micro CT（瑞士Scanco公司）；QuantStudioTM6型qRT-PCR儀（美國(guó)ABI公司）；JY300型水平電泳儀、JY02S型紫外分析儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；DYCZ-40型電轉(zhuǎn)儀、DYCZ-24DN型垂直電泳槽（北京六一儀器廠）；酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；HI650型離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司）。

2 方法

2.1 補(bǔ)腎化痰方的制備

稱取補(bǔ)腎化痰方全方藥材混合，加入5倍量蒸餾水浸泡2 h，先武火再文火煎1 h，濾過(guò)；重復(fù)上述步驟，再次提取濾液，合并2次濾液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至最終藥物質(zhì)量濃度為0.94 g/mL（以生藥量計(jì)）[10]，于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 分組、造模與給藥

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、戊酸雌二醇（0.184 mg/kg）組以及補(bǔ)腎化痰方低、中、高劑量（4.7、9.4、18.8 g/kg）[13]組，每組15只。除對(duì)照組外，其他組行卵巢切除術(shù)造模，大鼠ip 1%戊巴比妥鈉（0.03 g/kg）麻醉，固定于手術(shù)操作臺(tái)，在大鼠背部正中兩側(cè)1～2 cm處行縱行切口，進(jìn)入腹腔在脂肪堆積處找到卵巢，結(jié)扎并摘除雙側(cè)卵巢，分層縫合收口；對(duì)照組不摘除卵巢，只切除卵巢周圍同等質(zhì)量的脂肪組織。術(shù)后大鼠im青霉素（1.6 mL/kg），1次/d，連續(xù)3 d，術(shù)后禁食不禁水1 d。戊酸雌二醇研碎后，用純凈水配制成質(zhì)量濃度為0.018 4 mg/mL的混懸液，術(shù)后1周各給藥組ig相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)12周。

2.3 標(biāo)本采集與處理

給藥結(jié)束后，大鼠ip 1%戊巴比妥鈉麻醉，采用負(fù)壓采血管于腹主動(dòng)脈采血，3000 r/min離心20 min，取上層血清，于?80 ℃保存?zhèn)溆?。分離肱骨及股骨，清除肌肉組織與結(jié)締組織。骨組織一部分采用4%多聚甲醛固定用于染色及骨密度檢測(cè)，一部分用紗布包裹于?80 ℃保存用于后續(xù)檢測(cè)。用于染色的骨組織在染色前，將骨組織從4%多聚甲醛中取出，于15倍量10% EDTA脫鈣液中脫鈣處理4周，每3天更換1次脫鈣液，至骨組織變軟（以使用針扎骨組織能夠順利刺入為驗(yàn)證），脫鈣后以蒸餾水清洗，于乙醇溶液中固定。

2.4 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠肱骨微結(jié)構(gòu)、骨密度及骨礦含量的影響

解凍肱骨樣本，將組織固定在Micro CT載物臺(tái)上，以360°掃描角度、分辨率為14.8 μm，掃描肱骨近端獲取連續(xù)平面圖像。掃描后，選取生長(zhǎng)板遠(yuǎn)端1.0 mm、層厚2.0 mm的骨組織為松質(zhì)骨感興趣區(qū)域進(jìn)行三維重組，提取圖像信息。獲取重組圖像后，使用Micro CT自帶分析軟件進(jìn)行定量分析，檢測(cè)骨密度和骨礦含量。

2.5 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨病理變化的影響

取左側(cè)股骨，以10%甲醛固定，再用20% EDTA脫鈣液進(jìn)行脫鈣，然后脫水60 min；用二甲苯I和II分別處理60 min，常規(guī)浸蠟、包埋后切片（厚4 μm），進(jìn)行蘇木素-伊紅（HE）染色，于顯微鏡下觀察股骨病理變化。

2.6 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠骨髓成骨細(xì)胞數(shù)量的影響

取出脫鈣處理的骨組織，進(jìn)行脫水、透明、浸蠟、石蠟包埋、切片和烤片處理，切片脫蠟，加入堿性磷酸酶染色工作液，室溫避光染色，去除工作液，以蒸餾水洗滌2次終止顯色反應(yīng)；無(wú)水乙醇脫水，二甲苯透明，于通風(fēng)柜中風(fēng)干，中性樹膠封片，于顯微鏡下觀察，各組每張切片隨機(jī)挑選6個(gè)視野進(jìn)行拍照，采用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)數(shù)每個(gè)視野下的骨髓成骨細(xì)胞并取平均值。

2.7 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平的影響

取制備好的血清樣本，按ELISA試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平。

2.8 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)的影響

取新鮮冰凍骨組織組織，按照試劑盒說(shuō)明書提取總RNA并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析。引物序列見(jiàn)表1。

2.9 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

股骨剪碎后，加入RIPA裂解液提取蛋白，蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉2 h，分別加入IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3抗體（1∶1000）和β-actin抗體（1∶500），4 ℃孵育過(guò)夜；TBST洗滌5次，5 min/次，加入HRP標(biāo)記的抗體（1∶50 000），室溫孵育2 h，TBST洗滌后，加入ECL發(fā)光液，X光膠片壓片后依次放入顯影液顯影、定影液定影，沖洗膠片，采用BandScan軟件分析膠片灰度值。

表1 引物序列

2.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠肱骨微結(jié)構(gòu)、骨密度及骨礦含量的影響

如圖1所示，與對(duì)照組相比，模型組大鼠肱骨皮質(zhì)骨變薄，骨小梁稀疏、減少；與模型組相比，各給藥組大鼠肱骨骨小梁增多，結(jié)構(gòu)較完整。如圖2所示，與對(duì)照組比較，模型組骨密度和骨礦含量顯著降低（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組骨密度和骨礦含量顯著增加（＜0.05、0.01）。

3.2 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨病理變化的影響

如圖3所示，對(duì)照組骨小梁結(jié)構(gòu)均勻，形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，骨髓腔相對(duì)較小；與對(duì)照組比較，模型組骨小梁數(shù)目減少、稀疏，骨小梁間隙增大，骨髓腔明顯增寬，脂肪空泡多；與模型組比較，各給藥組骨小梁數(shù)量稍增加，排列尚整齊，骨髓脂肪組織減少。

圖1 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠肱骨微結(jié)構(gòu)的影響

與對(duì)照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同

圖3 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨病理變化的影響 (HE，×100)

3.3 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠骨髓成骨細(xì)胞數(shù)量的影響

堿性磷酸酶染色后骨髓成骨細(xì)胞呈藍(lán)紫色。如圖4所示，與模型組比較，補(bǔ)腎化痰方中、高劑量組大鼠骨髓成骨細(xì)胞數(shù)顯著增多（＜0.05、0.01）。

3.4 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平的影響

如圖5所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠血清中IL-6和TNF-α水平顯著降低（＜0.01），戊酸雌二醇組以及補(bǔ)腎化痰方中、高劑量組大鼠血清中IL-17水平顯著降低（＜0.01）。

箭頭表示骨髓成骨細(xì)胞

3.5 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨組織、、和mRNA表達(dá)水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠股骨組織、、和mRNA表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01）。

圖5 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平的影響(, n = 10)

圖6 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2和STAT3 mRNA表達(dá)的影響(, n = 10)

3.6 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、JAK2、p-JAK2、STAT3和p-STAT3蛋白表達(dá)的影響

如圖7所示，與對(duì)照組比較，模型組大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高（＜0.01），p-JAK2/JAK2和p-STAT3/STAT3顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組大鼠股骨組織IL-6、IL-6R、p-JAK2和p-STAT3蛋白表達(dá)水平均顯著降低（＜0.01），戊酸雌二醇組以及補(bǔ)腎化痰方中、高劑量組p-JAK2/JAK2顯著降低（＜0.05、0.01），戊酸雌二醇組以及補(bǔ)腎化痰方高劑量組p-STAT3/STAT3顯著降低（＜0.05）。

圖7 補(bǔ)腎化痰方對(duì)去勢(shì)大鼠股骨組織IL-6/JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白表達(dá)的影響(, n = 10)

4 討論

PMOP主要是由于女性絕經(jīng)后卵巢功能衰退，雌激素水平降低，對(duì)破骨細(xì)胞的抑制作用減弱，破骨細(xì)胞的數(shù)量增加、凋亡減少而壽命延長(zhǎng)，導(dǎo)致其骨吸收功能增強(qiáng)。雖然成骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨形成亦有增加，但不足以代償過(guò)度骨吸收，這與本次關(guān)于成骨細(xì)胞數(shù)量研究相符合。骨重建活躍和失衡致使小梁骨變細(xì)或斷裂，皮質(zhì)骨孔隙度增加，導(dǎo)致骨強(qiáng)度下降。雌激素減少降低骨骼對(duì)力學(xué)刺激的敏感性，使骨骼呈現(xiàn)類似于廢用性骨丟失的病理變化[13]。中醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中無(wú)PMOP之名，按其主要臨床表現(xiàn)，對(duì)應(yīng)中醫(yī)相近的病癥，可以歸屬于以下幾類：對(duì)于臨床表現(xiàn)不明顯，或僅感覺(jué)腰背酸軟乏力的OP患者，如“腰背不舉，骨枯而髓減”，歸屬于骨痿；對(duì)于臨床有腰背疼痛沉重患者，如“腰背疼痛，全身骨痛，身重、四肢沉重難舉”，可歸屬于骨痹。根據(jù)中醫(yī)藥“腎主骨生髓”“脾主四肢肌肉”及“不通則痛”的理論，以補(bǔ)腎益精、健脾益氣、活血祛瘀為OP的主要治法。向楠教授在此基礎(chǔ)上，根據(jù)“腎虛水泛為痰”結(jié)合現(xiàn)代研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在OP狀態(tài)下成脂分化，提出了“補(bǔ)腎化痰”的新治法。

《本草綱目》中補(bǔ)骨脂丸記載：“補(bǔ)骨脂4兩（炒香），菟絲子4兩（酒蒸），胡桃肉1兩（去皮），乳香2錢半，沒(méi)藥2錢半，沉香2錢半；主治壯筋骨，益元?dú)狻薄！兜は姆ā分悬S瓜蔞丸記載：“栝蔞仁、半夏、山楂、神曲（炒，各等分），治食積，痰壅滯”。補(bǔ)腎化痰方是從補(bǔ)骨脂丸中選取補(bǔ)骨脂、菟絲子加淫羊藿，從黃瓜蔞丸選取瓜蔞，山楂，改神曲為紅曲，2方融合而成，方中淫羊藿與補(bǔ)骨脂合用，同為君藥，具益腎壯陽(yáng)、強(qiáng)筋健骨的功效；菟絲子滋補(bǔ)肝腎、固精縮尿，全瓜蔞清熱化痰，共為臣藥；山楂善于消食化積、行氣散瘀；紅曲長(zhǎng)于健脾消食、活血化瘀，2藥協(xié)同為佐藥，全方共奏補(bǔ)腎益髓、化痰調(diào)脂之功。淫羊藿苷是中藥淫羊藿的主要藥效成分，可有效預(yù)防骨質(zhì)疏松癥[14-15]。補(bǔ)骨脂素與異補(bǔ)骨脂素均為補(bǔ)骨脂中的主要有效成分，具有多種生物活性，對(duì)骨質(zhì)疏松癥有很好的治療作用[16-18]。菟絲子主要活性成分為黃酮類化合物，山柰酚和金絲桃苷為其提取物中發(fā)揮成骨作用的活性成分，可用于治療骨質(zhì)疏松癥[19-20]。山楂、瓜蔞、紅曲提取物可調(diào)脂抗炎[21-22]。紅曲能夠促進(jìn)大鼠骨形成，其提取物含輔酶Q10和洛伐他汀，能夠改善骨質(zhì)疏松癥[23-24]。

PMOP被認(rèn)為是炎性疾病，甚至是一種自身免疫狀態(tài)。絕經(jīng)后雌激素缺乏及T細(xì)胞免疫功能減退可引起血清IL-6、TNF-α等細(xì)胞因子水平上升[25]。IL-6和TNF-α可作用于破骨細(xì)胞，刺激骨吸收作用；同時(shí)還能增加骨膠原酶分泌，促進(jìn)骨基質(zhì)降解而影響成骨細(xì)胞活性，進(jìn)而影響骨形成作用，因此被稱為溶骨性細(xì)胞因子[26]。IL-6的受體由特異性的IL-6結(jié)合蛋白（IL-6受體）和糖蛋白130（gp130）2部分組成。gp130是一種激活蛋白，是許多IL-6家族細(xì)胞因子共同的受體?？扇苄訧L-6受體與IL-6結(jié)合后，激活含有g(shù)p130信號(hào)肽的細(xì)胞[27]。在骨髓中，IL-6首先與靶細(xì)胞膜上IL-6特異性受體結(jié)構(gòu)鏈即IL-6R結(jié)合形成復(fù)合物，再與IL-6受體信號(hào)傳導(dǎo)鏈即gp130相關(guān)聯(lián)后，促使其二聚化。胞內(nèi)JAK2通過(guò)FERM結(jié)構(gòu)域與IL-6特異性受體（IL-6R/gp130）相結(jié)合并被磷酸化激活，進(jìn)一步磷酸化STAT3，活化的STAT3形成二聚體并暴露其核定位信號(hào)，從而由胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到胞核，啟動(dòng)下游轉(zhuǎn)錄因子RORγt和RORα的表達(dá)來(lái)影響Th17細(xì)胞的分化[28]。骨髓中Th17細(xì)胞數(shù)量增加，并分泌高水平的IL-17、TNF-α。而骨微環(huán)境IL-17水平的提高，可直接誘導(dǎo)成骨細(xì)胞和骨髓基質(zhì)細(xì)胞表達(dá)核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體（receptor activator of nuclear factor-κB ligands，RANKL）、核轉(zhuǎn)錄因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）易位，從而促進(jìn)破骨細(xì)胞成熟和骨吸收。IL-17及TNF-α作為促炎因子，其釋放又會(huì)進(jìn)一步加重機(jī)體炎性反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，用IL-6/sIL-6R處理成骨細(xì)胞可以誘導(dǎo)RANKL產(chǎn)生，從而刺激破骨細(xì)胞形成和骨吸收，而STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)了這一生物學(xué)過(guò)程[29]?？梢?jiàn)在骨髓中，炎性因子通過(guò)IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路介導(dǎo)Th17細(xì)胞活化，引發(fā)炎性級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致破骨細(xì)胞活性增強(qiáng)，骨吸收增加，導(dǎo)致PMOP的發(fā)生與發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)，模型組骨小梁稀疏，結(jié)構(gòu)破壞，骨髓脂肪細(xì)胞增多，骨密度降低；補(bǔ)腎化痰方能夠顯著提高模型大鼠骨密度，改善骨小梁形態(tài)，降低脂肪細(xì)胞數(shù)，增加成骨細(xì)胞數(shù)。研究發(fā)現(xiàn)[30-32]，痰濁證患者炎性因子IL-6、TNF-α水平升高，給予中藥化痰濁后IL-6、TNF-α水平顯著降低，表明炎性反應(yīng)與痰濁關(guān)系密切。而采用補(bǔ)腎法治療腎虛夾痰證患者，發(fā)現(xiàn)相關(guān)炎性因子水平降低，表明腎虛與痰濁存在聯(lián)系[33]。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠血清中IL-6、TNF-α和IL-17水平顯著升高，表明去勢(shì)大鼠血清中出現(xiàn)炎性反應(yīng)；進(jìn)一步在骨組織發(fā)現(xiàn)、mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明骨組織同樣有炎性反應(yīng)。骨組織中JAK2、STAT3 mRNA及p-JAK2、p-STAT3蛋白表達(dá)水平顯著升高，表明IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路被激活；補(bǔ)腎化痰方干預(yù)后血清炎性因子水平降低，骨組織IL-6/JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，大鼠骨丟失改善，表明其作用機(jī)制可能與抑制IL-6/JAK2/STAT3信號(hào)通路有關(guān)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)腎化痰方能夠降低骨髓中Th17數(shù)量[10]，其與IL-6水平的降低及IL-6/JAK2/ STAT3信號(hào)通路的關(guān)系仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Bushen Huatan Recipe on improving bone loss of ovariectomized rats based on IL-6/JAK2/STAT3 pathway

TAN Zhang-kui1, XIANG Nan2, ZHANG Yan1, XIONG Meng-xin1, XUE Yao-jun1, HUANG Shi-yi1, ZHOU Guang-wen3

1. Clinical College of Traditional Chinese Medicine, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 2. The First Clinical College, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430065, China 3. College of Acupuncture and Orthopedics, Hubei University of Traditional Chinese Medicine, Wuhan 430065, China

To explore the effect of Bushen Huatan Recipe (補(bǔ)腎化痰方) on bone loss and IL-6/Janus kinase 2 (JAK2)/signal transducers and activators of transcription 3 (STAT3) pathway in ovariectomized rats.SD female rats were randomly divided into control group, model group, estradiol valerate (0.184 mg/kg) group, low-, medium- and high-dose (4.7, 9.4, 18.8 g/kg) Bushen Huatan Recipe groups. Except for control group, the ovaries of all other groups were surgically removed to make a postmenopausal osteoporosis model. One week after operation, estradiol valerate and Bushen Huatan Recipe were given for intervention, and samples were obtained 12 weeks after administration. Micro CT was used to detect humerus bone mineral density and bone mineral content of rats in each group; Hematoxylin-eosin (HE) staining method was used to observe the pathological changes of femur of rats in each group; Alkaline phosphatase staining method was used to examine the number of osteoblasts in rats of each group; ELISA method was used to detect the levels of interleukin-6 (IL-6), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and IL-17 in serum of rats in each group; qRT-PCR method was used to detect,,andmRNA expressions in femur of rats in each group; Western blotting method was used to detect IL-6, IL-6R, JAK2, p-JAK2, STAT3 and p-STAT3 protein expressions in femur of rats in each group.Compared with control group, the bone mineral density and bone mineral content of humerus in model group were significantly reduced (< 0.01); Bone trabecula was reduced and sparse, and fat cells were increased; Levels of IL-6, TNF-α and IL-17 in serum were significantly increased (< 0.01);,,andmRNA expressions of femur were significantly increased (< 0.01); IL-6, IL-6R, p-JAK2 and p-STAT3 protein expressions were significantly increased (< 0.01). Compared with model group, the bone mineral density and bone mineral content of rats in each treatment group were significantly increased (< 0.05, 0.01); Bone trabecula were increased, structure was more complete, and fat cells were decreased; Number of bone marrow osteoblasts in rats of medium- and high-dose Bushen Huatan Recipe groups were significantly increased (< 0.05, 0.01); Levels of IL-6 and TNF-α in serum of rats in each administration group were significantly reduced (< 0.01), IL-17 level in serum of rats in estradiol valerate group and medium-, high-dose Bushen Huatan Recipe groups were significantly reduced (< 0.01);,,andmRNA expressions of femur were significantly reduced (< 0.01), IL-6, IL-6R, p-JAK2 and p-STAT3 protein expressions were significantly reduced (< 0.01).Bushen Huatan Recipe can improve bone loss in ovariectomized rats, and its mechanism may be related to the inhibition of IL-6/JAK2/STAT3 pathway.

Bushen Huatan recipe; bone loss; postmenopausal osteoporosis; ovariectomized rats; IL-6/JAK2/STAT3 pathway

R285.5

A

0253 - 2670(2021)16 - 4904 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.015

2021-03-31

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（82074416）；國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81904267）；湖北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（2019CFB232）；武漢市衛(wèi)生健康委員會(huì)武漢市醫(yī)學(xué)科研項(xiàng)目（WZ19Q03，WZ20C28）；湖北中醫(yī)名師向楠工作室建設(shè)項(xiàng)目（鄂衛(wèi)生計(jì)生通報(bào)[2018]15號(hào)）

譚張奎（1990—），男，博士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治內(nèi)分泌疾病。Tel: 13545072800 E-mail: tzhongkui@163.com

周廣文（1987—），女，講師，主治醫(yī)師，博士，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治骨代謝相關(guān)疾病及退行性骨病的研究。Tel: 15827547190 E-mail: 609053257@qq.com

[責(zé)任編輯 李亞楠]