基于miR-34調(diào)控KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸探討活血榮絡(luò)方促腦梗死后血管新生的機制

楊仁義，顏思陽，周德生，傅馨瑩，馬 強，張宇星，高曉峰，劉利娟*

? 藥理與臨床 ?

基于miR-34調(diào)控KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸探討活血榮絡(luò)方促腦梗死后血管新生的機制

楊仁義1，顏思陽1，周德生2，傅馨瑩1，馬 強1，張宇星1，高曉峰2，劉利娟2*

1. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208 2. 湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，湖南 長沙 410007

基于miR-34家族基因與Kruppel樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）/血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）傳導(dǎo)軸的相關(guān)性探討活血榮絡(luò)方促腦梗死后血管新生的機制。將SD大鼠隨機分為對照組、模型組、活血榮絡(luò)方（11.7 g/kg）組和丁苯酞（60 mg/kg）組，每組10只，建立大腦中動脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型，連續(xù)ig藥物7 d。采用改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）評價大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀；采用免疫熒光染色觀察海馬區(qū)CD34及皮質(zhì)區(qū)VEGF表達；采用Western blotting法檢測各組大鼠梗死側(cè)腦組織中KLF4和VEGF蛋白表達情況；采用qRT-PCR法檢測各組大鼠腦組織中miR-34家族基因的表達；采用Pearson相關(guān)分析探討miR-34家族基因與mNSS、KLF4、VEGF的相關(guān)性。活血榮絡(luò)方能夠顯著改善大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀（＜0.01），增加海馬區(qū)CD34陽性細胞及皮質(zhì)區(qū)VEGF表達（＜0.01），增強腦組織中KLF4和VEGF蛋白表達（＜0.01），抑制miR-34家族基因、、mRNA表達（＜0.01）；且mNSS與、、呈高度正相關(guān)（＜0.05）；VEGF與、、呈高度負相關(guān)（＜0.05）；KLF4與呈高度負相關(guān)（＜0.05），與呈高度負相關(guān)（＜0.01）?；钛獦s絡(luò)方能夠抑制、、mRNA表達，激活KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸，促進腦梗死后血管新生，進而改善神經(jīng)功能缺損癥狀。

活血榮絡(luò)方；腦梗死；血管新生；KLF4；VEGF；miR-34

腦梗死又稱缺血性腦卒中，是由于腦循環(huán)灌注障礙，缺血、缺氧所致局限腦組織缺血性壞死，出現(xiàn)相應(yīng)神經(jīng)功能缺損癥狀的臨床最常見腦血管病類型，約占全部急性腦血管病的70%[1]，是當前我國居民死亡的首要原因[2]。血管新生屬于三級腦側(cè)支循環(huán)范疇，在腦動脈閉塞后，血管內(nèi)皮細胞（endothelial cells，ECs）增殖、遷移、分化，在原有微動/靜脈基礎(chǔ)上以芽生式形成新的血管，能夠代償性地為腦組織提供血流灌注[3]，促進病情恢復(fù)，是腦梗死藥物治療的關(guān)鍵切入點[4]。因此，積極尋求腦梗死后促血管新生的藥物具有重要的意義。

腦梗死屬中醫(yī)“缺血性腦卒中”范疇，在腦藏象理論指導(dǎo)下，本課題組首次提出缺血中風之“榮氣虛滯”病機理論體系[5]，認為榮氣是一切精微物質(zhì)的總稱[6]，榮氣氣化的“精化氣-氣生變-變成形”過程與ECs增殖、遷移、分化相應(yīng)，因此，在活血榮絡(luò)法指導(dǎo)下組方的活血榮絡(luò)方可能具有促腦梗死后血管新生的作用[7]?；跇s氣理論創(chuàng)制的活血榮絡(luò)方是湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑，納入臨床路徑已13年，前期臨床與實驗研究發(fā)現(xiàn)活血榮絡(luò)方能夠上調(diào)微囊蛋白-1（caveolin-1，CAV-1）表達，下調(diào)基質(zhì)金屬肽酶-9（matrix metallopeptidase-9，MMP-9）表達，激活Janus激酶2（Janus kinase 2，JAK2）/信號傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）通路，減輕腦梗死急性期炎性反應(yīng)，增加腦缺血區(qū)微血管密度（microvessel density，MVD），促進血管新生，改善腦梗死后神經(jīng)功能缺損[8-13]，但活血榮絡(luò)方促腦梗死后血管新生的作用機制仍有待進一步研究。Kruppel樣因子4（Kruppel-like factor 4，KLF4）是鋅指轉(zhuǎn)錄因子家族蛋白之一，是雙向調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子，能夠易位過表達，正向介導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，）mRNA和蛋白的表達，可以形成KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸促進血管新生，且Targetscan數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)KLF4是miR-34家族基因的下游靶基因，因此本研究以miR-34家族基因與KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸之間的相關(guān)性為切入點，探討活血榮絡(luò)方促腦梗死后血管新生的作用機制。

1 材料

1.1 動物

SPF級雄性SD大鼠40只，10～12周齡，體質(zhì)量250～280 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院實驗動物中心，晝夜交替12 h，溫度21～26 ℃，濕度40%～50%。動物實驗經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準（批準號20201010-8）。

1.2 藥材

活血榮絡(luò)方（湘藥制字Z20080472）由雞血藤30 g、石楠藤30 g、生地黃15 g、玄參10 g、黃精15 g、乳香10 g、沒藥10 g、川芎10 g組成，以上藥材均購自湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院張裕民主任藥師鑒定分別為豆科植物密花豆Dunn的干燥藤莖、胡椒科植物石楠藤(Miq.) Hand. -Mazz.的干燥帶葉莖枝、玄參科植物地黃Libosch.的干燥塊根、玄參科植物玄參Hemsl.的干燥根、百合科植物黃精Red.的干燥根莖、橄欖科乳香樹屬植物乳香樹Birdw.樹皮滲出的樹脂、橄欖科植物地丁樹Engl.的干燥樹脂、傘形科植物川芎Hort.的干燥根莖，均符合《中國藥典》2015年版規(guī)定。

1.3 藥品與試劑

丁苯酞軟膠囊（批號H20050299，0.1 g/粒）購自中國石藥集團恩必普藥業(yè)有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）抗原修復(fù)液（pH 8.0，批號G1206）、自發(fā)熒光淬滅劑（批號G1221-2）、488山羊抗兔熒光抗體（批號GB25303）、CY3山羊抗小鼠熒光抗體（批號GB21301）、CY3熒光TSA抗體（批號G1223）、DAPI染液（批號G1012）、RNA提取試劑盒（批號G3013）、RT First Strand cDNA Synthesis Kit（批號G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（批號G3322）購自武漢賽維爾生物科技有限公司；VEGF熒光抗體（批號19003-1-ap）購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；CD34熒光抗體（批號ab81289）、KLF4抗體（批號ab106629）、VEGF抗體（批號ab46154）、HRP標記的山羊抗兔IgG抗體（批號ab150120）購自英國Abcam公司；BCA蛋白定量試劑盒（批號70-PQ0012）購自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒（批號CW0022S）購自康為世紀生物科技有限公司；Immobilon Western HRP底物（批號WBKLS0100）購自美國Millipore公司；PageRulerTMPrestained Protein Ladder（批號26616）購自美國Thermo Fisher Scientific公司；β-actin抗體（批號20536-1-AP）購自美國Proteintech公司；HyPureTMMolecular Biology Grade Water（批號SH30538.02）購自美國HyClone公司。

1.4 儀器

HM325型石蠟切片機、NanoDrop2000超微量分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）；ECLIPSE C1型正置熒光顯微鏡、DS-U3型顯微成像系統(tǒng)（日本Nikon公司）；Mini-Protean Tetra小型垂直電泳槽、Mini Trans-Blot型轉(zhuǎn)印槽、PowerPac Basic基礎(chǔ)電泳儀、Gel Doc XR＋凝膠成像系統(tǒng)、qRT-PCR儀（美國Bio-Rad公司）；0.22 μm PVDF膜（美國Millipore公司）；D3024R型臺式高速冷凍型微量離心機（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；SW-CJ-1FD型超凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；FBZ2001-up-p標準試劑型純水儀（青島富勒姆科技有限公司）；Enspire多功能酶標儀（美國Perkinelmer公司）。

2 方法

2.1 活血榮絡(luò)方的制備

將乳香、沒藥粉碎，其余藥材混合，加入10倍量水浸泡12 h后煎煮2 h；加入8倍量水煎煮1 h；加入5倍量水煎煮1 h；合并3次提取液，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上濃縮，冷卻后得到活血榮絡(luò)方浸膏，于4 ℃保存?zhèn)溆谩２捎酶咝б合嗌V法對活血榮絡(luò)方進行質(zhì)量控制，其主要有效成分芒柄花素、薯蕷皂苷、正丁烯基苯酚、黃芩苷的質(zhì)量分數(shù)分別為4.298、3.568、1.779、18.634 mg/g。

2.2 大鼠腦缺血再灌注模型的制備

SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d，術(shù)前12 h禁食不禁水，ip 10%水合氯醛（0.35 g/kg）麻醉，參考Longa等[15]報道的大腦中動脈阻塞法，梗阻大鼠右側(cè)大腦中動脈。鈍性分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，從頸外動脈和頸內(nèi)動脈分叉部（4±2）mm處剪口進拴線，插入拴線（18±2）mm，將頸內(nèi)動脈掛線系牢；缺血2 h后，拔出拴線進行再灌注，以制備大腦中動脈閉塞/再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MCAO/R）模型。

2.3 分組與給藥

采用SPSS 23.0軟件設(shè)置隨機數(shù)的方法，將40只SD大鼠隨機分為對照組10只和造模組30只，造模組按“2.2”項下方法造模；對照組分離右側(cè)頸總動脈、頸外動脈和頸內(nèi)動脈，不插入拴線，其余過程與模型制備方法相同。參考Zea-Longa’s標準評分法[15]，取造模后評分為1～3分的大鼠30只，隨機分為模型組、活血榮絡(luò)方（11.7 g/kg）[9-12]組和丁苯酞（60 mg/kg）[14]組，每組10只?；钛獦s絡(luò)方浸膏以蒸餾水稀釋成質(zhì)量濃度為1.1 g/mL（以生藥量計）的藥液；丁苯酞軟膠囊用麻油配制成質(zhì)量濃度為6 mg/mL的混懸液。術(shù)后6 h，各給藥組ig相應(yīng)藥物（10 mL/kg），對照組和模型組ig等體積0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)7 d。實驗過程中出現(xiàn)死亡、取材時發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血或腦出血的大鼠予以剔除。

2.4 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠改良神經(jīng)功能缺損評分（modified neurological severity score，mNSS）的影響

分別于給藥后第1、3、7天，采用mNSS[16]評價各組大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，包括運動、感覺、平衡木、反射消失或動作異常等共18分，評分越高，損傷程度越嚴重。

2.5 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織海馬區(qū)CD34和皮質(zhì)區(qū)VEGF表達的影響

各組隨機取5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，依次將切片放入二甲苯15 min，無水乙醇5 min，85%乙醇5 min，75%乙醇5 min，蒸餾水洗滌。石蠟切片脫蠟至水后，以EDTA抗原修復(fù)緩沖液（pH 8.0）進行抗原修復(fù)，于PBS脫色，加入牛血清白蛋白孵育30 min，分別加入VEGF抗體（1∶3000）和CD34抗體（1∶100），4 ℃孵育過夜；PBS洗滌后加入二抗，室溫避光孵育50 min，洗滌后加入DAPI染液，室溫避光孵育10 min，洗滌后用抗熒光淬滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并拍照，采用Image J 1.8.0軟件，隨機取海馬區(qū)5個視野，分別對5個視野中CD34陽性細胞計數(shù)，取5個視野的均數(shù)，參考Weidner法[17]計算MVD值；采用Image J 1.8.0軟件分析VEGF陽性表達的平均熒光強度。

2.6 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織KLF4和VEGF蛋白表達的影響

各組剩余的5只大鼠，麻醉后斷頭取腦，取梗死側(cè)腦組織皮質(zhì)區(qū)，加入裂解液勻漿，采用BCA蛋白定量試劑盒測定蛋白質(zhì)量濃度。蛋白樣品經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF膜，加入5%脫脂牛奶，室溫封閉1.5 h，分別加入KLF4、VEGF抗體（1∶1000），4 ℃孵育過夜；TBST洗滌3次，10 min/次，加入山羊抗兔抗體（1∶10 000），室溫孵育60 min，洗滌后顯色成像，采用Image J 1.8.0分析條帶灰度值。

2.7 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織miR-34a、miR-34b和miR-34c mRNA表達的影響

按照試劑盒說明書提取各組大鼠腦組織皮質(zhì)區(qū)總RNA并合成cDNA，進行qRT-PCR分析。引物序列見表1，以為內(nèi)參。

表1 引物序列

2.8 大鼠腦組織miR-34家族基因與mNSS、KLF4和VEGF的相關(guān)性

根據(jù)模型組、活血榮絡(luò)方組、丁苯酞組大鼠7 d的mNSS、腦組織中KLF4、VEGF相對蛋白表達量與腦組織中miR-34家族基因表達量，采用SPSS 23.0軟件進行相關(guān)性分析，并通過R語言3.6.3分別繪制、、與mNSS、KLF4、VEGF之間的相關(guān)性分析圖。當＜0.05時，則兩變量存在相關(guān)性；＞0時為正相關(guān)，＜0為負相關(guān)；0≤??＜0.3為低度相關(guān)，0.3≤??＜0.5為中度相關(guān)，0.5≤??＜1為高度相關(guān)；??越大，相關(guān)關(guān)系越大。

2.9 統(tǒng)計學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠mNSS的影響

如圖1所示，與對照組比較，模型組大鼠mNSS顯著升高（＜0.01），神經(jīng)功能缺損嚴重；與模型組比較，活血榮絡(luò)方組3 d mNSS顯著降低（＜0.05），各給藥組7 d mNSS顯著降低（＜0.01），神經(jīng)功能明顯改善。

3.2 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織海馬區(qū)CD34和皮質(zhì)區(qū)VEGF表達的影響

如圖2所示，與對照組比較，模型組大鼠海馬區(qū)MVD數(shù)量和皮質(zhì)區(qū)VEGF表達顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組海馬區(qū)MVD數(shù)量和皮質(zhì)區(qū)VEGF陽性表達均顯著升高（＜0.01）。

與對照組比較：**P＜0.01；與模型組比較：#P＜0.05 ##P＜0.01，下同

3.3 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織KLF4和VEGF蛋白表達的影響

如圖3所示，與對照組比較，模型組腦組織中KLF4和VEGF蛋白表達水平顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組KLF4和VEGF蛋白表達水平均進一步升高（＜0.01）。

3.4 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織miR-34a、miR-34b和miR-34c mRNA表達的影響

如圖4所示，與對照組比較，模型組腦組織、、mRNA表達水平均顯著升高（＜0.01）；與模型組比較，各給藥組腦組織、、mRNA表達水平均顯著降低（＜0.01）。

3.5 大鼠腦組織中miR-34家族基因與mNSS、KLF4和VEGF的相關(guān)性

如圖5所示，mNSS與、、呈高度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)（）分別為0.60、0.56、0.56（＜0.05）；VEGF與、、呈高度負相關(guān)，分別為?0.58、?0.58、?0.69（＜0.05）；KLF4與呈高度負相關(guān)，為?0.64（＜0.05），與呈高度負相關(guān)，為?0.88（＜0.01）。

圖2 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織海馬區(qū)CD34和皮質(zhì)區(qū)VEGF表達的影響 (×400)

Fig. 2 Effect of Huoxue Rongluo Recipe on expressions of CD34 in hippocampus and VEGF in cortex of MCAO/R rats (× 400)

4 討論

腦梗死疾病發(fā)生后，局部低氧致血管新生誘導(dǎo)因子在腦組織中高表達，推進由誘導(dǎo)因子與抑制因子組成的血管新生平衡向促進修復(fù)的方向移動，啟動內(nèi)源性血管新生，形成大量微血管，為缺血缺氧腦組織提供灌注與營養(yǎng)。VEGF作為血管新生誘導(dǎo)因子，腦梗死后低氧環(huán)境能誘導(dǎo)其應(yīng)激性表達增高，進而促進ECs增殖、遷移、分化成管，調(diào)控血管通透性，改善腦微循環(huán)，是腦梗死后血管新生的標志蛋白之一[18]。KLF4/VEGF軸可介導(dǎo)下游磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）通路[19]、磷脂酶C-γ1（phospholipase C γ-1，PLCγ-1）-蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）通路[20]、絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路[21]，促進ECs增殖、遷移、分化成管，調(diào)控Rho家族蛋白促進血管偽足形成[22]，在多種疾病血管新生中發(fā)揮重要作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，KLF4在腦梗死疾病中過表達[24]，能夠通過轉(zhuǎn)錄激活肺腺癌轉(zhuǎn)移相關(guān)轉(zhuǎn)錄物1（metastasis associated lung adenocarcinoma transcript 1，MALAT1）抑制腦梗死后血管內(nèi)皮細胞凋亡[25]，也能夠通過改善血管內(nèi)皮炎性反應(yīng)并調(diào)節(jié)緊密蛋白表達[26]，從而減輕腦血管損傷，促進腦梗死后神經(jīng)功能恢復(fù)。因此，腦梗死后血管新生的作用機制可能與低氧誘導(dǎo)激活KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸并介導(dǎo)下游通路、改善腦血管損傷、促進神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)。

圖3 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織KLF4和VEGF蛋白表達的影響

圖4 活血榮絡(luò)方對MCAO/R大鼠腦組織miR-34a、miR-34b和miR-34cmRNA表達的影響

圖5 大鼠腦組織中miR-34家族基因與mNSS、KLF4和VEGF的相關(guān)性

miRNA是一類廣泛長度約為22個堿基的非編碼RNA，能夠特異性識別下游目的基因mRNA 3’UTR，并形成不完全互補配對，裂解下游目的基因mRNA，進而阻斷下游目的基因表達，參與調(diào)控ECs的增殖、遷移、分化成管的過程[27]。miR-34家族基因由、、組成，能夠靶向負調(diào)控血管新生，為抗血管新生藥物的開發(fā)提供了前景[28]。何灝龍等[29]通過微陣列技術(shù)發(fā)現(xiàn)miR-34家族基因在腦梗死大鼠模型中差異表達，歸屬于MAPK、JAK2/STAT3等信號通路，參與腦梗死疾病后的神經(jīng)功能恢復(fù)過程。同時本課題組前期通過Targetscan數(shù)據(jù)庫[30]（http://www.targetscan.org/ vert_72/）發(fā)現(xiàn)，KLF4的轉(zhuǎn)錄后翻譯過程主要受miR-34家族基因調(diào)控，其中的預(yù)測分數(shù)為97分，權(quán)重分數(shù)為?0.48；的預(yù)測分數(shù)為97分，權(quán)重分數(shù)為?0.49；的預(yù)測分數(shù)為97分，權(quán)重分數(shù)為?0.49。基于此，可初步認為腦梗死疾病發(fā)生后，miR-34家族基因可能靶向調(diào)控KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸，參與腦梗死后血管新生進程。

《中國急性缺血性腦卒中診治指南（2018）》[31]指出，腦梗死早期不能溶栓者，早期建議使用丁苯酞、人尿激肽原酶等藥物，以改善腦循環(huán)（II級推薦，B級證據(jù)）。丁苯酞是國內(nèi)開發(fā)的I類新藥，能夠有效改善腦梗死患者腦缺血區(qū)微循環(huán)及側(cè)支循環(huán)，促進腦梗死后血管新生，增加腦缺血區(qū)的腦血流灌注，改善神經(jīng)功能缺損[32]。但是臨床上改善腦梗死患者側(cè)支循環(huán)藥物相對較少，臨床療效有待進一步提升，因此以腦梗死后3級側(cè)支循環(huán)血管新生為切入點，在中醫(yī)榮氣氣化理論指導(dǎo)下，研究活血榮絡(luò)方促腦梗死后血管新生的分子機制，應(yīng)用于臨床轉(zhuǎn)化，具有重要的意義。

本研究表明，活血榮絡(luò)方與丁苯酞均能夠改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，且隨著給藥時間延長，效果越明顯。CD34、VEGF被認為是血管生成的間接標志物[33]，CD34是ECs首選標志物，是ECs損傷后修復(fù)的重要物質(zhì)之一，VEGF與缺血區(qū)周圍新生血管數(shù)量密切相關(guān)，血管新生發(fā)生時CD34與VEGF正相關(guān)。楊洋等[34]采用CD34標記海馬區(qū)新生血管，證實腦梗死大鼠模型中細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2，ERK1/2）通路的激活能夠啟動內(nèi)源性血管新生；Chan等[35]采用VEGF標記皮質(zhì)區(qū)新生血管，證實硫酸乙酰肝素能夠促進腦梗死后血管新生，進而改善神經(jīng)功能。免疫熒光結(jié)果顯示，腦梗死大鼠海馬區(qū)CD34陽性細胞數(shù)目與皮質(zhì)區(qū)VEGF平均熒光強度較對照組明顯升高，且藥物干預(yù)作用下，二者表達水平進一步升高，提示腦梗死疾病發(fā)生后，機體可啟動內(nèi)源性血管新生，且活血榮絡(luò)方與丁苯酞能夠進一步促進腦梗死后血管新生。Western blotting結(jié)果顯示，腦梗死大鼠腦組織中KLF4和VEGF蛋白表達較對照組升高，且藥物干預(yù)作用下，二者表達水平進一步升高，提示腦梗死后血管新生的作用機制與激活KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸有關(guān)。qRT-PCR結(jié)果顯示，腦梗死大鼠腦組織中、、mRNA表達水平均顯著升高，且藥物能降低其表達水平，結(jié)合Pearson相關(guān)性分析結(jié)果，提示活血榮絡(luò)方與丁苯酞改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀與miR-34家族基因調(diào)控KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸相關(guān)。Jauhari等[36]研究發(fā)現(xiàn)miR-34家族基因在分化和衰老的腦細胞中高表達；Pandey等[37]研究發(fā)現(xiàn)miR-200與miR-34家族基因能夠靶向KLF4，在神經(jīng)元的增殖分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用；Li等[38]研究發(fā)現(xiàn)缺血缺氧環(huán)境下，抑制表達，能夠激活KLF4/VEGF軸，促進人臍靜脈內(nèi)皮細胞HUVEC增殖、遷移、分化成管；Peng等[39]研究發(fā)現(xiàn)異氟醚能夠激活轉(zhuǎn)化生長因子-β2（transforming growth factor-β2，TGF-β2）/SMAD3通路，增加VEGF與CD34表達，促進腦梗死后血管新生，改善腦梗死大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀，在一定程度上與本研究結(jié)果相互佐證。

綜上所述，活血榮絡(luò)方能夠促進腦梗死后血管新生，改善神經(jīng)功能缺損癥狀，可能與抑制、、mRNA表達，進而激活KLF4/VEGF傳導(dǎo)軸有關(guān)，本研究為中藥改善腦循環(huán)、防治腦梗死疾病提供了依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Mechanism of Huoxue Rongluo Recipe on promoting angiogenesis after cerebral infarction based on miR-34 regulating KLF4/VEGF conduction axis

YANG Ren-yi1, YAN Si-yang1, ZHOU De-sheng2, FU xin-ying1, MA Qiang1, ZHANG Yu-xing1, GAO Xiao-feng2, LIU Li-juan2

1. Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410208, China 2. The First Hospital of Hunan University of Chinese Medicine, Changsha 410007, China

Based on the correlation between miR-34 family genes and Kruppel-like factor 4 (KLF4)/vascular endothelial growth factor (VEGF) conduction axis to investigate the mechanism of Huoxue Rongluo Recipe (活血榮絡(luò)方) on promoting angiogenesis after cerebral infarction.SD rats were randomly divided into control group, model group, Huoxue Rongluo Recipe (11.7 g/kg) group and butylphthalide (60 mg/kg) group, 10 rats in each group. Middle cerebral artery occlusion/reperfusion (MCAO/R) rats model were established, and rats were ig drugs for 7 d. Modified neurological severity score (mNSS) was used to evaluate the symptoms of neurological deficit in rats; Immunofluorescence staining was used to observe the expression of CD34 in hippocampus and VEGF in cortex; Western blotting was used to detect the expression of KLF4 and VEGF in infarcted brain tissue; qRT-PCR was used to detect the expression of miR-34 family genes in brain tissue; Pearson correlation analysis was used to observe the correlation between miR-34 family genes and mNSS, KLF4 and VEGF.Huoxue Rongluo Recipe significantly improved the symptoms of neurological deficits in rats (< 0.01), increased expression of CD34 positive cells in hippocampus and expression of VEGF in cortex (< 0.01), enhanced expression of KLF4 and VEGF protein in brain tissue (< 0.01), inhibited mRNA expressions of,and(< 0.01); mNSS was highly positively correlated with,and(< 0.05); VEGF was highly negatively correlated with,and(< 0.05); KLF4 was highly negatively correlated with(< 0.05), highly negatively correlated with(< 0.01).Huoxue Rongluo Recipe can inhibit expressions of,and, activate KLF4/VEGF conduction axis, promote angiogenesis after cerebral infarction, and then improve the symptoms of neurological deficits.

Huoxue Rongluo Recipe; cerebral infarction; angiogenesis; KLF4; VEGF; miR-34

R285.5

A

0253 - 2670(2021)16 - 4873 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.012

2021-02-04

國家自然科學(xué)基金資助項目（81874463）；湖南省科技廳科技創(chuàng)新平臺與人才計劃項目（2017SK4005）；湖南省重點研發(fā)計劃項目（2020SK2092）；湖南省財政中醫(yī)藥項目名院工程（rsk-010-013/006-09）；湖南省教育廳一般項目（20C1405）；湖南省衛(wèi)健委科研項目（202103071190）；湖南省中醫(yī)藥管理局資助項目（202038，202046，2021218）；湖南省研究生創(chuàng)新項目（CX20190587）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合一流學(xué)科開放基金項目（2019ZXYJH08，2018ZXYJH10）；湖南中醫(yī)藥大學(xué)研究生培養(yǎng)質(zhì)量工程專項（2020CX62）

楊仁義（1996—），男，碩士研究生，從事神經(jīng)系統(tǒng)疾病的中醫(yī)藥防治研究。Tel: 15700726938 E-mail: 792799735@qq.com

劉利娟（1985—），女，博士，主治醫(yī)師，從事中醫(yī)藥對腦血管病及其并發(fā)癥的防治研究。Tel: (0731)85369768 E-mail: 601264967@qq.com

[責任編輯 李亞楠]