滇黃精中多糖的分離與抗氧化活性研究

王 婧，陶愛恩，楊 燕，楊建波，晏仁義, 4，段寶忠

滇黃精中多糖的分離與抗氧化活性研究

王 婧1，陶愛恩1*，楊 燕2，楊建波3，晏仁義1, 4，段寶忠1*

1. 大理大學(xué)藥學(xué)院，云南 大理 671000 2. 云南省科學(xué)技術(shù)院，云南 昆明 650051 3. 中國食品藥品檢定研究院，北京 100050 4. 天津益倍生物科技集團(tuán)有限公司，天津 300132

分離純化滇黃精中的均一多糖，并闡釋其理化性質(zhì)和抗氧化活性。方法 通過水提醇沉、分級醇沉得滇黃精總多糖（PKS）的50%和70%醇沉部位，再經(jīng)DEAE-瓊脂糖凝膠FF離子交換柱和Sephadex G-100柱色譜法分離純化得到均一多糖，并利用柱前衍生化HPLC、高效凝膠滲透色譜法和紅外光譜法分別對其單糖組成、相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究；同時(shí)采用總還原力實(shí)驗(yàn)、1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和羥基自由基（·OH）清除法對其抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)。從50%和70%醇沉部位分離純化得到3個(gè)均一多糖（PKS-1、PKS-2和PKS-3），其單糖組成均含有-甘露糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸、-半乳糖、-阿拉伯糖和-巖藻糖，其中PKS-1及PKS-3還分別含有-核糖和-鼠李糖；相對分子質(zhì)量分別為85 017.83、266 084.76和474 799.22；PKS、PKS-1和PKS-2的總還原能力、·OH及DPPH自由基的清除能力為PKS＞PKS-2＞PKS-1。從滇黃精50%和70%醇沉部位分離到3個(gè)均一多糖，均為含有β構(gòu)型的吡喃環(huán)酸性多糖，其單糖組成相似，PKS、PKS-1和PKS-2均有一定的抗氧化活性，為滇黃精抗氧化活性成分的研究及抗衰老藥物和功能性食品的開發(fā)利用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

滇黃精；-甘露糖；-半乳糖醛酸；-葡萄糖醛酸；-半乳糖；-阿拉伯糖；-巖藻糖；理化性質(zhì)；抗氧化

滇黃精Coll. et Hemsl.為藥食同源大宗藥材，是中國藥典收載的黃精基原植物之一[1]，習(xí)稱大黃精，歷代養(yǎng)生學(xué)家以及道家視之為補(bǔ)養(yǎng)強(qiáng)壯食品，具有極高的藥用和食用價(jià)值[2]。已有研究表明滇黃精主要含有多糖、皂苷、黃酮類等化學(xué)成分，其中以多糖所占比例最高[3-5]，是其主要活性成分之一[3,6]?，F(xiàn)代研究表明，多種植物多糖均可通過抗脂質(zhì)過氧化和清除自由基，調(diào)節(jié)端粒酶活性和機(jī)體的糖、脂質(zhì)代謝，以及神經(jīng)-內(nèi)分泌功能等多種途徑來發(fā)揮抗衰老作用[7]。由于衰老是機(jī)體各器官、組織功能隨年齡增長而發(fā)生退行性變化的過程[8]，過量的自由基如1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基、超氧陰離子及羥基自由基（·OH）是引起機(jī)體衰老的主要因素[9-10]。目前，從天然產(chǎn)物中尋找高效、低毒的清除體內(nèi)自由基的抗氧化劑已成為現(xiàn)代醫(yī)藥、保健行業(yè)研究的熱點(diǎn)[11-12]。鑒于植物多糖是一類高效、低毒的天然抗氧化劑[13-14]，且滇黃精資源豐富，在營養(yǎng)保健、養(yǎng)生、老年疾病預(yù)防等領(lǐng)域廣泛應(yīng)用，雖然有關(guān)黃精多糖抗氧化研究的報(bào)道較多[15-17]，但這些研究對象為黃精總多糖，且所研究植物為多花黃精Hua.或黃精Red.。目前有關(guān)滇黃精中多糖分離純化的研究，僅見吳群絨等[18]、Li等[19]分離得到2個(gè)均一多糖，滇黃精中其他均一多糖的分離純化及抗氧化活性的相關(guān)研究尚未見報(bào)道，極大制約了相關(guān)藥物產(chǎn)品和功能性食品的開發(fā)。因此，本研究通過水提醇沉、分級醇沉、DEAE-瓊脂糖凝膠FF（DEAE-Sepharose Fast Flow）離子交換柱和Sephadex G-100柱色譜法制備、純化滇黃精總多糖50%和70%醇沉部位，并利用柱前衍生化HPLC、高效凝膠滲透色譜法和紅外光譜法分別對其單糖組成、相對分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究；同時(shí)采用總還原力實(shí)驗(yàn)、DPPH和·OH清除法對其抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)，以期為滇黃精抗衰老藥物和功能性食品的開發(fā)利用提供科學(xué)參考。

1 儀器、試劑及材料

1.1 儀器

Agilent 1260高效液相色譜儀（G1322A在線脫氣機(jī)、G1311B四元梯度泵、G7129A進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱、G4260B型蒸發(fā)光散射檢測器和ChemStation色譜工作站）；Nexus 傅里葉變換紅外光譜儀（Thermo Necolet）；UV-5500型紫外可見分光光度計(jì)（上海元析儀器有限公司）；HW-3紅外烘干箱（天津市光學(xué)儀器廠）；FW-4A型粉末壓片機(jī)（天津市拓普儀器有限公司）；AL204型電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；Sigma 3-15臺式高速離心機(jī)（德國Sigma公司）；FD-1C-80型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 試藥

對照品右旋糖酐系列D0（批號140637- 201203）、D1（批號140638-201203）、D2（批號140639201203）、D3（批號140640-201203）、D4（批號140641201203）、D5（批號140642-201203）、D6（批號140643201203）、D7（批號140644201203）、D8（批號140645201203）、D2000（批號140646-201203），相對分子質(zhì)量（w）分別為180、2500、4600、7100、10 000、21 400、41 100、84 400、133 800、2 000 000，購于中國食品藥品檢定研究院；-葡萄糖（171106）、-甘露糖（170921）、-鹽酸氨基葡萄糖（171210）、-半乳糖（批號171206）、-鼠李糖（171024）、-巖藻糖（批號170813）、-葡萄糖醛酸（170730）、-木糖（170912）、-半乳糖醛酸（170903）、-核糖（171103）、-阿拉伯糖（171219），以上單糖質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，均購于上海融禾醫(yī)藥科技有限公司；牛血清白蛋白（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥96%，批號9048-46-8，麥克林）；DPPH（東京化成工業(yè)株式會社）；3-甲基-1-苯基-5-吡唑啉酮（PMP，阿拉丁有限公司）；維生素C（VC）和三氟乙酸（TFA）購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；其他試劑均為分析純。

1.3 材料

玻璃色譜柱（50 cm×2 cm），上海夏美生化科技發(fā)展有限公司；干型透析袋MD34-3.5（截留相對分子質(zhì)量3500），北京瑞達(dá)恒輝科技發(fā)展有限公司；滇黃精購于云南省大理市，經(jīng)大理大學(xué)藥學(xué)院段寶忠教授鑒定為百合科植物滇黃精Coll. et Hemsl.的干燥莖，憑證標(biāo)本（YNDL2017110201）存放于大理大學(xué)中藥標(biāo)本館。

2 方法

2.1 滇黃精均一多糖的分離與純化

稱取干燥滇黃精粉末適量置于圓底燒瓶中，按料液比1∶4加入石油醚-丙酮（體積比1∶1）加熱回流脫脂2次，每次2 h，揮干溶劑后，加入80%乙醇（料液比1∶4），加熱回流1 h，趁熱抽濾，除去小分子單糖，殘?jiān)?0%熱乙醇洗滌3次，60 ℃烘干。稱取滇黃精粉末（0.65 kg），以水為提取溶劑（料液比1∶10）在沸水浴中煎煮40 min，重復(fù)提取3次后，濾過，合并濾液，60 ℃減壓濃縮至小體積后，緩慢加入95%乙醇，使得醇沉后終濃度為90%，離心，得到沉淀物A；上清液濃縮，醇沉，使醇沉后終濃度為95%，得沉淀物B；合并沉淀物A、B，得滇黃精總多糖（PKS）。將PKS分別采用70%、50%乙醇醇沉，得醇沉物C（19.17 g）和D（22.62 g）；C和D復(fù)溶，加入等體積的Sevag試劑（正丁醇-氯仿，1∶5）脫蛋白，重復(fù)多次。然后用透析袋除小分子，依次過DEAE-瓊脂糖凝膠FF柱和Sephadex G-100柱，用蒸餾水，0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，利用苯酚-硫酸法監(jiān)測洗脫效果，高效凝膠色譜（HPGPC-ELSD）檢測純度，收集洗脫液，透析除鹽，冷凍干燥，從C部位得到多糖PKS-1（3.36 g），D部位得到PKS-2（2.64 g）、PKS-3（0.17 g）。

2.2 純度檢測

采用HPGPC-ELSD分析。色譜條件：色譜柱Shodex OHpak SB-804 HQ，流動(dòng)相為純凈水，體積流量0.6 mL/min，柱溫30.0 ℃，進(jìn)樣量10 μL；氣壓0.3 MPa，霧化溫度45 ℃，蒸發(fā)溫度110 ℃。

2.3 Mw測定

取已知w的右旋糖酐系列對照品D0、D1、D2、D3、D4、D5、D6、D7、D8，D2000適量，精密稱定，加流動(dòng)相溶液溶解至約1 mg/mL，混勻，濾過，作為窄標(biāo)校正溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測定，以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，lgw值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.4 理化性質(zhì)研究

滇黃精多糖的溶解性、斐林試劑反應(yīng)、Molish反應(yīng)、沉淀反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)等常規(guī)理化性質(zhì)參照文獻(xiàn)進(jìn)行[20]。

2.5 雜質(zhì)檢查

分別取滇黃精多糖配制質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的水溶液，進(jìn)行紫外光譜（UV）掃描分析，波長掃描范圍為190～700 nm。

2.6 紅外光譜（IR）結(jié)構(gòu)表征

取PKS-1～3各1 mg至瑪瑙研缽中，加入溴化鉀粉末200 mg作為分散劑，研磨均勻，取適量細(xì)粉平鋪于模具中，以20 MPa壓力壓制1 min，取出，對光檢視，以樣片均勻、半透光為佳，作為供試品。將制備好的供試品置于紅外光譜儀中掃描；光譜掃描范圍4000～400 cm?1，掃描32次，分辨率為4 cm?1，掃描時(shí)扣除H2O和CO2的背景。

2.7 黃精多糖的單糖組成及物質(zhì)的量分析

2.7.1 HPLC色譜條件 Agilent Zorbax-SB C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為乙腈（A）-0.025 mol/L磷酸鹽緩沖溶液（B）；梯度洗脫：0～10 min，15%～17% A；10～18.5 min，17%～22.5% A；18.5～20 min，22.5%～23.5% A；20～32 min，23.5%～30% A；體積流量0.8 mL/min；柱溫35 ℃；檢測波長250 nm；進(jìn)樣量20 μL。

2.7.2 對照品溶液的制備 精密稱取各單糖對照品適量，用蒸餾水配制成各單糖質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的混合對照品溶液。

2.7.3 樣品酸水解溶液的制備 精密稱取PKS-1～3各5 mg，置5 mL安瓿瓶中，精密加入2 mL 4 mol/L 三氟乙酸（TFA）溶液，封口后置110 ℃條件下水解7 h，取出，放冷，水浴蒸干，殘?jiān)尤爰状? mL，烘干，重復(fù)多次，至TFA除盡；加適量熱水使沉淀溶解，轉(zhuǎn)移到1 mL量瓶中，放冷，定容，搖勻，得樣品的酸水解溶液。

2.7.4 衍生化供試品溶液制備 分別精密吸取上述對照品和樣品酸水解溶液400 μL，置于5 mL的安瓿瓶中，各精密加入200 μL 0.6 mol/LNaOH和0.5 mol/LPMP溶液，置70 ℃條件下反應(yīng)60 min。取出，放冷，精密加入200 μL 0.6 mol/L HCl溶液，混勻。加入等體積的三氯甲烷，混勻，離心10 min（4000 r/min），去掉三氯甲烷層，重復(fù)多次至三氯甲烷層無色，即得對照品和樣品的衍生化供試品。

2.7.5 單糖組成的物質(zhì)的量分析 取混合對照品儲備液，分別配制成質(zhì)量濃度為0.01、0.025、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/mL的系列溶液，按“2.7.3”項(xiàng)下方法進(jìn)行衍生化處理，分別進(jìn)樣20μL測定。以對照品濃度為橫坐標(biāo)（），峰面積為縱坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算各對照品的組成比例。11種單糖的回歸方程及線性范圍分別為-核糖：＝6 498.2－9.762 8，0.196 0～9.800 0 μg，＝0.999 7；-甘露糖：＝2 690.1＋77.15，0.224 0～11.200 0 μg，＝0.999 8；-鼠李糖：＝5 912.3＋27.8，0.228 0～11.400 0 μg，＝0.999 7；-半乳糖醛酸：＝367.57＋61.36，0.196 0～9.800 0 μg，＝0.999 5；-鹽酸氨基葡萄糖：＝1 937.3＋14.204，0.240 4～12.020 0 μg，＝0.999 7；-葡萄糖醛酸：＝883.43＋34.9，0.196 0～9.800 0 μg，＝0.999 5；-半乳糖：＝1 495.3＋142.72，0.196 0～9.800 0 μg，＝0.999 5；-葡萄糖：＝4817＋161.23，0.200 8～10.040 0 μg，＝0.999 6；-木糖：＝1 992.2＋199.3，0.222 0～11.100 0 μg，＝0.999 5；-阿拉伯糖：＝6 077.4＋150.68，0.206 0～10.300 0 μg，＝0.999 8；-巖藻糖：＝1 061.8＋274.92，0.248 0～12.400 0 μg，＝0.999 5。

2.8 抗氧化活性評價(jià)

2.8.1 總還原力的測定 配制不同質(zhì)量濃度（0.2、1、2、3、4 mg/mL）PKS、PKS-1和PKS-2溶液，取上述溶液2.0 mL，分別加0.2 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 6.6）和1%鐵氰化鉀溶液2.0 mL，振蕩混勻，50 ℃水浴20 min，冷卻后加入10%三氯乙酸溶液2.0 mL，混勻，離心10 min（3000 r/min），取上清液2 mL，加入2.0 mL蒸餾水和0.5 mL 0.1%三氯化鐵溶液，混勻，靜置15 min，在波長700 nm測吸光度（）值，以蒸餾水作空白組，VC為陽性對照，比較不同樣品的總還原能力[21-22]。

總還原力＝1－2

1為反應(yīng)后樣品值，2為樣品本底值

2.8.2 DPPH自由基清除能力的測定 配制不同質(zhì)量濃度（0.2、1、2、3、4、8 mg/mL）PKS、PKS-1和PKS-2溶液，取上述溶液2.0 mL，加0.1 mmol/LDPPH無水乙醇溶液2.0 mL，混勻，靜置30 min，在517 nm測定值，以蒸餾水作空白組，VC作陽性對照組，按公式計(jì)算DPPH自由基的清除率[21-22]。

清除率＝1－(給藥－空白)/對照組

2.8.3 羥基自由基清除能力的測定 配制不同質(zhì)量濃度（0.2、1、2、3、4、8 mg/mL）PKS、PKS-1和PKS-2供試品溶液，精密吸取上述溶液2.0 mL，依次加入2 mL 5 mmol/LFeSO4、5 mmol/L水楊酸和5 mmol/LH2O2溶液，搖勻，37 ℃靜置30 min，在510 nm處測定值，以蒸餾水作空白組，VC作陽性對照組，按“2.8.2”項(xiàng)公式計(jì)算羥基自由基的清除率[21-22]。

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品分離及純度分析

分別對滇黃精多糖70%醇沉物（部位C）和50%醇沉物（部位D），采用DEAE-瓊脂糖凝膠FF和Sephadex G-100色譜分離純化，用蒸餾水和不同濃度NaCl溶液依次洗脫，采用苯酚-硫酸法檢測多糖洗脫效果，繪制洗脫曲線并收集同一洗脫液濃度下組分。70%醇沉物（部位C）的HPGPC-ELSD色譜圖及洗脫曲線見圖1-a、b，由圖1-a可見，部位C為2個(gè)均一多糖組成；當(dāng)NaCl濃度分別為0.1、0.3 mol/L時(shí)，洗脫曲線有2個(gè)峰，洗脫峰的峰形對稱，分別收集2個(gè)不同濃度洗脫液下的樣品（S1、S2），采用HPGPC-ELSD檢測S1和S2，其色譜圖見圖1-e、g，可見二者峰形對稱，其中S1的保留時(shí)間為13.1 min，S2的保留時(shí)間為10.1 min，表明為2個(gè)均一多糖，分別命名為PKS-1、PKS-3。50%醇沉物（部位D）的HPGPC-ELSD色譜圖及洗脫曲線見圖1-c、d，由圖可見，當(dāng)NaCl濃度分別為0.1、0.2 mol/L時(shí)，洗脫曲線有2個(gè)峰，分別收集2個(gè)不同濃度洗脫液下的樣品（S3、S4），采用HPGPC-ELSD檢測S3和S4，其色譜圖見圖1-f、g，可見二者峰形對稱，表明為均一多糖，其中S3、S4的保留時(shí)間分別為11.3、10.1 min。比較發(fā)現(xiàn)S4與S2的保留時(shí)間一致，提示可能為同一個(gè)化合物，分別取S4及S2樣品1 mg混合，經(jīng)HPGPC-ELSD檢測得1個(gè)對稱峰，表明二者為同一化合物，命名為PKS-3；S3命名為PKS-2。因此，從C部分和D部位共分離得到3個(gè)均一多糖。

a、c-部位C和D的HPGPC-ELSD色譜圖 b、d-部位C和D的洗脫曲線 e～g-PKS-1、PKS-2、PKS-3的HPGPC-ELSD色譜圖 S1-PKS-1 S2、S4-PKS-3 S3-PKS-2

a, c-HPGPC-ELSD chromatograms of C and D b, d-elution curves of C and D e—g-HPGPC-ELSD chromatograms of PKS-1, PKS-2, and PKS-3 S1-PKS-1 S2 and S4-PKS-3 S3-PKS-2

圖1 滇黃精多糖的HPGPC-ELSD色譜圖

Fig. 1 HPGPC-ELSD chromatograms and gradient elution of polysaccharide of

3.2 Mw的測定

以已測定w的葡聚糖對照品保留時(shí)間為橫坐標(biāo)（），lgw為縱坐標(biāo)（），得葡聚糖對照品回歸方程為＝－0.254 9＋8.217 6，2＝0.994 9。計(jì)算3個(gè)均一多糖的w。PKS-1、PKS-2、PKS-3的w分別為85 017.83、266 084.76、474 799.22。

3.3 理化性質(zhì)

PKS-1、PKS-2、PKS-3均為白色絮狀物，溶于水，難溶于乙醇、氯仿、石油醚等溶劑。3個(gè)均一多糖的Molish反應(yīng)均為陽性，表明為糖類物質(zhì)；斐林試劑反應(yīng)為陰性，表明不含游離還原性單糖；沉淀反應(yīng)、雙縮脲反應(yīng)、茚三酮反應(yīng)均為陰性，表明不含蛋白質(zhì)。

3.4 雜質(zhì)檢查

紫外光譜掃描顯示PKS在272 nm有吸收峰，表明含有蛋白質(zhì)或核酸等雜質(zhì)，PKS-1、PKS-2、PKS-3僅在200 nm處有末端吸收，為多糖的特征吸收；在272 nm附近無吸收峰，表明蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)已脫除干凈。

3.5 IR光譜分析

3個(gè)均一多糖紅外光譜見圖2，可見三者均具有明顯的多糖特征峰；在3400 cm?1附近均具強(qiáng)而寬的O-H伸縮振動(dòng)吸收峰；PKS-1～3中羧基的C＝O伸縮振動(dòng)吸收峰分別位于1729、1730、1739 cm?1處，表明均含有糖醛酸結(jié)構(gòu)[23]；3個(gè)多糖分別在951、953、953 cm?1處有吸收，提示由吡喃糖環(huán)醚鍵（-C-O-C-）的非對稱伸縮振動(dòng)引起；此外，吸收峰874、890、890 cm?1表明3個(gè)多糖均具有β糖苷鍵（C1-H的彎曲振動(dòng)）。因此，通過紅外光譜可知，PKS-1～3為酸性多糖，具有β吡喃糖苷鍵構(gòu)型。

圖2 滇黃精多糖的IR光譜

3.6 單糖組成及物質(zhì)的量比分析

單糖混合對照品溶液與PKS-1～3水解產(chǎn)物的PMP衍生色譜圖見圖3。經(jīng)與對照品保留時(shí)間比較，可見PKS-1單糖組成主要為-甘露糖、-核糖、-半乳糖醛酸、-鹽酸氨基葡萄糖、-葡萄糖醛酸、-半乳糖、-葡萄糖、-木糖、-阿拉伯糖、-巖藻糖，其物質(zhì)的量比為111.3∶32.2∶55.5∶35.7∶67.4∶15.0∶3.4∶0.1∶70.7∶173.7；PKS-2單糖組成為-甘露糖、-半乳糖醛酸、-鹽酸氨基葡萄糖、-葡萄糖醛酸、-半乳糖、-葡萄糖、-木糖、-阿拉伯糖、-巖藻糖，物質(zhì)的量比為118.7∶29.9∶13.7∶41.6∶7.3∶2.3∶8.9∶43.2∶75.5；PKS-3單糖組成為-甘露糖、-鼠李糖、-半乳糖醛酸、-鹽酸氨基葡萄糖、-葡萄糖醛酸、-半乳糖、-葡萄糖、-木糖、-阿拉伯糖、-巖藻糖，其物質(zhì)的量比為82.4∶1.0∶21.8∶8.4∶25.0∶3.7∶1.0∶4.4∶28.9∶23.9。

a-對照品 b-PKS-1 c-PKS-2 d-PKS-3 1-PMP 2-D-甘露糖 3-D-核糖 4-L-鼠李糖 5-D-半乳糖醛酸 6-D-鹽酸氨基葡萄糖 7-D-葡萄糖醛酸 8-D-半乳糖 9-D-葡萄糖 10-D-木糖 11-D-阿拉伯糖 12-L-巖藻糖

3.7 抗氧化活性評價(jià)

由于PKS-3得率較低，未能收集到足夠樣品用于抗氧化能力測試。PKS、PKS-1和PKS-2的總還原能力、·OH及DPPH自由基的清除能力如圖4所示。由圖中可見，PKS、PKS-1和PKS-2均具有一定的還原能力，在0.2～8.0 mg/mL，3個(gè)多糖對DPPH自由基和·OH自由基清除的能力，隨著質(zhì)量濃度的增加，清除率也隨之增加，呈明顯量效關(guān)系；在清除DPPH自由基能力方面，當(dāng)質(zhì)量濃度小于1 mg/mL時(shí)，PKS和PKS-1、PKS-2的自由基清除能力差別不顯著；當(dāng)質(zhì)量濃度大于1 mg/mL時(shí)，PKS對DPPH自由基的清除能力明顯優(yōu)于PKS-1、PKS-2，并且差別逐漸增大；此外，在質(zhì)量濃度在0.2～8.0 mg/mL時(shí)，3個(gè)多糖的總還原能力、·OH及DPPH自由基的清除能力，抗氧化能力均為PKS＞PKS-2＞PKS-1。

a-總還原力 b-DPPH自由基清除能力 c-·OH自由基清除能力

4 討論

本研究采用分級沉淀法結(jié)合柱色譜分離方法，從PKS的50%、70%醇沉部位分離得到3個(gè)均一多糖（PKS-1～3），研究表明3個(gè)均一多糖的相對分子質(zhì)量分別為85 017.83、266 084.76和474 799.22。UV光譜結(jié)果表明，3個(gè)均一多糖中的蛋白質(zhì)、核酸等雜質(zhì)已被有效去除；IR光譜表明，PKS-1～3為酸性多糖，具有β吡喃糖苷鍵構(gòu)型。PMP-HPLC衍生化結(jié)果表明，3個(gè)均一多糖的單糖組成均含有-甘露糖、-半乳糖醛酸、-葡萄糖醛酸、-半乳糖、-阿拉伯糖和-巖藻糖，其中PKS-1及PKS-3還分別含有-核糖和-鼠李糖，且單糖組成物質(zhì)的量比有一定差異?？傔€原力、DPPH和羥自由基清除力研究顯示，滇黃精PKS和均一多糖PKS-1、PKS-2均具有一定的抗氧化活性，3個(gè)多糖的總還原能力、·OH自由基及DPPH自由基的清除能力均為PKS＞PKS-2＞PKS-1。其中總多糖PKS的抗氧化活性較均一多糖強(qiáng)，這一結(jié)論與有關(guān)學(xué)者對仙人掌多糖的相關(guān)研究結(jié)果一致[24]。其原因可能是PKS1和PKS2為從90%的醇沉物中分離得到，而總多糖PKS還包括了95%的醇沉物，總多糖的抗氧化活性可能為多種成分協(xié)同作用的結(jié)果，這一推測亦被其它學(xué)者證實(shí)[25]。本研究為滇黃精抗氧化活性成分的研究及抗衰老藥物和功能性食品的開發(fā)利用奠定了科學(xué)基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Separation, physicochemical properties and anti-oxidant activities of three polysaccharides from

WANG Jing1, TAO Ai-en1, YANG Yan2, YANG Jian-bo3, YAN Ren-yi1, 4, DUAN Bao-zhong1

1. College of Pharmaceutical Science, Dali University, Dali 671000, China 2. Yunnan Provincial Academy of Science and Technology, Kunming 650051, China 3. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China 4. Tianjin Ubasio Biotechnology Group Co., Ltd., Tianjin 300132, China

To investigate the physicochemical properties and antioxidant activities of homogeneous polysaccharides isolated from.The polysaccharides (PKS) were extracted with hot water, followed by precipitating with 50% and 70% alcohol precipitation site. Three homogeneous polysaccharides were purified by DEAE-Sepharose fast flow ion column and Sephadex G-100 gel column chromatography from PKS. The monosaccharide composition and molecular ratio, molecular weight and structural analysis of homogeneous polysaccharides were detected by pre-column derivatization HPLC, HPGPC-ELSD chromatograms and infrared spectroscopic, respectively. The antioxidant activities of polysaccharides were evaluated by the reducing power, DPPH free radical and hydroxyl rdical scavenging ability.Three homogeneous polysaccharides (PKS-1, PKS-2, PKS-3) were obtained from 50% and 70% alcohol precipitation site. Their monosaccharide composition was mainly-mannose,-GalA,-GlcA,-galactose,-arabinose and-fucose, and with a small amount of-ribose,-rhamnose in PKS-1 and PKS-3, respectively. The molecular weight of PKS-1, PKS-2, PKS-3 was 85 017.83, 266 084.76, and 474 799.22, respectively. The order of antioxidant activities was as follows: PKS＞PKS-2＞PKS-1.Three polysaccharides were obtained from PKS with pyranoid rings, β type of anomeric carbon configuration and similar monosaccharide composition. Antioxidant activity test showed that PKS, PKS-1 and PKS-2 exhibited some antioxidant activity in a dose-dependent manner. This research may provide the theoretical basis for scientists researching antioxidant components, searching for anti-aging drugs and developing functional food from.

Coll. et Hemsl.;-mannose;-GalA;-GlcA;-galactose;-arabinose;-fucose; physicochemical characteristic; antioxidation

R286.2

A

0253 - 2670(2021)16 - 4789 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.16.004

2021-03-06

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31460086）；云南省重大科技專項(xiàng)（202002AA100007）；大理大學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ZKLX2019318）；云南省院士專家工作站；云南省青年拔尖人才支持計(jì)劃（段寶忠）

王 婧，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與鑒定。E-mail: jwang@yntcm.ac.cn

陶愛恩，研究方向?yàn)橹兴庂Y源。Tel: (0872)2257401 E-mail: 2515073996@qq.com

段寶忠，博士，教授，研究方向?yàn)橹兴庂Y源與鑒定。Tel: (0872)2257401 E-mail: bzduan@126.com

[責(zé)任編輯 時(shí)圣明]