2,4-二硝基甲苯磺酸鹽降解菌株的分離、鑒定及降解特性研究

徐文杰 趙泉林 羅明漢 葉正芳,?

1. 南京工程學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院, 南京 211167; 2. 北京大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院,北京 100871; ? 通信作者, E-mail: zhengfangye@163.com

TNT 紅水是采用亞硫酸鈉精制 TNT 過程中產(chǎn)生的一種廢水, 其中的主要污染物為二硝基甲苯磺酸鹽(DNTS), 此外還有 TNT, DNT 和 MNT 等硝基苯衍生物[1-3]。TNT 紅水中有機(jī)物濃度高且毒性大,處理難度非常大[4-6]。甘肅某地由于 TNT 紅水蒸發(fā)池滲漏, 對土壤造成嚴(yán)重污染, 威脅到黃河上游的水質(zhì)安全。因此, TNT 紅水污染土壤修復(fù)是目前亟待解決的環(huán)境問題。

與非生物修復(fù)技術(shù)相比, 生物修復(fù)是一種環(huán)境友好且成本更低的方法, 許多微生物可以以有毒有機(jī)污染物為底物, 將復(fù)雜的有機(jī)化合物降解為簡單的小分子化合物[7-8]。許多學(xué)者分離出 TNT 高效降解菌株[9-13]。然而, 目前關(guān)于DNTS 的生物降解的研究有限。Tsai[14]研究真菌對 TNT 紅水的生物處理方法, 但未涉及降解機(jī)理。Zhang 等[15]研究固定化微生物技術(shù)對 TNT 紅水的生物降解效果, 結(jié)果表明只有 2,4-DNT-5-SO3-可被有效降解, 2,4-DNT-3-SO3-不能被生物降解。微生物在自然環(huán)境中對 DNTS 的降解受到諸多環(huán)境條件的限制, 普通微生物降解效率有限, 故篩選并分離出高效的降解菌是微生物修復(fù)技術(shù)的關(guān)鍵基礎(chǔ)。本研究組分離出一株能高效降解兩種磺酸鹽的假單胞菌 X5[16], 但能用于 2,4-二硝基甲苯磺酸鹽降解的菌種資源仍然匱乏, 未見將鞘氨醇單胞菌屬用于磺酸鹽降解的研究。

本研究分離純化能高效降解 2, 4-二硝基甲苯磺酸鹽的菌株, 通過形態(tài)學(xué)觀察、生理生化性能研究及基因序列分析, 對降解菌進(jìn)行鑒定, 探討環(huán)境因素對分離出的降解菌株生長的影響, 研究分離出的菌株對磺酸鹽的降解機(jī)理以及對其他硝基芳香族化合物的降解效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

2,4-DNT-3-SO3-和 2,4-DNT-5-SO3-由蘭州大學(xué)合成。污染土壤取自甘肅某 TNT 紅水污染場地, 未污染土壤取自當(dāng)?shù)剡h(yuǎn)離工廠的潔凈土壤?；撬猁}降解菌分離自投加復(fù)合微生物的 DNTS 污染土壤。

LB 培養(yǎng)基: 胰蛋白胨 10 g、NaCl 10 g 和酵母提取物 5 g 溶于 1000 mL 蒸餾水中, 用 1 mol/L 的NaOH 調(diào)節(jié) pH 值至 7.2±0.2, 用高壓滅菌鍋在 121°C條件下滅菌 15 分鐘。在上述培養(yǎng)基中加入 18%瓊脂, 得到本研究所用的固體培養(yǎng)基。

無機(jī)鹽培養(yǎng)基(MSM): NaCl 30 g, NH4NO33 g,KH2PO41 g, K2HPO41 g, CaCl20.02 g, MgSO40.5 g,去離子水 1 L; 微量元素溶液(NiCl2·6H2O 0.03 g,FeSO4·7H2O 0.2 g, CuSO4·5H2O 0.03g, CoCl2·6H2O 0.1 g, MnSO40.1 g, Na2MoO4·2H2O 0.04 g, H3BO30.03 g 和去離子水 1 L) 10 mL。用高壓滅菌鍋在121°C 條件下滅菌 15 分鐘。

1.2 菌株分離與鑒定

取 2 g 投加復(fù)合微生物的 DNTS 污染土壤, 放入裝有 100 mL 無菌 LB 液體培養(yǎng)基的錐形瓶中, 在30°C 和 120 rpm 的恒溫?fù)u床上進(jìn)行震蕩, 富集培養(yǎng)24 小時(shí)。取 l mL 培養(yǎng)液, 采用稀釋涂布平板法分離純化菌株。

挑取單克隆菌株在 LB 液體培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)一定的時(shí)間, 采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡對菌株形態(tài)進(jìn)行觀察。根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17]研究其生理和生化特性, 包括革蘭氏染色、甲基紅測試、七葉靈水解、明膠水解、硝酸鹽還原、吲哚生成、H2S 生成、V-P 測試以及不同碳源利用。

通過 16S rDNA 序列分析鑒定分離的菌株。用細(xì)菌基因組 DNA 提取試劑盒(Solarbio, D1600)提取分離菌株的基因組 DNA。所用引物為 8F (5'-AGA GTTTGATCCTGGCTCAG-3')和 1513R (5'-TACGGT TACCTTGTTACGACTT-3'), 通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增提取 DNA。純化的 DNA 送至上海鉑天生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測序。使用 BLAST 進(jìn)行核苷酸序列相似性分析。

1.3 環(huán)境因素對菌株生長的影響

挑取菌株的單菌落并轉(zhuǎn)移到無菌 LB 液體培養(yǎng)基中, 并在 30°C 和 120 rpm 條件下培養(yǎng) 12 小時(shí)作為種子培養(yǎng)物。

1) 溫度的影響: 以 1%的接種量, 將菌株的種子培養(yǎng)液接種于 LB 液體培養(yǎng)基中, 分別將錐形瓶置于 20, 25, 30, 35 和 40°C 的搖床中, 120 rpm 培養(yǎng)24 小時(shí), 測定菌液的 OD600值。每組設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。

2) pH 的影響: 以 1%的接種量, 將菌株的種子培養(yǎng)液接種于 pH 分別為 5, 6, 7, 9 和 11 的 LB 液體培養(yǎng)基中, 30°C 和 120 rpm 培養(yǎng) 24 小時(shí), 測定 OD600值。培養(yǎng)基的 pH 值用 1N HCl 和 1N NaOH 調(diào)節(jié)。每組設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。

3) 鹽度的影響: 以 1%的接種量, 接種菌株于NaCl 濃度為 0, 1%, 3%, 5%, 7%和 10%的無 NaCl LB液體培養(yǎng)基中, 于 30°C 和 120 rpm 培養(yǎng) 24 小時(shí), 測定 OD600值。每組設(shè)置 3 個(gè)重復(fù)。

1.4 菌株對磺酸鹽及其他硝基化合物的降解能力

將菌株接種在滅菌的 LB 液體培養(yǎng)基中活化 24小時(shí)。將各菌液的 OD600稀釋至 1, 取 10 mL 菌液分別加入含 100 g 濃度為 500 mg/kg 的 2,4-DNT-3-SO3-和 2,4-DNT-5-SO3-污染土壤的錐形瓶中, 并補(bǔ)加 30 mL 水, 調(diào)節(jié)液土比為 2:5。將錐形瓶置于 30°C 的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔一定時(shí)間取樣, 測定土壤中二硝基甲苯磺酸鹽濃度。每組設(shè) 3 個(gè)重復(fù)。

為研究菌株對不同硝基芳香化合物的降解能力, 分別配置濃度為 100 mg/kg 的 TNT, 2,4-DNT,2,6-DNT, 2-MNT, 3-MNT 和 4-MNT 污染土壤。分別取 12.5 mL 菌株的種子培養(yǎng)物, 6000 rpm 離心5 分鐘收集菌體, 并重新懸浮于 40 mL MSM 培養(yǎng)基中。將菌懸液加入含 100 g 各污染物土壤的錐形瓶中,于 30°C 培養(yǎng)。每組設(shè) 3 個(gè)平行樣。7 天后, 取樣測定各硝基化合物濃度。

1.5 2,4-二硝基甲苯磺酸鹽及其降解產(chǎn)物、硝基化合物的測定

兩種 2,4-二硝基甲苯磺酸鹽的測定: 取 2 g 土樣和 10 mL 超純水加入 15 mL 離心管中, 渦旋振蕩 30秒, 30°C 超聲波振蕩 3 小時(shí), 10000 rpm 離心 5 分鐘,取上清液用 0.45 μm 水系濾膜過濾, 用高效液相色譜(HPLC)進(jìn)一步測定其含量。測定條件如下: SBAq 色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 柱溫為 40°C, 檢測波長為 230 nm。以乙腈:磷酸二氫鉀溶液(0.68‰)為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫, 流速為 1.0 mL/min, 進(jìn)樣量為 20 μL。

采用液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀對降解過程中的產(chǎn)物進(jìn)行分析。色譜條件: 色譜柱采用 Agilent Extend-C18 column (150 mm×2.1 mm, 5 μm), 柱溫為 40°C,進(jìn)樣量為 10 μL, 檢測波長為 230 nm; 流動(dòng)相為乙酸銨和乙腈梯度洗脫, 流速為 0.3 mL/min。質(zhì)譜條件: ESI 的電離霧源, 二級質(zhì)譜負(fù)離子掃描模式, 離子阱 SL 系統(tǒng); 采用 MRM 的 isolation 模式, 目標(biāo)離子為m/z261; 掃描范圍為m/z50～400, 最長積累時(shí)間為 300 ms, 毛細(xì)管電壓為 3500 V, 氣化壓力為 35 psi (2.4×105 Pa), 干燥器(N2)流速為 8.0 mL/min, 溫度為 330°C, 破碎電壓為 1.0 eV。

TNT 等硝基化合物的測定: 取 2 g 土樣和 10 mL乙腈加入 15 mL 離心管中, 渦旋振蕩 30 秒, 4°C 超聲波振蕩 3 小時(shí), 10000 rpm 離心 5 分鐘。取上清液用0.45 μm 有機(jī)系濾膜過濾, 用 HPLC 進(jìn)一步測定硝基芳香族化合物含量。測試方法如下: SB-Aq 色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm), 柱溫為 30°C, 檢測波長為246 nm。流動(dòng)相為甲醇和超純水(1:1), 流速為 1.0 mL/min, 進(jìn)樣量為 20 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 降解菌株的鑒定

將本研究分離出的磺酸鹽高效降解菌株編號(hào)為X2, 其在 LB 固體培養(yǎng)基上的群落形態(tài)及電鏡照片如圖 1 所示。菌株 X2 在 LB 平板培養(yǎng)基上生長的菌落形態(tài)特征為黃色, 單個(gè)菌落呈圓形, 邊緣整齊,表面光滑有光澤。在電子顯微鏡下, X2 菌體為桿狀, 長度約為 2～3 μm。

圖1 菌株X2 在LB 平板培養(yǎng)基上的附著形態(tài)(a)及電鏡照片(b)Fig.1 Morphology of X2 on LB plating medium (a) and under FESEM (b)

菌株的生理生化試驗(yàn)結(jié)果如表 1 所示, X2 為革蘭氏陰性, 可耐受溫度范圍為 4～41°C, V-P 試驗(yàn)、亞硝酸還原和產(chǎn)酸試驗(yàn)結(jié)果為陽性, 明膠水解和H2S 產(chǎn)生試驗(yàn)結(jié)果為陰性, 能夠代謝利用多種碳源,如葡萄糖、淀粉、麥芽糖、L-鼠李糖和纖維二糖等。

表1 菌株X2 的生理生化指標(biāo)Table 1 Physio-biochemical characteristics of the isolated strain X2

將菌株 X2 的 16S rDNA 序列在 GenBank 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行 BLAST 比對, 與鞘氨醇菌Sphingobium yanoikuyaeNBRC 15102 的相似度為 100%。

2.2 環(huán)境因素對菌株生長的影響

通過測定培養(yǎng) 24 小時(shí)后的 OD600值, 研究不同環(huán)境因素對菌株 X2 生長的影響。圖 2(a)顯示溫度對 X2 生長的影響, X2 在 25～40°C 的溫度范圍內(nèi)均具有較好的生長效果, OD600在 20～30°C 范圍內(nèi)隨溫度升高而增加, 在 30°C 時(shí)生長效果最佳, 超過 30°C后 OD600值減小。類似地, Park 等[18]采用Sphingobium chungbukenseKCTC 2955 降解鄰苯二甲酸酯的研究中, 降解率在 20～30°C 范圍內(nèi)隨溫度的升高而升高, 溫度超過 30°C 后, 降解效率和生長速率均顯著下降。圖 2(b)顯示 pH 對細(xì)菌生長的影響, X2可在 7～9 的 pH 范圍內(nèi)快速生長, 最佳 pH 值為 7。菌株 X2 對酸性及堿性環(huán)境具有一定的抵抗力, 但在 pH 為 3 和 11 時(shí)生長受到顯著的抑制。同樣地,Fu 等[19]指出鞘氨醇單胞菌 FB3 可在 pH5～9 范圍內(nèi)降解 PAH, 在 pH=7 時(shí)降解效果最佳, 可能是因?yàn)閜H 過低或過高會(huì)改變生物大分子(如蛋白質(zhì)和核酸)的電荷, 影響其生物活性, 同時(shí)可能改變細(xì)胞膜的電荷, 從而阻礙細(xì)胞膜吸收營養(yǎng)物質(zhì)[20]。圖 2(c)顯示鹽度對細(xì)菌生長的影響, 菌株 X2 在 NaCl 濃度為0～3%之間均具有較好的生長效果, 在 NaCl 濃度為1%時(shí)生長最佳, 超過 5%時(shí)生長受到顯著抑制。類似地, 李朔[21]發(fā)現(xiàn), 鞘氨醇單胞菌 YL-JL2C 在 0～2%鹽度范圍內(nèi)可生長, 在 NaCl 濃度為1.5% 條件下生長最優(yōu)。邊晨凱[22]發(fā)現(xiàn), 在 NaCl 濃度為 1%時(shí),鞘氨醇單胞菌 B1 對咔唑(CA)的降解率在 96 小時(shí)后達(dá)到 90%, 但當(dāng) NaCl 濃度達(dá)到 2%后, 降解率只有50%; 而 NaCl 濃度≥3% 時(shí), 菌株 B1 對 CA 基本上不降解。由此說明, 菌株 B1 具有一定的耐鹽能力, 能在較低鹽度條件下高效地降解 CA。

圖2 環(huán)境因素((a)溫度、(b) pH 和(c)鹽度)對菌株X2 生長的影響Fig. 2 Effect of environmental factors ((a) temperature, (b) pH and (c) salinity) on the growth of X2

2.3 菌株對 2,4-二硝基甲苯磺酸鹽的降解機(jī)理

在菌株 X2 最佳生長條件(30°C, pH=7, 鹽度1%)下進(jìn)行生物降解試驗(yàn)。菌株 X2 對兩種 2,4-二硝基甲苯磺酸鹽的降解曲線如圖 3 所示?？梢钥闯?當(dāng) 2,4-DNT-3-SO3-和 2,4-DNT-5-SO3-濃度為 500 mg/kg 時(shí), 菌株 X2 能夠完全降解兩種磺酸鹽, 所需時(shí)間分別為 12 天和 3 天。2,4-DNT-5-SO3-比 2,4-DNT-3-SO3-更易被生物降解, 可能是由于 2,4-DNT-3-SO3-的空間位阻大, 導(dǎo)致其難以被還原[23]。Zhang等[15]研究復(fù)合菌群 B925 對 TNT 紅水的降解效果,結(jié)果表明系統(tǒng)在穩(wěn)定期對 2,4-DNT-5-SO3-具有較高的降解率, 而 2,4-DNT-3-SO3-不能被降解。本研究分離出的鞘氨醇單胞菌 X2 對兩種磺酸鹽均具有較好的降解效果。

圖3 菌株 X2 對 2,4-DNT-3-SO3-和 2,4-DNT-5-SO3-的降解曲線Fig. 3 Biodegradation curve of 2,4-DNT-3-SO3-and 2,4-DNT-5-SO3- by strain X2

圖 4 為磺酸鹽在菌株 X2 降解前后的液相色譜圖。在降解前, 色譜圖中兩個(gè)峰 P1 和 P2 (質(zhì)譜分析表明兩峰對應(yīng)的質(zhì)荷比均為 261)分別對應(yīng) 2,4-DNT-3-SO3-和 2,4-DNT-5-SO3-。經(jīng) X2 降解后,P1 和 P2 峰消失, 說明 2,4-DNT-3-SO3-和 2,4-DNT-5-SO3-已被完全降解, 同時(shí)出現(xiàn) 3 個(gè)新峰(P3～P5)。通過 LC-MS 進(jìn)一步研究生物降解產(chǎn)物, P3, P4 和 P5 的主要碎片離子質(zhì)荷比分別為 217, 217 和 231, 推測其對應(yīng)的物質(zhì)分別為 2-羥基氨基-4-氨基甲苯-5-SO3-、2-羥基氨基-4-氨基甲苯-3-SO3-和 4-氨基-2-MNT-3-SO3-。由此推斷, 在 X2 降解代謝兩種 2, 4-二硝基甲苯磺酸鹽的過程中, 苯環(huán)上的兩個(gè)硝基還原為羥胺基, 并進(jìn)一步還原為氨基。Lin 等[24]報(bào)道TNT 的好氧降解過程為一個(gè)硝基還原形成羥胺基,并進(jìn)一步還原成氨基。與 TNT 類似, DNTS 的電子密度極小, 因此不可能進(jìn)行氧化攻擊, 在有氧和無氧條件下都經(jīng)過還原途徑降解[25]。與母體相比, 還原產(chǎn)物的電子密度降低, 更易于被氧化, 在好氧條件下可被進(jìn)一步氧化成小分子物質(zhì)。

圖4 磺酸鹽降解前后液相色譜圖Fig. 4 Liquid chromatograms of DNTS before and after biodegradation

2.4 菌株對其他硝基芳香族炸藥的降解

菌株 X2 對硝基化合物的降解效果如表 2 所示。經(jīng)過 7 天的降解, TNT, 2,4-DNT, 2,6-DNT, 2-MNT, 3-MNT 和 4-MNT 的濃度分別從 99.65±2.39, 100.27±2.62, 99.96±2.24, 98.84±2.58, 101.11±2.51 和99.47±1.84 mg/kg 下降至 10.93±1.82, 35.21±2.17, 56.08±2.45, 71.44±2.98, 62.04±2.92 和 64.80±1.86 mg/kg,去除率分別為 89.03%, 64.88%, 43.90%, 27.72%,38.64%和 34.85%。以上結(jié)果表明, 菌株 X2 對硝基化合物具有廣譜降解特性, 不僅可以降解 DNTS,還可以降解 TNT, DNT 和 MNT 等硝基芳烴污染物。目前, 已有研究者分離出 TNT, DNT 和 MNT降解菌株, 如 Lee 等[26]發(fā)現(xiàn)Pseudomonassp.HK-6含有編碼硝基還原酶的pnrB基因, 能利用 TNT 作為氮源還原 TNT。然而, 這些研究中分離出的菌株往往只對某一種火炸藥污染物具有較好的降解性,而實(shí)際火炸藥污染場地同時(shí)含有多種硝基芳香族化合物。本研究中分離的高效降解菌株對多種硝基化合物都具有較好的降解能力, 更適用于火炸藥污染場地的修復(fù)。

表2 菌株對硝基化合物的降解效果Table 2 Concentrations of nitro-aromatic compounds before and after degradation

3 結(jié)論

本研究從復(fù)合菌群中分離出一株 DNTS 降解菌株 X2, 經(jīng)過生理生化分析及 16S rDNA 鑒定, 確定該菌株為鞘氨醇單胞菌屬。X2 的最佳生長條件為30°C, pH=7.0 和 1%鹽度。該菌株對 2,4-DNT-3-SO3-和 2,4-DNT-5-SO3-降解率分別在第 12 天和第 3天達(dá)到 100%。X2 通過還原路徑降解 DNTS, 其降解路徑為兩個(gè)硝基被逐步還原為羥胺基, 并進(jìn)一步還原為氨基。同時(shí), 菌株 X2 具有廣譜降解特性, 不僅可以降解 DNTS, 還可以有效地降解其他硝基芳香族火炸藥污染物(如 TNT, DNT 和 MNT)。TNT 紅水污染土壤的成分復(fù)雜, 處理難度大, 鞘氨醇單胞菌X2 的廣譜降解特性可以極大地?cái)U(kuò)展其在環(huán)境中的應(yīng)用, 為修復(fù)受各種硝基芳香族化合物污染的場地提供一種環(huán)保且廉價(jià)的方法。