韭菜緩慢生長法離體保存技術(shù)研究

肖婉露 馬培芳 李延龍 張偉 王繼蕓 陳建華

摘? ? 要：為探索緩慢生長法離體保存技術(shù)在韭菜中的應(yīng)用，以航研998為試驗材料，利用植物組織培養(yǎng)法，在MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1的基本培養(yǎng)基中添加不同濃度的山梨醇、瓊脂、蔗糖、矮壯素（CCC）和脫落酸（ABA）對韭菜組培苗進(jìn)行保存，每隔20 d調(diào)查1次組培苗的不定芽數(shù)、株高和存活率。結(jié)果表明，20 g·L-1的山梨醇、70 g·L-1的蔗糖、250 mg·L-1的CCC和1.0 mg·L-1的ABA均能有效抑制韭菜組培苗的生長，且在保存120 d后保持較高的成活率和良好的生長表現(xiàn)。研究結(jié)果為韭菜緩慢生長法離體保存體系的建立提供了理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：韭菜;緩慢生長;離體保存;種質(zhì)資源

中圖分類號：S633.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）07-071-05

Study on slow growth conservation in vitro of Chinese chive

XIAO Wanlu1， MA Peifang1，2， LI Yanlong1，2， ZHANG Wei1，2， WANG Jiyun1，2， CHEN Jianhua1，2

（Pingdingshan Academy of Agricultural Sciences， Pingdingshan 467001， Henan， China; Henan Chinese Chive Engineering Technology Research Center， Pingdingshan 467001， Henan， China））

Abstract： In order to explore the application of slow growth conservation in vitro of Chinese Chive， Hangyan 998 was cultured on the base medium （MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1） containing with different concentractions of sorbitol， agar， sucrose， CCC and ABA， the shoot number， height and survival rate of regenerated plantlets were investigated every 20 days. The results showed thatsorbitol at 20 g·L-1， sucrose at 70 g·L-1， CCC at 250 mg·L-1 and ABA at 1.0 mg·L-1 were all found obvious inhibition effects on the growth of seedlings， with quiet high survival rate and good growth status after 120 days. It provides a theoretical foundation for the establishing of slow growth conservation in vitro system of Chinese chive.

Key words： Chinese chive;Slow growth;In vitro conversation;Germplasm resources

韭菜是石蒜科（Amaryllidaceae）蔥屬（Allium）多年生草本植物，含有特殊的辛香味，葉和花莖均可食用;種子中含有大量的生物堿和皂苷，具有補肝腎、暖腰膝和壯陽固精的作用;根則含有豐富的硫化物、苷類，具有溫中、行氣、散淤和解毒的功效。因此，韭菜是一種食用和藥用價值都很高的營養(yǎng)保健蔬菜[1]。目前韭菜種質(zhì)資源的保存大多是采用傳統(tǒng)的田間種植種質(zhì)保存法，這種方法不僅容易受到病毒感染、病蟲害侵襲或自然災(zāi)害等現(xiàn)象的限制，而且占用大量場地，浪費大量的人力、財力和物力[2]。另外，韭菜種子常溫貯藏條件下，壽命較短，一般不超過1年，而在低溫庫，雖然貯藏時間較長，但是發(fā)芽率不高。通過組培苗進(jìn)行種質(zhì)保存可以克服傳統(tǒng)方法的一些缺點，但是不斷繼代又會引起資源染色體和基因型變異，也可能導(dǎo)致培養(yǎng)細(xì)胞的全能性喪失，甚至丟失一些寶貴的特殊性狀。所以，探索出一套符合韭菜特點的種質(zhì)資源保存方法是非常必要的。

緩慢生長法離體保存技術(shù)是以植物組織培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ)，通過改變培養(yǎng)條件，如調(diào)節(jié)滲透壓、添加調(diào)節(jié)物質(zhì)、降低培養(yǎng)溫度等方式延緩或停止植株生長，需要時立即恢復(fù)生長并再生植株的方法[3]。通過該方法可以大大延長組培苗繼代周期。常用的高滲物質(zhì)有山梨醇、蔗糖、瓊脂、甘露醇等，其作用在于提高培養(yǎng)基的滲透壓，減弱細(xì)胞新陳代謝，同時抑制細(xì)胞壁酶活性，減少營養(yǎng)物質(zhì)消耗從而使得組培苗生長緩慢[4]。此外，CCC（矮壯素）和ABA（脫落酸）、B9（丁酰肼）、PP333（多效唑）等植物生長延緩劑和抑制劑，也能夠有效抑制植物生長[5]。緩慢生長法離體保存技術(shù)目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用于馬鈴薯、繡線菊、黃菠蘿、黃精、蝴蝶蘭等[5]植物，但是在韭菜上的應(yīng)用還未見相關(guān)報道。筆者利用所在課題組已建立的韭菜組織培養(yǎng)技術(shù)，選取韭菜根尖作為外植體，通過調(diào)節(jié)山梨醇、蔗糖、瓊脂、CCC和ABA的濃度來探索適用于韭菜緩慢生長的最適條件，旨在為韭菜緩慢生長法離體保存技術(shù)的建立奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料及處理

試驗于2019年9月10日至2020年1月12日在河南省平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物實驗室進(jìn)行，試驗品種為航研998，是平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院培育的抗寒性品種。

將盆栽韭菜新發(fā)的整齊一致的根尖作為外植體，MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、pH值6為基本培養(yǎng)基，在溫度（25±2）℃、光暗周期14 h/10 h、光照度2500 lx的條件下進(jìn)行增殖擴(kuò)繁30 d，所得無菌苗供試驗所用。

1.2 試驗設(shè)計及方法

挑選長勢相近的韭菜組培苗根尖，剪取長0.5～1.0 cm作為外植體。以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1分別添加不同濃度的山梨醇、瓊脂、蔗糖、CCC和ABA保存組培苗作為不同處理，以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1+蔗糖10 g·L-1+瓊脂6 g·L-1，（適于韭菜正常生長的蔗糖和瓊脂含量）保存組培苗作為對照。每個處理接4瓶，每瓶接4株，設(shè)5次重復(fù)。在保存20、40、60、80、100、120 d時分別測定其不定芽數(shù)、株高及存活率。

接種在超凈工作臺（蘇凈安泰SW-CJ-1CU）上進(jìn)行，保存在平頂山市農(nóng)業(yè)科學(xué)院組培室，株高的測量用直尺在培養(yǎng)瓶外操作，避免污染。

1.2.1 不同質(zhì)量濃度山梨醇處理保存韭菜組培苗 以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、pH值6、瓊脂質(zhì)量濃度6 g·L-1、蔗糖質(zhì)量濃度10 g·L-1為基本培養(yǎng)基，分別添加0、10、20、30、50、70 g·L-1山梨醇，對韭菜組培苗進(jìn)行保存。

1.2.2 不同質(zhì)量濃度瓊脂處理保存韭菜組培苗

以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、pH值6、蔗糖質(zhì)量濃度10 g·L-1為基本培養(yǎng)基，分別添加4、6、10、14 g·L-1瓊脂，對韭菜組培苗進(jìn)行保存。

1.2.3 不同質(zhì)量濃度蔗糖處理保存韭菜組培苗

以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、pH值6、瓊脂質(zhì)量濃度6.0 g·L-1為基本培養(yǎng)基，分別添加10、30、50、70、90、120 g·L-1蔗糖，對韭菜組培苗進(jìn)行保存。

1.2.4 不同質(zhì)量濃度CCC處理保存韭菜組培苗 以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、pH值6、瓊脂質(zhì)量濃度6 g·L-1、蔗糖質(zhì)量濃度10 g·L-1為基本培養(yǎng)基，分別添加0、50、100、150、200、250、300 mg·L-1CCC，對韭菜組培苗進(jìn)行保存。

1.2.5 不同質(zhì)量濃度ABA處理保存韭菜組培苗

以MS+6-BA 0.5 mg·L-1+NAA 0.1 mg·L-1、pH值6、瓊脂質(zhì)量濃度6 g·L-1、蔗糖質(zhì)量濃度10 g·L-1為基本培養(yǎng)基，分別添加0、0.1、1.0、4.0、7.0、10.0 mg·L-1ABA，對韭菜組培苗進(jìn)行保存。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用Excel 2007處理試驗數(shù)據(jù)及作圖，采用SPSS 19進(jìn)行單因素顯著性方法分析，用Duncan檢驗法對顯著性進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同質(zhì)量濃度的山梨醇對韭菜保存的影響

不同質(zhì)量濃度的山梨醇影響下韭菜組培苗的生長趨勢如圖1所示。從中看出添加10 g·L-1的山梨醇的組培苗和對照組（0 g·L-1）相比較生長沒有受到抑制，反而得到一定程度的促進(jìn)。但是添加山梨醇質(zhì)量濃度20～70 g·L-1的組別，組培苗的株高隨著時間的增加增長非常緩慢，在同一保存時間株高遠(yuǎn)低于對照組，可見這幾組韭菜組培苗的生長均受到了抑制。

在添加不同濃度山梨醇的培養(yǎng)基上保存120 d后的生長狀況見表1。從中可以看出添加山梨醇質(zhì)量濃度30～70 g·L-1的組別，隨著質(zhì)量濃度的增加，組培苗的存活率有逐步下降趨勢，甚至添加山梨醇質(zhì)量濃度70 g·L-1培養(yǎng)120 d后組培苗大部分死亡或者休眠。而添加20 g·L-1山梨醇保存的組培苗在120 d后存活率是81.25%，相對不添加山梨醇的組（存活率86.25%）并沒有大幅度下降，而且此時組培苗的生長表現(xiàn)良好。且此濃度下，株高顯著低于0 g·L-1和10 g·L-1組。所以本試驗中最適宜韭菜保存的山梨醇質(zhì)量濃度是20 g·L-1。

2.2 不同質(zhì)量濃度的瓊脂對韭菜保存的影響

由圖2可知，隨著保存時間的增加，4組處理的組培苗株高增長趨勢沒有很大的區(qū)別。在保存時間相同時，添加瓊脂質(zhì)量濃度10 g·L-1和14 g·L-1處理株高低于4 g·L-1和6 g·L-1處理，但是差別不大。

從表2可以看出，不同條件保存120 d后的組培苗株高沒有明顯差距，株高最低組（瓊脂質(zhì)量濃度14 g·L-1）、最高組（瓊脂質(zhì)量濃度6 g·L-1）相比，平均株高僅少了1.29 cm。且除了瓊脂質(zhì)量濃度14 g·L-1組外，其他3組株高沒有顯著差異。從生長表現(xiàn)來看，這4組也基本沒有區(qū)別。

2.3 不同質(zhì)量濃度的蔗糖對韭菜保存的影響

從圖3可知，蔗糖質(zhì)量濃度30、50 g·L-1處理和對照組相比生長趨勢一致，同一時間株高沒有明顯的差別。蔗糖質(zhì)量濃度70、90和120 g·L-1處理的組培苗則生長非常緩慢，在保存時間相同時株高明顯低于對照組。

從表3可以看出，添加蔗糖質(zhì)量濃度30～70 g·L-1保存的組培苗120 d后的存活率與對照組相比沒有明顯下降，而90 g·L-1和120 g·L-1組與對照組相比，存活率和不定芽數(shù)均大幅下降。蔗糖質(zhì)量濃度120 g·L-1的條件下，存活率只有42.5%，而且組培苗大量休眠。本試驗中最適合韭菜保存的蔗糖質(zhì)量濃度是70 g·L-1，此質(zhì)量濃度下組培苗的株高顯著低于10～50 g·L-1處理。

2.4 不同質(zhì)量濃度的矮壯素（CCC）對韭菜保存的影響

由圖4可知，CCC質(zhì)量濃度50～150 mg·L-1處理和對照組相比生長趨勢一致，在培養(yǎng)時間相同時，株高略低于對照組，但差別不大。質(zhì)量濃度200 mg·L-1時，同一保存時間組培苗的株高則明顯低于對照。隨著CCC質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，250 mg·L-1和300 mg·L-1處理的株高和對照組相比有了更大幅度的下降，且兩者之間沒有明顯差異。

從表4可以看出，CCC質(zhì)量濃度50～250 mg·L-1的處理120 d后組培苗的存活率（80%～87.5%）和對照組（92.5%）相比均有所下降但幅度不大，而300 mg·L-1處理120 d后存活率只有37.5%，而且韭菜苗大部分休眠，葉片發(fā)黃。此外250 mg·L-1處理的株高與300 mg·L-1處理相比，差異不顯著，與其他處理相比均顯著下降。

2.5 不同質(zhì)量濃度的脫落酸（ABA）對韭菜保存的影響

由圖5可以看出，ABA質(zhì)量濃度0.1 mg·L-1處理和對照組相比生長趨勢一致，同一時間株高沒有明顯的差別。ABA質(zhì)量濃度1.0 ～7.0 mg·L-1處理和對照組相比生長明顯緩慢，同一時間的株高也明顯較低。

由表5可知，從生長表現(xiàn)來看，1.0 mg·L-1和4.0 mg·L-1組的韭菜組培苗長勢較好，葉綠。從120 d后組培苗的存活率來看，ABA質(zhì)量濃度0.1 mg·L-1（91.25%）和1.0 mg·L-1（82.5%）處理和對照組（87.5%）相比，沒有明顯差距。隨著ABA質(zhì)量濃度的進(jìn)一步增加，120 d后組培苗的存活率有所下降，4.0 mg·L-1處理的下降到65%，7.0 mg·L-1和10.0 mg·L-1處理的存活率則只有46.25%和42.5%。而且，ABA質(zhì)量濃度1.0 mg·L-1處理株高顯著低于0～0.1 mg·L-1處理。

3 討論與結(jié)論

利用培養(yǎng)基的高滲透壓抑制離體保存材料的生長，是植物離體保存的方法之一。通過添加蔗糖和甘露醇等滲透調(diào)節(jié)劑來提高培養(yǎng)基的滲透壓，可抑制培養(yǎng)材料對水分和營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。本試驗中，在基本培養(yǎng)中添加20 g·L-1的山梨醇能夠有效抑制韭菜組培苗的生長，保存120 d后韭菜苗的存活率達(dá)到81.25%。山梨醇濃度進(jìn)一步提高則會導(dǎo)致韭菜組培苗成活率大大下降。這與劉迎春[6]的山梨醇對馬鈴薯離體保存影響以及郭靜[7]對蜜瓜離體保存影響的研究結(jié)果一致。

瓊脂在培養(yǎng)基中的主要作用是提供支撐，同時也能夠調(diào)節(jié)滲透壓。培養(yǎng)基濃度過高會阻礙植株對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收。有研究表明，8～9 g·L-1的瓊脂可有效抑制獼猴桃的生長[8]，而本研究中4～14 g·L-1的瓊脂對韭菜組培苗的生長均沒有明顯的抑制作用，其他濃度對韭菜緩慢生長是否有效還需要進(jìn)一步探索。

蔗糖在組培苗的生長中具有雙重作用，既能提供碳源又可以調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的滲透壓。本研究中最適宜韭菜保存的蔗糖質(zhì)量濃度為70 g·L-1，該濃度下韭菜組培苗生長速度明顯緩慢，120 d后韭菜的存活率達(dá)86.25%，更高濃度時組培苗的成活率則逐步下降。這可能是因為培養(yǎng)基滲透壓升高，超出韭菜苗根尖承受限度，抑制其吸收水分和養(yǎng)分，從而使其生長受限。前人研究也有類似的結(jié)論，如蘭偉等[9]對紀(jì)伊潮野菊試管苗離體培養(yǎng)的研究中最合適的蔗糖質(zhì)量濃度是60 g·L-1。楊學(xué)成等[10]對黃菠蘿的離體保存中，最適的蔗糖質(zhì)量濃度是80 g·L-1。但也有報道認(rèn)為降低培養(yǎng)基中蔗糖濃度能夠有效減緩植株生長[11]。關(guān)于降低蔗糖濃度對韭菜種質(zhì)資源離體保存是否有效，還需要進(jìn)一步探索。

CCC是一種優(yōu)良的植物生長調(diào)節(jié)劑，可以抑制植物細(xì)胞伸長，但是不抑制細(xì)胞分裂，能使植株變矮，莖稈變粗，葉色變綠，作為生長延緩劑被廣泛應(yīng)用于種質(zhì)保存中。但是在不同供試材料中的效果有所差異。褚明宇等[12]在對葡萄試管苗進(jìn)行離體保存時，得出最適宜保存的CCC質(zhì)量濃度為200 mg·L-1，馬鈴薯種質(zhì)保存最適宜的CCC質(zhì)量濃度則為400 mg·L-1[13]。也有一些研究表明CCC對蜜瓜[7]和甜菜[14]緩慢生長沒有明顯作用。本研究中最合適的CCC質(zhì)量濃度為250 mg·L-1，此濃度下韭菜組培苗的生長明顯受到抑制且保存120 d后組培苗成活率達(dá)82.5%。

ABA是一種生長抑制劑，能夠抑制植物生長。因為供試材料不同，ABA在離體保存中所體現(xiàn)的效果及最適濃度也有很大區(qū)別。有研究表明3.0 mg·L-1的ABA在保存草莓時效果良好[15]，0.5～4.0 mg·L-1的ABA對紅根草的保存效果最好[16]。本研究中，最適宜對韭菜苗進(jìn)行離體保存的ABA質(zhì)量濃度是1.0 mg·L-1，這可能是由于供試材料的不同造成的。

值得注意的是，保證材料能夠恢復(fù)生長以及其遺傳性相對穩(wěn)定是植物種質(zhì)資源保存的前提。緩慢生長法在許多植物種質(zhì)資源的保存中能夠滿足這個要求，如蘭偉等[17]對那賀川野菊、陳輝等[18]對百合、葉秀仙等[19]對蝴蝶蘭的相關(guān)研究都驗證了這一點。但也有報道指出添加2.0 mg·L-1的ABA的培養(yǎng)基對半夏離體保存300 d后，進(jìn)行ISSR檢測出現(xiàn)了1條新的標(biāo)記和1條缺失的標(biāo)記;邵玲等[20]在對紫背天葵的離體保存研究中發(fā)現(xiàn)ABA能有效抑制植株的生長，在保存180 d后成活率達(dá)100%，但是在恢復(fù)培養(yǎng)基上再生試管苗形態(tài)纖弱，不利于其恢復(fù)生長[21]。關(guān)于緩慢生長法保存后的韭菜能否保持遺傳穩(wěn)定性還需要進(jìn)一步探索。

綜上所述，20 g·L-1的山梨醇、70 g·L-1的蔗糖、250 mg·L-1的CCC以及1.0 mg·L-1的ABA均能有效抑制韭菜組培苗的生長，且保存120 d后都有很高的存活率。常規(guī)組織培養(yǎng)條件下，韭菜的最佳繼代周期為30 d，當(dāng)繼代周期超過30 d后株叢會黃化、萎縮甚至死亡?？梢娞砑右欢舛鹊纳嚼娲肌⒄崽?、CCC和ABA培養(yǎng)可以大大延長組培苗的繼代周期，將其用于韭菜種質(zhì)資源保存具有一定的可行性。

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