甜瓜多種真菌病害拮抗細(xì)菌NBmelon-1的鑒定及其促生和生防效果

郝芳敏 臧全宇 馬二磊 丁偉紅 王毓洪 黃蕓萍

摘? ? 要：從甜瓜根部分離純化獲得一株多粘類芽孢桿菌NBmelon-1，探究其對(duì)甜瓜及甜瓜病害的影響。采用平板對(duì)峙法對(duì)拮抗菌株篩選鑒定，發(fā)現(xiàn)對(duì)甜瓜多種真菌病害的病原菌均有抑制作用，例如尖孢鐮刀菌甜瓜專化型（Fusarium oxysporum）、黑點(diǎn)根腐病菌（Monosporascus cannonballus）、蔓枯病菌（Didymalla bryoniae）、層生鐮刀菌（F. proliferatum）、亞洲鐮刀菌（F. asiaticum）和鏈格孢（Alternaria alternata）等;采用苗期灌根的方法，發(fā)現(xiàn)NBmelon-1對(duì)甜瓜幼苗的生長具有促生作用，甜瓜幼苗的莖粗、葉片大小、鮮質(zhì)量與對(duì)照相比均有顯著提高;盆栽實(shí)驗(yàn)表明，其對(duì)甜瓜枯萎病具有良好的生防潛力，相對(duì)防治效果為52.76%，可很好地防治甜瓜枯萎病。

關(guān)鍵詞：甜瓜;多粘類芽孢桿菌;NBmelon-1;甜瓜枯萎病;生防潛力

中圖分類號(hào)：S652? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A ? 文章編號(hào)：1673-2871（2021）07-014-06

Identification， biocontrol and growth promoting effects of antagonistic bacteria NBmelon-1 of various fungal diseases in melon

HAO Fangmin， ZANG Quanyu， MA Erlei， DING Weihong， WANG Yuhong， HUANG Yunping

（Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， Zhejiang， China）

Abstract： In this study， a strain of Paenibacillus polymyxa NBmelon-1 was isolated and purified from the diseased roots of melon， which has good inhibitory effect on the pathogen of various fungal diseases of melon， such as Fusarium oxysporum， Monosporascus cannonballus， Didymalla Bryoniae， F. proliferatum， F. asiaticum and Alternaria alternata， and showed strong antagonistic activity on the plate. Furthermore， NBmelon-1 could promote the growth of melon seedlings， and significantly increased the stem diameter， leaf size and fresh weight of melon seedlings compared with the control. In addition， pot experiment also showed that it had biocontrol potential to control the melon fusarium wilt， and the relative control effect was 52.76%.

Key words： Melon; Paenibacillus polymyxa; NBmelon-1; Fusarium wilt; Biocontrol potential

甜瓜（Cucumis melo）是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物、傳統(tǒng)的夏食水果之一，屬于葫蘆科黃瓜屬甜瓜種，是一年生草本植物[1]。但是在設(shè)施栽培中，甜瓜病害一直是生產(chǎn)上的難題，特別是尖孢鐮刀菌甜瓜專化型病菌（Fusarium oxysporum）引起的甜瓜枯萎病[2]、黑點(diǎn)根腐病菌（Monosporascus cannonballus）引起的甜瓜黑點(diǎn)根腐病[3]、蔓枯病菌（Didymalla bryoniae）引起的甜瓜蔓枯病[4]、亞洲鐮刀菌（F. asiaticum）引起的甜瓜果腐病[5]、層生鐮刀菌（F. proliferatum）引起的甜瓜根莖腐[6]及鏈格孢菌（Alternaria alternata）引起的甜瓜葉斑病[7]等。目前對(duì)于大棚甜瓜病害的防治，主要依賴于化學(xué)防治方法，但是長期使用農(nóng)藥，病原菌會(huì)產(chǎn)生耐藥性，以及造成環(huán)境污染和農(nóng)藥殘留等問題。因此需要一些對(duì)環(huán)境更為友好的替代防治措施，而生物防治就是其中之一。

多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）是一種革蘭氏陽性菌，一類對(duì)植物根部有益的細(xì)菌，對(duì)植物的生防和促生都有一定的作用[8]。近年來，關(guān)于多粘類芽孢桿菌用于植物生防和和促生方面的報(bào)道很多，例如王波等[9]從大豆中分離的一株內(nèi)生多粘類芽孢桿菌，對(duì)甘薯黑斑病具有很好的防治效果（達(dá)73.62%），顯著地抑制其分生孢子的萌發(fā)。張忠良等[10]從黃瓜分離的多粘類芽孢桿菌K18-5對(duì)黃瓜枯萎病有67.45%的防治效果;而且對(duì)黃瓜植株具有一定的促生作用，提高了葉綠素含量和根系活力;此外還能有效抑制黃瓜根際基質(zhì)中細(xì)菌和放線菌數(shù)量。祝久香[11]分離的多粘類芽孢桿菌HX-140可分泌蛋白酶、纖維素酶、β-1-3-葡聚糖酶和揮發(fā)性抑菌氣體，對(duì)黃瓜枯萎病有55.56%的防病效果。

筆者在分離甜瓜根部病害時(shí)分離到一株多粘類芽孢桿菌NBmelon-1，對(duì)甜瓜多種病原菌均有抑制作用，平板拮抗活性很強(qiáng)，于是進(jìn)一步測定了NBmelon-1對(duì)甜瓜幼苗的促生作用及甜瓜枯萎病防治效果，以期為甜瓜病害生防菌劑的開發(fā)應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為甜瓜病害的綠色防控提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 供試菌株和培養(yǎng)基

供試病原菌：有尖孢鐮刀菌甜瓜專化型（F. oxysporum）TG-5、層生鐮刀菌（F. proliferatum）Fp-1、黑點(diǎn)根腐病菌（M. cannonballus）Mc-30、蔓枯病菌（D. bryoniae）MF-17和鏈格孢（A. alternata）Aa-1等5種，均由筆者實(shí)驗(yàn)室分離獲得，在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行活化，作為供試菌株。細(xì)菌NBmelon-1，在發(fā)病的甜瓜根部上分離獲得，采用NA培養(yǎng)基培養(yǎng)。供試甜瓜品種為厚皮甜瓜甬甜5號(hào)，由寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院提供。所有試驗(yàn)在寧波市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院瓜菜重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和寧波市高新農(nóng)業(yè)技術(shù)實(shí)驗(yàn)園區(qū)完成，田間實(shí)驗(yàn)于2020年9月完成。

NA培養(yǎng)基：牛肉浸膏 10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL，pH 7.0。

NB培養(yǎng)基：牛肉浸膏 10 g、蛋白胨5 g、葡萄糖20 g、水1000 mL，pH 7.0。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂15 g、水1000 mL。

1.2 NBmelon-1的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

對(duì)拮抗細(xì)菌的分子鑒定，采用50 μL的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行16S rDNA的擴(kuò)增、測序及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析。拮抗細(xì)菌的基因組DNA用全式金細(xì)菌基因組試劑盒提取（EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit）。擴(kuò)增菌株的16S rDNA，采用細(xì)菌通用引物（27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3;1492R：5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3）進(jìn)行擴(kuò)增[12]，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳法檢測，對(duì)陽性PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化、克隆和測序[13]。

將測得的16S rDNA序列在NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）上進(jìn)行核酸比對(duì)，利用軟件MEGA7.0[14]進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建，明確拮抗菌的分類地位。

1.3 NBmelon-1對(duì)不同病原菌的平板拮抗作用

采用平板對(duì)峙法進(jìn)行防病拮抗菌株的篩選，在PDA培養(yǎng)基上活化尖孢鐮刀菌甜瓜?；途闠G-5、層生鐮刀菌菌株Fp-1、黑點(diǎn)根腐病菌菌株MC-30、蔓枯病菌菌株MF-17和鏈格孢菌菌株Aa-1等5種病原菌，用直徑5 mm的打孔器在新鮮的菌落邊緣打孔，挑取新鮮菌絲塊接種在距新的PDA平板一端1.5 cm處，用接種環(huán)挑取少量新鮮NBmelon-1菌液，于PDA培養(yǎng)基的另一端劃線，劃線處距PDA端部距離為2 cm，封口膜封好后置于25 ℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，10 d之后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，每個(gè)菌株3個(gè)皿，對(duì)照只接病原菌，不接NBmelon-1[15]。

1.4 甜瓜種子發(fā)芽率的促生試驗(yàn)

將上述拮抗細(xì)菌接種到NB培養(yǎng)基中，在搖床上搖培24 h，配置成拮抗細(xì)菌懸浮液。挑取健康飽滿的甜瓜種子，用50 ℃溫水進(jìn)行浸種30 min，待冷卻后分別浸在拮抗細(xì)菌的懸浮液中2 h，用NB作對(duì)照，每個(gè)處理100粒種子，3次重復(fù)，用擰干水的干凈毛巾包好，置于30 ℃條件下催芽36 h，調(diào)查發(fā)芽率[16]，采用t測驗(yàn)（p < 0.01）分析差異顯著性。

1.5 甜瓜幼苗的促生試驗(yàn)

在溫室大棚中，利用盆栽試驗(yàn)進(jìn)行拮抗細(xì)菌對(duì)甜瓜幼苗的促生試驗(yàn)，在甜瓜種子播種7 d和9 d后，用移液器將拮抗細(xì)菌配置的108 cfu·mL-1懸浮液對(duì)甜瓜幼苗進(jìn)行灌根，每株幼苗用1 mL菌液處理，共計(jì)150株，NB培養(yǎng)基處理做對(duì)照。15 d后，拔出完整的甜瓜幼苗，每個(gè)處理取30株幼苗，只保留地上部分，測量幼苗的莖粗，每株幼苗中最大一片真葉的長、寬及鮮質(zhì)量，統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)[17] ，采用t測驗(yàn)（p < 0.01）分析差異顯著性。

1.6 對(duì)甜瓜枯萎病的盆栽生防作用

試驗(yàn)分為空白對(duì)照CK和處理。

NBmelon-1處理：在甜瓜播種7 d、9 d，用108 cfu·mL-1的NBmelon-1菌懸液對(duì)甜瓜幼苗進(jìn)行灌根，每棵幼苗用1 mL菌液處理。每個(gè)處理1個(gè)穴盤，每穴盤50株，設(shè)3次重復(fù)。

甜瓜枯萎病接種：甜瓜品種為對(duì)甜瓜枯萎病感病品種，在2葉1心時(shí)，以50株幼苗為1組，3次重復(fù)，左邊一半接種，右邊一半不接種。將幼苗從穴盤中取出，輕度損傷根系，洗凈根部，在4×106個(gè)·mL-1的枯萎病菌孢子液中浸根15 min，根系全部浸入，中間搖動(dòng)2次，不接種的在清水中浸根15 min。再移栽至營養(yǎng)土中，接種后前3 d遮陰，溫度保持在25 ℃，3 d緩苗后撤掉遮陽網(wǎng)，在溫室正常管理，15 d后調(diào)查發(fā)病情況[18]。鑒定標(biāo)準(zhǔn)：整株無病癥為0級(jí);晴天中午子葉萎蔫或部分子葉、 真葉輕微萎蔫為1級(jí);1片真葉萎蔫或子葉較重萎蔫為2級(jí);子葉及真葉萎蔫， 阻礙發(fā)育為3級(jí);整株萎蒸，60%以上枯死， 心葉成活為4級(jí);整株嚴(yán)重萎蔫并枯死為5級(jí)[19]。病情指數(shù)=∑（級(jí)數(shù)×該級(jí)株數(shù)）/（總株數(shù)×最高級(jí)數(shù)）×100，相對(duì)防治效果/%=（對(duì)照病情指數(shù)-處理病情指數(shù)）/對(duì)照病情指數(shù)×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 NBmelon-1的的分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹分析

以菌株NBmelon-1的基因組DNA為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物1492r/27f進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化、測序后，序列為1517 bp，將測序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行BLAST比對(duì)，結(jié)果表明與菌株多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）YC0136（ITS，GenBank Acc. CP017967.3）的同源性最高，為99.54%。利用MEGA7對(duì)測序獲得的序列和其他相近的序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，結(jié)果表明，菌株NBmelon-1與菌株聚為一支（圖1），所以認(rèn)為NBmelon-1屬于多粘類芽孢桿菌（P. polymyxa）。

2.2 NBmelon-1對(duì)不同病原菌的平板拮抗作用

利用平板對(duì)峙法進(jìn)行NBmelon-1對(duì)不同病原菌的平板拮抗試驗(yàn)，在對(duì)峙培養(yǎng)10 d后，可以看到NBmelon-1對(duì)尖孢鐮刀菌甜瓜?；停‵. oxysporum）TG-5、層生鐮刀菌（F. proliferatum）Fp-1、黑點(diǎn)根腐病菌（M. cannonballus）MC-30、蔓枯病菌（D. bryoniae）MF-17和鏈格孢（A. alternata）Aa-1等病原菌的生長均有一定的抑制作用，在對(duì)峙培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)皿中均出現(xiàn)了明顯的拮抗帶，后期對(duì)峙的病原菌也無法再生長（圖2）。

2.3 甜瓜種子發(fā)芽率的促生試驗(yàn)

用NBmelon-1的菌懸液處理的甜瓜種子，在催芽36 h后，發(fā)芽率為92%，與對(duì)照的90%無明顯差異，但是NBmelon-1處理的種子胚芽的長度為13 mm，相對(duì)于對(duì)照胚芽的19.3 mm明顯降低，表明NBmelon-1對(duì)種子出芽率無明顯差別，但是可抑制胚芽的生長（圖3）。

2.4 甜瓜幼苗的促生試驗(yàn)

在甜瓜種子播下7 d和9 d，用NBmelon-1的菌懸液在甜瓜根部進(jìn)行灌根，每次灌根1 mL，在15 d時(shí)，對(duì)甜瓜幼苗的地上部分進(jìn)行測量統(tǒng)計(jì)，可以看到用NBmelon-1菌懸液處理的甜瓜幼苗，在莖粗、鮮質(zhì)量及最大一片真葉的長和寬，都有顯著升高，表明NBmelon-1對(duì)甜瓜幼苗有一定的促生作用（圖4）。

2.5 對(duì)甜瓜枯萎病的盆栽生防作用

在甜瓜枯萎病菌接種15 d后進(jìn)行調(diào)查統(tǒng)計(jì)，用NBmelon-1預(yù)處理的甜瓜病情指數(shù)為45，而對(duì)照的病情指數(shù)為95.26（圖5），用NBmelon-1預(yù)處理相對(duì)防治效果為52.76%（表1），表明NBmelon-1對(duì)甜瓜枯萎病具有一定的生防作用。

3 討論與結(jié)論

尖孢鐮刀菌甜瓜?；筒【‵usarium oxysporum）引起的甜瓜枯萎病、黑點(diǎn)根腐病菌（M. cannonballus）引起的甜瓜黑點(diǎn)根腐病、蔓枯病菌（D. bryoniae）引起的甜瓜蔓枯病、亞洲鐮刀菌（F. asiaticum）引起的甜瓜果腐病、層生鐮刀菌（F. proliferatum）引起的甜瓜根莖腐、鏈格孢菌（A. alternata）引起的甜瓜葉斑病、茄病鐮刀菌（F. solani）引起的甜瓜根腐病[2-7， 20]等真菌病害，制約著甜瓜的健康生長，嚴(yán)重時(shí)造成毀滅性的損失，而隨著甜瓜病害綠色防控技術(shù)生產(chǎn)體系的提出和完善，甜瓜生物防治受到各方面的關(guān)注。

陸淼等[21]報(bào)道哈茨木霉菌可明顯抑制甜瓜蔓枯病病原菌的生長，而且對(duì)甜瓜幼苗的生長具有明顯的促生作用。汪軍等[22]報(bào)道枯草芽孢桿菌在田間對(duì)甜瓜白粉病具有很好的防效，對(duì)甜瓜植株的生長和果實(shí)糖度的積累都有很好的促進(jìn)作用。王雅雅等[23]報(bào)道解淀粉芽孢桿菌對(duì)甜瓜葉枯病病原菌具有高效拮抗作用，通過盆栽試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)對(duì)甜瓜葉枯病具有很好的生防潛力。吳麗媛[24]報(bào)道枯草芽孢桿菌BW-6對(duì)甜瓜細(xì)菌性果斑病具有80.3%的防效，可在甜瓜葉面上大量定殖。鄒立飛等[25]報(bào)道甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌對(duì)甜瓜枯萎病的防治效果較好和對(duì)甜瓜種子發(fā)芽率的提高具有促進(jìn)作用。王杏芹等[26]報(bào)道多粘類芽孢桿菌G-14對(duì)3種甜瓜細(xì)菌性病原菌具有明顯的拮抗作用。

筆者對(duì)發(fā)病甜瓜根部分離的拮抗細(xì)菌NBmelon-1，基于16S rDNA序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，鑒定為多粘類芽孢桿菌。NBmelon-1不僅可以促進(jìn)甜瓜幼苗的生長，而且對(duì)甜瓜枯萎病、甜瓜黑點(diǎn)根腐病、甜瓜蔓枯病、甜瓜果腐病等真菌病害具有很強(qiáng)的拮抗活性。在盆栽實(shí)驗(yàn)中對(duì)甜瓜枯萎病具有很好的生防效果，為甜瓜枯萎病的防治探索了一條可能的生物防治途徑。目前，還未在田間進(jìn)行試驗(yàn)，有待進(jìn)一步驗(yàn)證拮抗細(xì)菌NBmelon-1的生防效果，但為開發(fā)微生物菌劑提供了很好的基礎(chǔ)。

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