斑花黃堇和條裂黃堇不同采集地區(qū)和部位的紅外指紋圖譜與特征分析

杜 清馬 琴郭蘇城 劉明地 吳 江 候永強(qiáng) 江 才趙 偉任 卓

（1.青海民族大學(xué)藥學(xué)院，青海省青藏高原植物資源化學(xué)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧810007； 2.青海民族大學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備管理中心，青海 西寧810007； 3.青海民族大學(xué)生態(tài)環(huán)境與資源學(xué)院，青海 西寧810007；4.青海民族大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，青海 西寧810007）

斑花黃堇Corydalis conspersaMaxim.為罌粟科紫堇屬多年生草本植物，產(chǎn)于甘肅西南部、青海中南部、四川西北及西部地區(qū)和西藏東部、中部等地，生于海拔3 800～5 700 m的多石河岸和高山礫石地［1］，始載于《西藏植物名錄》［2］，又名廣布紫堇［3］、密花黃堇［4］，藏語為“丁冬歐薷”，藏醫(yī)全草作為“當(dāng)日絲哇”使用［5］?！毒е楸静荨?記載全草具有止渴、清熱、治瘟病、各種熱病和火燒傷，并可治膽病，是重要的寒性藏藥材［6］。條裂黃堇CorydalislinarioidesMaxim.，產(chǎn)陜西、寧夏、甘肅、青海、四川、西藏，生于海拔2 100～4 700 m 的林下、林緣、灌叢下、草坡或石縫中［1］，又名銅棒錘（《陜西中草藥》［7］、銅錘紫堇（《秦嶺植物志》［8］）、藏藥名甲打色爾娃［9］，藏醫(yī)全草作為加達(dá)絲哇使用［5］，用于治療胃病、腸炎、潰瘍、肺癆、咳喘、傷寒、跌打損傷、筋骨痛、流行性感冒、坐骨神經(jīng)痛、燒傷及各種傳染病引起的血熱癥。確生等［10］對(duì)青海省斑花黃堇資源進(jìn)行調(diào)查，并對(duì)其空間分布進(jìn)行定量分析。

當(dāng)前斑花黃堇在藏藥部頒標(biāo)準(zhǔn)、藏藥標(biāo)準(zhǔn)中有收載，40 多部藏醫(yī)藥經(jīng)典中有記載，主要用作十八味黨參丸、十味德哇散、三味群臣民散、十五味黑藥肉毒方、七味瘟疫散、大紅黑鵬丸、仁青常覺、色保芒宗等方劑的原料，其需求量大［10］。條裂黃堇味辛微苦，性平，有毒，兩者在藏醫(yī)中雖都作為“絲哇”類藥材使用，但在《藏藥志》 和古籍記載中與斑花黃堇性味功效差異較大［11］，而且兩者從原植物形態(tài)特征有顯著的區(qū)別，未見混淆使用的報(bào)道，需在今后詳細(xì)研究2個(gè)品種不同功效的應(yīng)用。研究中對(duì)2017年夏秋季節(jié)采集的斑花黃堇和條裂黃堇原植物和藥材性狀鑒定，應(yīng)用紅外光譜進(jìn)行主成分和相關(guān)系數(shù)分析［12］，以期為斑花黃堇和條裂黃堇原植物、藥材的識(shí)別、合理應(yīng)用和資源保護(hù)提供參考。

1 材料

IRPrestige21 傅立葉變換紅外光譜儀（日本島津公司）；YP?2 壓片機(jī)（上海山岳科學(xué)儀器公司）；通風(fēng)干燥箱（蘇州貫覺電熱設(shè)備有限公司）；干燥器（無錫德凡儀器有限公司）；瑪瑙研缽及研杵（日本島津公司）；電子天平（德國(guó)賽多利斯公司）。蘆丁對(duì)照品（純度≥98%，上海源葉生物科技有限公司）；無水乙醇（分析純）、溴化鉀（光譜級(jí)，天津市博迪化工有限公司）。

藥材于2017年8 月采于青海省海南州貴德縣拉脊山、黃南州河南縣托葉瑪鄉(xiāng)吉崗山、海北藏族自治州祁連縣峨堡鄉(xiāng)祁連山和玉樹藏族自治州囊謙縣著曉鄉(xiāng)香龍峽谷山，經(jīng)林鵬程教授、作者和原藥材采集者對(duì)照標(biāo)本及《中國(guó)植物志》 《青海植物志》 資料，確定為斑花黃堇和條裂黃堇，將新鮮植物樣品各個(gè)部位清洗干凈后，分成根、莖、葉、花各個(gè)部位，陰干，粉碎后過200 目篩備用。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品信息 斑花黃堇（BHHJ）及條裂黃堇（TLHJ）樣品信息見表1。

表1 斑花黃堇（BHHJ） 及條裂黃堇（TLHJ） 樣品信息

2.2 斑花黃堇及條裂黃堇的藥材特征

2.2.1 斑花黃堇根性狀 根莖短，簇生棒狀肉質(zhì)須根，表面暗黃棕色。皺縮，具3～4 縱棱，質(zhì)較硬，有柔性，斷面較平整，具粉性，淡黃白色，中心木質(zhì)部環(huán)狀，顏色較深［4?6］。

2.2.2 條裂黃堇根性狀 參考文獻(xiàn)［9］，根紡錘形，表面暗黃棕色至黃褐色，皺縮，具縱棱，質(zhì)較硬，斷面較平整，具粉性，黃白色，中心木質(zhì)部色較深。

2.3 條裂黃堇藥材顯微鑒別 參考文獻(xiàn)［9］，根橫切面呈多棱圓形。木栓細(xì)胞數(shù)列，扁長(zhǎng)形，切向延長(zhǎng)，壁略呈波狀；栓內(nèi)層為長(zhǎng)橢圓形薄壁細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)含極少量淀粉粒。韌皮部寬廣，薄壁細(xì)胞充滿淀粉粒，木質(zhì)部小，由導(dǎo)管、木薄壁細(xì)胞組成，中心無髓［4?6］。

2.4 溴化鉀和2種樣品紅外薄片制備

2.4.1 溴化鉀和樣品干燥 先分別精密稱取1.670 0 g KBr、樣品粉末0.100 0 g，按2015年版《中國(guó)藥典》 中水分測(cè)定的方法，在105 ℃干燥3～4 h 至恒定質(zhì)量。

2.4.2 空白KBr 紅外薄片制備 取約200 mg 空白KBr 于瑪瑙研缽中在紅外烘燈下邊烘邊研磨。取出模具，準(zhǔn)確套上模膛，放好墊片，將制好的樣品均勻的抖入模膛內(nèi)，裝好模具后，將模具放在壓片機(jī)上，在低真空下用9.81 GPa 的壓力，經(jīng)1～2 min 壓成KBr 透明薄片，將其放在干燥器中待掃描檢測(cè)。

2.4.3 紅外樣品制備 采用2種方法制備紅外樣品，第一種取1～2 mg 樣品粉末，第二種稱取樣品粉末各0.01 g 后放入無水乙醇0.1 mL 充分研磨并浸漬提取上清液，將以上樣品粉末和樣品提取上清液，各加入150 mg KBr 于瑪瑙研缽中研磨后揮干無水乙醇，按照對(duì)照品制備的方法壓制成KBr透明樣品薄片，保存在干燥器中待干燥后掃描檢測(cè)。

2.5 紅外檢測(cè)條件 室溫（21±5）℃左右，濕度≤65%即可開機(jī)，打開電腦，打開儀器操作軟件IRsolution 快捷鍵，運(yùn)行“采集→實(shí)驗(yàn)設(shè)置”菜單，測(cè)量方式選擇透光率，設(shè)置掃描次數(shù)18 次，以其平均值作為樣品紅外信號(hào)數(shù)據(jù)，分辨率4 cm－1，掃描范圍4 000～400 cm－1，掃描速度2.8 mm·sec－1，輸入文件名，保存為參數(shù)文件。

2.6 紅外光譜檢測(cè)及保存 將以上制備好的空白KBr 及樣品薄片，于紅外分光光度計(jì)4 000～400 cm－1掃描測(cè)定，以其平均值作為樣品紅外信號(hào)數(shù)據(jù)。輸入文件名儲(chǔ)存譜圖，對(duì)光譜圖進(jìn)行峰值檢測(cè)、基線校正及譜圖檢索并打印。

2.7 數(shù)據(jù)處理分析方法 應(yīng)用島津IRPrestige21 紅外光譜儀的數(shù)據(jù)分析軟件IRsolution Chinese 進(jìn)行紅外光譜、共有模式峰標(biāo)識(shí)及二階導(dǎo)數(shù)處理；應(yīng)用SPSS 20.0 軟件統(tǒng)計(jì)各樣品的相關(guān)系數(shù)和主成分特征情況。

2.8 紅外光譜特征及結(jié)果分析

2.8.1 不同部位紅外光譜特征圖1 可知，紅外光譜圖中峰形狀、峰位置均比較相似。參考文獻(xiàn)［13?18］，對(duì)圖2中主要的紅外吸收峰進(jìn)行指認(rèn)和歸屬，見表2。3 572、3 549、3 525、3 502、3 491、3 468、3 448、3 406、3 390、3 360、3 224、3 028、3 024 cm－1為羥基O?H 伸縮振動(dòng)吸收峰；2 916、2 850 cm－1為亞甲基C?H 反對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰；1 747、1 735、1 701 cm－1為C＝O 伸縮振動(dòng)峰，可能為酮酯類成分；1 635、1 631、1 627 cm－1為黃酮類成分的共軛羰基的伸縮振動(dòng)；1 539、1 508、1 496 cm－1為芳香族化合物中苯環(huán)骨架伸縮振動(dòng)吸收峰；1 458、1 435、1 431 cm－1為?OH伸縮振動(dòng)吸收峰；1 373、1 369、1 319、1 315 cm－1為甲基的彎曲振動(dòng)吸收峰；1 292、1 242、1 238 cm－1為酮的面內(nèi)搖擺、酯類C?O?C 的伸縮振動(dòng)峰和醚鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 153、1 045、1 022 cm－1為糖苷類的C?O 的伸縮振動(dòng)吸收峰；1 014 cm－1為鄰位羥基C?O 鍵吸收峰；991、983 cm－1為糖環(huán)的振動(dòng)吸收峰；808、771、763 cm－1為苯環(huán)取代C?H 面外彎曲振動(dòng)吸收峰。以上的光譜特征綜合反映出斑花黃堇中可能含有黃酮、生物堿、多糖及苷、酯類、芳香類等化學(xué)成分，與文獻(xiàn)［18］中的結(jié)論部分是一致的，蘆丁分子主要官能團(tuán)紅外吸收峰［13?14］分別為羰基υC＝O1 656.85 cm－1；苯環(huán)骨架 振動(dòng)頻率υC＝C1 600.92 cm－1，1 571.99 cm－1，1 504.48 cm－1，1 454.33 cm－1；羥 基υ?OH3 390.86 cm－1，由此表明斑花黃堇中會(huì)含有蘆丁、5?羥基?7?甲氧基黃烷酮、2′，4′?二羥基雙氫查耳酮等黃酮類成分［19?21］。同為罌粟科紫堇屬植物，表明斑花黃堇和條裂黃堇根莖中的化學(xué)成分相近或相同，查閱研究文獻(xiàn)，條裂黃堇還未有該方面的研究報(bào)道，故當(dāng)前從原植物和藥材性狀、顯微特征予以區(qū)別，今后通過傳統(tǒng)化學(xué)成分分離和定性定量方法更進(jìn)一步區(qū)分和鑒別二者。

表2 青海海南州采集的斑花黃堇和條裂黃堇藥材粉末樣品主要紅外吸收峰及其指認(rèn)辨別

圖1 各樣品紅外光譜圖

2.8.2 紅外光譜特征及共有峰情況 由圖2 可知，青海海南州采集的斑花黃堇根、莖、葉和花的紅外光譜圖峰形狀、峰位置均比較相似，但吸收峰的相對(duì)強(qiáng)度有差異。根據(jù)圖2～3 中的峰位和紅外光譜數(shù)據(jù)，可看出主要的紅外吸收峰相似或相近，可明確斑花黃堇和條裂黃堇中的共有峰有13個(gè)，主要在3 600～3 000 cm－1，2 916～2 850 cm－1，1 747，1 627，1 496，1 431，1 369，1 315，1 238，1 045，1 014，960，771 cm－1附近都有吸收峰。

圖2 斑花黃堇莖、花、根、葉粉末紅外光譜圖

2.8.3 17 批樣品紅外光譜測(cè)定分析 由圖3 可知，17 批斑花黃堇和條裂黃堇不同組織粉末樣品均在3 600～3 000 cm－1，2 916～2 850 cm－1，1 627，1 496，1 431，1 369，1 315，1 242，1 045，960，864，771 cm－1附近都有吸收峰，表明斑花黃堇和條裂黃堇均含有具有特征峰的黃酮、多糖及苷、酯類、芳香類等化學(xué)成分。

圖3 17 批不同組織樣品紅外光譜圖

2.8.4 17 批樣品紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)分析 紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)能有效提高紅外譜圖的分辨率，吸收峰的尖銳程度增大，帶寬減少，擴(kuò)大譜圖間的差異。圖4 是17 批樣品紅外光譜的二階導(dǎo)數(shù)全圖。從圖中可以看出，5號(hào)（吉崗山的根）、8號(hào)（吉崗山的花）圖譜峰數(shù)量偏少且峰強(qiáng)度偏弱，表明某些成分含量偏低或很少。6號(hào)（吉崗山的莖）、7號(hào)（吉崗山的葉）圖譜峰數(shù)量偏多且峰強(qiáng)度較強(qiáng)，尤其是1 530～1 400 cm－1附近有較強(qiáng)的吸收峰，表明吉崗山莖葉中含有帶羥基的芳香族或木質(zhì)素類，也可能是黃酮類化合物。該方面需要結(jié)合藥材生長(zhǎng)的生態(tài)環(huán)境以及生長(zhǎng)的年限等情況具體分析，其他樣品二階導(dǎo)數(shù)圖譜峰數(shù)量差別不大，但峰強(qiáng)度有一定差別。

圖4 17 批樣品紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖譜

2.8.5 無水乙醇處理后紅外圖譜比較分析 由圖1、4～6，用IR solution 軟件，分析無水乙醇處理斑花黃堇（12～15號(hào)）和條裂黃堇（16～17號(hào)）粉末前后的紅外光譜圖譜和紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)圖譜［22］，發(fā)現(xiàn)無水乙醇處理后的樣品圖譜3 600～3 000 cm－1和1800～800 cm－1的峰強(qiáng)度下降，峰數(shù)目減少，尤其3 600～3 000 cm－1間的峰振動(dòng)減少，表明無水乙醇處理后?OH 鍵可能斷裂，且芳香族化合物1 600～1 450 cm－1、1 000～750 cm－1間的特征峰也減少且減弱，表明無水乙醇處理后，斑花黃堇（12～15號(hào)）和條裂黃堇（16～17號(hào)）粉末的原來各種成分含量和比例都產(chǎn)生了相應(yīng)變化。

圖5 各樣品粉末無水乙醇處理前后紅外光譜圖譜

圖6 各樣品粉末無水乙醇處理前后紅外光譜二階導(dǎo)數(shù)

2.8.6 紅外圖譜的相關(guān)系數(shù) 以表1 中樣品1 為藥材的參照?qǐng)D譜，在波數(shù)4 000～400 cm－1計(jì)算17 批藥材粉末樣品紅外光譜圖中各點(diǎn)吸光度的相關(guān)系數(shù)分別為1、0.962 4、0.967 9、0.996 6、0.913 4、0.961 4、0.990 4、0.668 0、0.985 7、0.984 9、0.965 6、0.996 8、0.980 5、0.996 8、0.878 7、0.996 9、0.996 5?？芍?，17個(gè)斑花黃堇和條裂黃堇樣品的紅外光譜相關(guān)系數(shù)在0.668 0～0.996 9 之間，1號(hào)、5號(hào)和9號(hào)為斑花黃堇不同采集地區(qū)的根，8號(hào)和15號(hào)為斑花黃堇不同采集地區(qū)的花，與1號(hào)根部的相關(guān)系數(shù)較低，表明不同采集地區(qū)的根部和花部藥材中的主要成分有一定的差異性。而其他采集地區(qū)和采集部位的紅外光譜相關(guān)系數(shù)在0.96 以上，表明其化學(xué)成分相似。

2.8.7 主成分分析特征 選擇斑花黃堇和條裂黃堇紅外指紋圖譜中的13個(gè)共有峰及其透光率值，通過SPSS 20.0 軟件進(jìn)行主成分和因子分析，并做成分特征值的碎石圖和得分圖，結(jié)果見圖7～8，由圖7 可知成分1 和成分2 為2個(gè)主成分，2個(gè)成分的積累貢獻(xiàn)率為96.5%，由成分得分系數(shù)矩陣，可知主成分的紅外波數(shù)特征在3 448，3 406，1 627 cm－1，與黃酮類及含有羰基、羥基基團(tuán)結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分特征相符合。從圖8 可看出17 批樣品中所含有的2個(gè)特征性成分，其中主成分1 的特征吸收峰在2 916～2 850 cm－1，1 747，1 627，1 496，1 431，1 369，1 315，1 238，1 045，1 014，960，771 cm－1附近都有吸收峰；主成分2 的特征吸收峰在3 600～3 000 cm－1之間。

圖7 17 批樣品主成分特征值的碎石圖

圖8 17 批樣品主成分得分圖

2.8.8 主成分散點(diǎn)圖 將斑花黃堇和條裂黃堇紅外指紋圖譜中的13個(gè)共有峰及其透光率值，通過SPSS 20.0 軟件構(gòu)建主成分散點(diǎn)圖，見圖9。

由圖9 中可得出不同采集地區(qū)斑花黃堇和條裂黃堇根、莖、葉、花各個(gè)組織中的2種特征性成分的分布情況，其中玉樹州囊謙縣采集的斑花黃堇樣品（樣品12～15號(hào)）含有的2 類特征性成分，黃南州采集的斑花黃堇含有1 和2 類特征性成分（樣品5號(hào)），海南州和海北州采集的斑花黃堇和黃南州采集的條裂黃堇樣品中主要含有1 類特征性成分。

圖9 17 批不同樣品2個(gè)主成分分布散點(diǎn)圖

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究了17 批采集不同產(chǎn)地和不同組織部位的斑花黃堇和條裂黃堇的原植物、藥材性狀鑒定以及紅外光譜特征，在樣品采集和處理中細(xì)致地清洗各個(gè)組織部位的泥沙等雜質(zhì)，保證各個(gè)藥用部位的獨(dú)立和干凈，消除植物來源的背景和干擾。

斑花黃堇葉片輪廓長(zhǎng)圓形，二回羽狀全裂，小裂片條形或長(zhǎng)橢圓形，灰綠色；而條裂黃堇葉片羽狀全裂，裂片長(zhǎng)條形，從植物形態(tài)有明顯的區(qū)別。應(yīng)用紅外光譜儀檢測(cè)藥材中的光譜峰并鑒別特征區(qū)（3 600～1 500 cm－1）和指紋區(qū)（1 500～700 cm－1）［23］，鑒定了13個(gè)共有特征峰并比較其二階導(dǎo)數(shù)的光譜特征，不同地區(qū)特征峰的強(qiáng)度及相關(guān)系數(shù)不同，尤其是不同部位，根和花中相關(guān)系數(shù)低，表明其特征性化學(xué)成分性質(zhì)或含量有差異，而無水乙醇處理藥材粉末后，紅外光譜中峰強(qiáng)度下降，峰數(shù)目減少，表明化學(xué)成分有變化，也可能是無水乙醇提取出的化學(xué)成分有限，只鑒定了藥材中的部分成分。

采集的均是斑花黃堇和條裂黃堇的野生植物，因各個(gè)采集地區(qū)的生態(tài)環(huán)境不同也會(huì)影響藥材中有效成分的含量和質(zhì)量，青海省各個(gè)野生采集地區(qū)的平均海拔在3 500 m 以上，地形復(fù)雜，主要有高寒性氣候、高原大陸性氣候、日照長(zhǎng)且多，太陽輻射強(qiáng)，光能豐富，有利于植物的生長(zhǎng)和發(fā)育，不同采集地區(qū)和組織部位的藥材紅外指紋圖譜總體相似度很高，但含量有差異，尤其是根和花、莖、葉之間，表明化學(xué)成分受氣候條件與生長(zhǎng)環(huán)境的影響，研究中通過紅外光譜指紋圖譜結(jié)合統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，以期為今后更加深入鑒別斑花黃堇和條裂黃堇的異同、真?zhèn)魏推焚|(zhì)評(píng)價(jià)提供快速、有效的方法和參考依據(jù)。