益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷體外對(duì)CTLA?4 介導(dǎo)的肺癌免疫逃逸的影響

姜 怡 蔡雨晴 張 朋沈麗萍劉苓霜*劉嘉湘

（1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海200032； 2.上海中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，上海200120）

在我國(guó)，肺癌發(fā)病率和死亡率均居惡性腫瘤首位［1］，嚴(yán)重危害人類健康。忽視機(jī)體免疫系統(tǒng)在肺癌發(fā)生發(fā)展中的重要作用是阻礙臨床療效提高的重要原因之一。細(xì)胞毒T 淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4（cytotoxic T lymphocyte?associated antigen?4，CTLA?4）是介導(dǎo)腫瘤免疫逃逸的重要抑制性分子，主要表達(dá)在活化的CD4＋和CD8＋T細(xì)胞表面，組成性地表達(dá)于調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）表面，與CD28 競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合抗原提呈細(xì)胞表面的B7分子發(fā)揮免疫抑制作用，且CTLA?4 與B7分子的親和力高于CD28［2?3］?？扇苄訡TLA?4（soluble CTLA?4，sCTLA?4）存在于外周循環(huán)中，與淋巴細(xì)胞表面的膜型CTLA?4（membrane?bound CTLA?4，mCTLA?4）具有相同的生物學(xué)效應(yīng)。

國(guó)醫(yī)大師劉嘉湘教授創(chuàng)立的“扶正治癌”學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)肺癌治療取得了顯著的臨床療效，其作用機(jī)制與免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)［4］。益氣養(yǎng)陰解毒方是“扶正法”治療肺癌的代表方，全方益氣養(yǎng)陰以扶正固表，清熱解毒標(biāo)本兼顧。作者課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，益氣養(yǎng)陰解毒方及其類方可以提高肺癌患者生活質(zhì)量、穩(wěn)定瘤灶和延長(zhǎng)生存期，作用機(jī)制與改善外周細(xì)胞免疫功能、下調(diào)sCTLA?4 表達(dá)相關(guān)［5?7］。黃芪是益氣養(yǎng)陰解毒方的君藥，補(bǔ)益肺脾之氣。黃芪甲苷是黃芪最主要的單體活性成分［8］，具有抗肺癌的活性，其機(jī)制可能與抑制吲哚胺?2，3?雙加氧酶（Indoleamine 2，3?dioxygenase，IDO）表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)Treg細(xì)胞水平，增強(qiáng)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞的活性有關(guān)［9］。益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷體現(xiàn)了中醫(yī)“扶正法”提高自身抗癌能力的治療理念。基于此，本研究并非觀察中醫(yī)藥對(duì)腫瘤細(xì)胞的直接抑制作用，而是應(yīng)用淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)體系，探討益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷通過下調(diào)mCTLA?4 及sCTLA?4表達(dá)，逆轉(zhuǎn)CTLA?4 介導(dǎo)的肺癌免疫逃逸，進(jìn)而抑制腫瘤的生長(zhǎng)，并探索中醫(yī)藥聯(lián)合CTLA?4 阻斷劑的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料

1.1 動(dòng)物和細(xì)胞 C57BL／6 小鼠，6～8 周齡，雄性，體質(zhì)量約20 g，購(gòu)自上海西普爾?必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（滬）2018?0006。小鼠Lewis 肺癌細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫(kù)。

1.2 藥物與試劑 益氣養(yǎng)陰解毒方由生黃芪30 g、北沙參30 g、天冬15 g、麥冬15 g、女貞子12 g、山茱萸9 g、絞股藍(lán)15 g、仙靈脾15 g、葫蘆巴12 g、石上柏30 g、石見穿30 g、重樓15 g組成，生藥由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院中藥房提供。益氣養(yǎng)陰解毒方按傳統(tǒng)方法制成水煎劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后制成凍干粉，凍干粉由上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院科技中心實(shí)驗(yàn)室制備，使用真空干燥（60 ℃）。益氣養(yǎng)陰解毒方凍干粉采用PBS 溶解，制備成質(zhì)量濃度為50 mg／mL 的貯備液，用0.22 μm 微孔濾膜過濾后分裝，4 ℃保存?zhèn)溆?。黃芪甲苷（北京索萊寶科技有限公司，SA8640）粉末，純度≥98%（HPLC），用DMSO制備成質(zhì)量濃度為20 mg／mL 的母液，－20 ℃保存?zhèn)溆??？剐∈驝TLA?4 單抗［clone 9H10］ （美國(guó)BioXCell 公司，660518J1），質(zhì)量濃度為7.32 mg／mL，以PBS 作為溶劑，4 ℃避光保存?zhèn)溆?。小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離液試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，P8860）。APC 標(biāo)記的抗小鼠CD152（CTLA?4）單克隆抗 體（美 國(guó)Biolegend 公 司，106310）。FITC 標(biāo)記的抗小鼠CD8a 抗體（美國(guó)Biolegend公司，100705）。小鼠CTLA?4 ELISA 試劑盒（英國(guó)Abcam公司，ab255720）。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒?8（CCK?8）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，C0037）。

1.3 儀器 CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)賽默飛世爾科技公司，51020241）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，OLYMPAS IX71）；臺(tái)式低速離心機(jī)（湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，L500）；多功能酶標(biāo)儀（美國(guó)MD 公司，SpectraMax M2e）；流式細(xì)胞儀（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，F(xiàn)ACS Calibur）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取培養(yǎng)基RPMI 1640，加10% FBS 和1%雙抗（100 U／mL 青霉素及100 U／mL 鏈霉素），將消化后的Lewis 肺癌細(xì)胞與配置好的培養(yǎng)基在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis 肺癌細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞分離 無(wú)菌條件下摘取C57BL／6小鼠脾臟，撕去脾臟被膜，用眼科剪將脾臟剪成小塊。將200 目尼龍篩網(wǎng)放置于平皿上，加入少量組織稀釋液，將脾臟放置于篩網(wǎng)上，使用注射器活塞來(lái)研磨脾臟。研磨完全后使用組織稀釋液沖洗篩網(wǎng)，收集細(xì)胞懸液，再經(jīng)濾網(wǎng)過濾。加入與脾臟單細(xì)胞懸液等量的分離液。吸取單細(xì)胞懸液加于分離液液面上。室溫，2 500 r／min，離心25 min。用移液槍吸取第二層環(huán)狀乳白色淋巴細(xì)胞至另一潔凈的15 mL離心管中，向離心管中加入10 mL細(xì)胞洗滌液洗滌白膜層細(xì)胞，1 000 r／min，離心10 min。棄上清，5 mL 的細(xì)胞清洗液重懸細(xì)胞，1 000 r／min，離心10 min，并重復(fù)一遍。棄上清，細(xì)胞重懸備用。

2.3 小鼠脾臟淋巴細(xì)胞與Lewis 肺癌細(xì)胞共培養(yǎng)體系及分組給藥 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Lewis 肺癌細(xì)胞和小鼠脾臟淋巴細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞接觸式共培養(yǎng)，共培養(yǎng)時(shí)間為24 h。分為空白對(duì)照組、黃芪甲苷組（單體組）、益氣養(yǎng)陰解毒方組（復(fù)方組）、抗CTLA?4 單抗組（單抗組）、黃芪甲苷＋抗CTLA?4 單抗組（單體＋單抗組）、益氣養(yǎng)陰解毒方＋抗CTLA?4 單抗組（復(fù)方＋單抗組）。本研究預(yù)實(shí)驗(yàn)采用CCK?8 法檢測(cè)益氣養(yǎng)陰解毒方和黃芪甲苷對(duì)Lewis 肺癌細(xì)胞存活率的影響以選擇合適的給藥濃度，結(jié)果顯示益氣養(yǎng)陰解毒方給藥濃度1 000 μg／mL、黃芪甲苷給藥濃度80 μg／mL 以下對(duì)Lewis肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)影響，并參考抗CTLA?4 單抗促進(jìn)IL?2 和INF?γ分泌、增強(qiáng)免疫功能的體外研究［10］，本實(shí)驗(yàn)益氣養(yǎng)陰解毒方、黃芪甲苷及抗CTLA?4 單抗的給藥濃度分別為500、50、5 μg／mL。

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)mCTLA?4 及CD8＋T細(xì)胞的表達(dá) 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Lewis 肺癌細(xì)胞（1×106／mL）接種于6 孔板中，每孔1 mL，每組3 復(fù)孔，待腫瘤細(xì)胞貼壁后，加入小鼠脾臟淋巴細(xì)胞（1×106／mL），每孔1 mL，根據(jù)組別加入益氣養(yǎng)陰解毒方（500 μg／mL）、黃芪甲苷（50 μg／mL）、抗CTLA?4 單抗（5 μg／mL），共培養(yǎng)24 h。從共培養(yǎng)體系中吸取懸浮的淋巴細(xì)胞，PBS 清洗2 次后，加入CD8、CTLA?4 抗體，避光孵育30 min。PBS 清洗，加入300 μL PBS 重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)CD8＋T細(xì)胞和mCTLA?4。

2.5 ELISA 檢測(cè)sCTLA?4 共培養(yǎng)體系同“2.4”，取共培養(yǎng)所得上清，嚴(yán)格按照小鼠CTLA?4 ELISA 試劑盒說明書進(jìn)行操作。根據(jù)試劑盒中提供的標(biāo)準(zhǔn)品濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算其質(zhì)量濃度，單位用pg／mL 表示。

2.6 CCK?8 檢測(cè)Lewis 肺癌細(xì)胞的增殖情況 在96 孔板里，每孔加入Lewis 肺癌細(xì)胞（2 000個(gè)細(xì)胞）在含10%FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，待腫瘤細(xì)胞貼壁后，加入小鼠脾臟淋巴細(xì)胞（2 000個(gè)細(xì)胞），根據(jù)組別加入益氣養(yǎng)陰解毒方（500 μg／mL）、黃芪甲苷（50 μg／mL）、抗CTLA?4 單抗（5 μg／mL），每孔終體積為100 μL，每組3個(gè)復(fù)孔，共培養(yǎng)24 h，棄去培養(yǎng)上清（包括淋巴細(xì)胞），PBS 清洗1 次后每孔加入10 μL CCK?8 溶液和90 μL 含10% FBS 的RPMI 1640 培養(yǎng)液，在37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育4 h，在450 nm 測(cè)定吸光度值。計(jì)算細(xì)胞存活率，存活率＝（OD實(shí)驗(yàn)組／OD對(duì)照組）×100%。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用GraphPad Prism 5 軟件進(jìn)行作圖。

3 結(jié)果

3.1 益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷對(duì)mCTLA?4 及CD8＋T細(xì)胞的影響 與空白對(duì)照組比較，單體組、復(fù)方組、單抗組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組mCTLA?4 表達(dá)降低（P＜0.01）；與單體組比較，單抗組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組mCTLA?4 表達(dá)降低（P＜0.01）；與復(fù)方組比較，單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組mCTLA?4 表達(dá)降低（P＜0.05）；與單抗組比較，復(fù)方＋單抗組mCTLA?4 表達(dá)降低（P＜0.01）。與空白對(duì)照組比較，單體組、復(fù)方組、單抗組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組CD8＋T細(xì)胞表達(dá)升高（P＜0.05）；與單體組比較，單抗組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組CD8＋T細(xì)胞表達(dá)升高（P＜0.01）；與復(fù)方組比較，復(fù)方＋單抗組CD8＋T細(xì)胞比例升高（P＜0.01）。見圖1。

圖1 益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷對(duì)mCTLA?4 和CD8＋T細(xì)胞表達(dá)的影響（n＝3）

3.2 益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷對(duì)sCTLA?4 的影響 與空白對(duì)照組比較，單體組、復(fù)方組、單抗組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組sCTLA?4 表達(dá)降低（P＜0.01）；與單體組比較，復(fù)方組、單抗組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組sCTLA?4 表達(dá)降低（P＜0.01）；與復(fù)方組比較，單抗組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組sCTLA?4 表達(dá)降低（P＜0.01）；與單抗組比較，復(fù)方＋單抗組sCTLA?4 表達(dá)降低（P＜0.05）。見圖2。

圖2 益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷對(duì)sCTLA?4 的影響（n＝3）

3.3 益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷對(duì)共培養(yǎng)體系中Lewis 肺癌細(xì)胞增殖的影響 與空白對(duì)照組比較，單體組、復(fù)方組、單抗組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組Lewis 肺癌細(xì)胞存活率降低（P＜0.01）；與單體組比較，復(fù)方組、單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組Lewis 肺癌細(xì)胞存活率降低（P＜0.01）；與復(fù)方組比較，單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組Lewis 肺癌細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）；與單抗組比較，單體＋單抗組和復(fù)方＋單抗組Lewis 肺癌細(xì)胞存活率降低（P＜0.01）；與單體＋單抗組比較，復(fù)方＋單抗組Lewis 肺癌細(xì)胞存活率降低（P＜0.05）。見圖3。

圖3 益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷對(duì)Lewis 肺癌細(xì)胞增殖的影響（n＝3）

4 討論

免疫應(yīng)答過程中T細(xì)胞的激活需要雙信號(hào)作用。第一信號(hào)主要來(lái)自T細(xì)胞抗原識(shí)別受體與抗原肽?主要組織相容性復(fù)合體的特異性結(jié)合；第二信號(hào)由一系列共刺激分子提供，免疫檢查點(diǎn)就是其中負(fù)性共刺激分子，主要包括CTLA?4、程序性死亡分子1（programmed death 1，PD?1）及程序性死亡分子1 配體（PD?1 ligand，PD?L1）等，其作用類似于T細(xì)胞的“制動(dòng)系統(tǒng)”，抑制特異性T細(xì)胞的活化、增殖，限制免疫系統(tǒng)對(duì)自身健康細(xì)胞進(jìn)行攻擊。然而，惡性腫瘤利用免疫檢查點(diǎn)這一特性逃避機(jī)體免疫殺傷。CTLA?4 主要在外周淋巴器官中抑制T細(xì)胞的活化［11］，在腫瘤微環(huán)境中亦可發(fā)揮免疫抑制作用［12］。sCTLA?4 是由于CTLA?4 選擇性剪切使CTLA?4 基因缺失第三外顯子而形成，亦與B7分子結(jié)合，阻斷CD28／B7 通路，抑制機(jī)體免疫功能［13］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為“正氣虧虛”是肺癌發(fā)生、發(fā)展的根本，邪毒則是肺癌發(fā)生的重要條件。早在20 世紀(jì)70年代，劉嘉湘教授在全國(guó)率先系統(tǒng)地提出“扶正治癌”學(xué)術(shù)思想和治療方法，通過提高機(jī)體自身抗癌能力達(dá)到“人瘤共存”“帶瘤生存”的目的，其機(jī)制可以從調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能方面深入研究。益氣養(yǎng)陰解毒方是“扶正法”治療肺癌的代表方，由生黃芪、北沙參、天冬、麥冬、女貞子、山茱萸、絞股藍(lán)、仙靈脾、葫蘆巴、石上柏、石見穿、重樓組成。生黃芪補(bǔ)益肺脾之氣，北沙參滋養(yǎng)肺胃之陰液、潤(rùn)肺止咳，共為君藥；天冬、麥冬、女貞子、山茱萸、絞股藍(lán)為臣藥，增強(qiáng)益氣養(yǎng)陰的功效；仙靈脾、葫蘆巴、石上柏、石見穿、重樓為佐藥，仙靈脾、葫蘆巴具有溫腎陽(yáng)，暖脾陽(yáng)之功，其與黃芪合用，益氣作用更強(qiáng)，其與滋養(yǎng)陰液諸藥同用，則剛?cè)嵯酀?jì)，石上柏、石見穿、重樓清熱解毒，祛邪以扶正；天冬在本方中又取其入肺經(jīng)亦作為使藥之用。全方具有益氣養(yǎng)陰、清熱解毒之功效。研究顯示，益氣養(yǎng)陰解毒方及其類方具有穩(wěn)定瘤灶、延長(zhǎng)生存期的作用，機(jī)制與改善機(jī)體外周細(xì)胞免疫功能相關(guān)［5?6］。黃芪甲苷是黃芪最主要的單體活性成分，具有調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、下調(diào)免疫抑制因子IDO 表達(dá)以及增強(qiáng)對(duì)抗癌藥物敏感性等作用［8?9，14］。本課題組前期研究顯示，晚期非小細(xì)胞肺癌（non?small?cell lung cancer，NSCLC）患者外周血中sCTLA?4 高表達(dá)［15］；益氣養(yǎng)陰解毒方及其類方的作用機(jī)制可能為下調(diào)晚期NSCLC 患者外周血中sCTLA?4 的表達(dá)［7］。由此，推測(cè)調(diào)控CTLA?4 介導(dǎo)的肺癌外周及微環(huán)境的免疫耐受可能是益氣養(yǎng)陰解毒方的重要作用機(jī)制之一，值得進(jìn)一步深入研究。

基于中醫(yī)“扶正法”提高自身抗癌能力的治療理念，本實(shí)驗(yàn)并非觀察中藥復(fù)方及單體直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用，而是運(yùn)用淋巴細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)的方法，探討益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷是否通過下調(diào)CTLA?4 表達(dá)，進(jìn)而增強(qiáng)免疫細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用，并觀察中醫(yī)藥與免疫檢查點(diǎn)抑制劑的協(xié)同增效作用。研究發(fā)現(xiàn)，黃芪甲苷、益氣養(yǎng)陰解毒方、抗CTLA?4 單抗均能下調(diào)共培養(yǎng)體系中mCTLA?4 和sCTLA?4 的表達(dá)，提高CD8＋T細(xì)胞水平，黃芪甲苷或益氣養(yǎng)陰解毒方聯(lián)合抗CTLA?4 單抗具有協(xié)同增效的作用。研究證實(shí)，益氣養(yǎng)陰解毒方及黃芪甲苷可以通過下調(diào)免疫抑制分子mCTLA?4 和sCTLA?4，逆轉(zhuǎn)CTLA?4 介導(dǎo)的肺癌免疫逃逸，從而發(fā)揮抗癌作用，體現(xiàn)了中醫(yī)“扶正治癌”提高自身抗癌能力的作用內(nèi)涵。研究中，給藥組均提高了CD8＋T細(xì)胞的表達(dá)，可能與CD8＋T細(xì)胞中細(xì)胞毒殺傷性亞群的增殖有關(guān)，課題組后續(xù)研究將進(jìn)一步對(duì)T細(xì)胞表型進(jìn)行分析，并深入挖掘中醫(yī)藥如何調(diào)控CTLA?4 表達(dá)的分子機(jī)制，以期為完善中醫(yī)“扶正治癌”的作用機(jī)制提供研究基礎(chǔ)。