田薊苷對高脂飲食ApoE?／?小鼠抗動脈粥樣硬化活性及作用機制

姜 雯 楊 浩 席 梅 于 寧*

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830000； 2.新疆維吾爾自治區(qū)藥物研究所，新疆 烏魯木齊830004）

心血管疾病（cardiovascular diseases，CVD）是中國乃至全世界范圍內(nèi)死亡的主要原因之一［1］。動脈粥樣硬化（atherosclerosis）是多種CVD 的病理學(xué)基礎(chǔ)，研究報道［2］血脂代謝異常，尤其是膽固醇代謝紊亂是動脈粥樣硬化最主要的危險因素。他汀類藥物被廣泛用于臨床改善血脂，但單純使用他汀類藥物治療的高膽固醇血癥很難達(dá)到指南推薦的低密度脂蛋白膽固醇（low?density lipoprotein cholesterol，LDL?C）目標(biāo)［3］。此外，有些患者不能耐受他汀類藥物的不良反應(yīng)。因此，尋找安全性高且具有調(diào)節(jié)血脂和改善動脈粥樣硬化作用的中藥材，為抗動脈粥樣硬化提供了思路。香青蘭Dracoceohalum moldovicaL.為唇形科香青蘭的干燥地上部分，具有益心護腦、保肝健胃、開通腦中閉塞的功效，用于治療冠心病、高血壓、氣管炎等疾?。?］。研究表明［5?8］，田薊苷在香青蘭總黃酮中含量最高，其抗動脈粥樣硬化的潛在機制可能與抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長因子?β／Smad 信號通路有關(guān)，也可能通過抗炎作用發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用。以上研究明確了田薊苷在抗動脈粥樣硬化方面的潛在價值，但對其在調(diào)節(jié)血脂藥效及作用機制方面的研究仍十分欠缺。因此，為進一步探討田薊苷在抗動脈粥樣硬化疾病中發(fā)揮的作用，本研究以高脂飲食 ApoE 基因敲除（ApoE knockout，ApoE?／?）小鼠為研究對象，探索田薊苷對血脂代謝水平、肝臟中磷脂酰肌醇3?激酶／蛋白激酶B（phosphoinositide 3?kinase／protein kinase B，PI3K／AKT）信號通路和固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP?2）、低密度脂蛋白受體（low density lipoprotein receptor，LDLR）蛋白表達(dá)的影響，以期為闡明田薊苷抗動脈粥樣硬化的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 試劑與藥物 田薊苷標(biāo)準(zhǔn)品（北京英萊克科技發(fā)展有限公司，批號4291?60?5，純度≥98%）；阿托伐他汀鈣（美國Sigma 公司，批號PHR1422?1G，純度≥98%）。總膽固醇（total cholesterol，TC）試劑盒（批號141741）、甘油三酯（triglycerides，TG）試劑盒（批號146851）、LDL?C 試劑盒（批號120231）、高密度脂蛋白膽固醇（high?density lipoprotein cholesterol，HDL?C）試劑盒（批號120241）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（alanine aminotransferase，ALT）試劑盒（批號1007150）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（批號1007143）、葡萄糖測定試劑盒（批號180851）購自中生北控生物科技股份有限公司；總膽汁酸（total bile acid，TBA）試劑盒（北京百奧萊博科技有限公司，批號SNM281）；β?actin 一抗（北京義翹神州公司，批號100166?MM10）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白G（IgG）二抗、HRP 標(biāo)記山羊抗兔IgG 二抗（英國Abcam 公司，批號ab205718、ab205719）；其余試劑均為分析純或?qū)嶒炇页Ｓ靡?guī)格，水為蒸餾水。

1.2 動物 無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級健康雄性遺傳背景C57BL／6 J 的ApoE?／?小鼠60 只，體質(zhì)量（24.0±1.5）g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號SCXK（新）2018?0002，飼養(yǎng)在新疆醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心SPF 級動物房中，動物飼養(yǎng)、處理和手術(shù)過程由新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院動物保護與使用委員會審核、批準(zhǔn)和監(jiān)督。室溫20～25 ℃，濕度55%～65%，光照／黑暗12 h 循環(huán)，飼養(yǎng)期間小鼠自由飲水與進食。普通飼料（脂肪13%，蛋白質(zhì)22%，碳水化合物65%，批號LAD 0011），高脂飼料（脂肪42%，蛋白質(zhì)14%，碳水化合物44%，膽固醇含量0.2%，批號TP 26304）購自南通特洛菲飼料科技有限公司。

1.3 儀器 EPS301型電泳儀、Hoefer SE250型垂直電泳槽、TE22 小型轉(zhuǎn)膜電泳槽（美國Amersham Biosciences 公司）；3?18K 高速冷凍離心機（德國Sigma 公司）；Innova 43型恒溫?fù)u床（英國New Brunswick Scientific 公 司）；ABI QuantStudioTM6 Flex 實時熒光定量PCR 儀（美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司）；Gel Doc XR型凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio?Rad公司）。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周，隨機分為6組，即普通飲食組、高脂飲食組、田薊苷低劑量給藥組（40 mg／kg）、田薊苷中劑量給藥組（120 mg／kg）、田薊苷高劑量給藥組（200 mg／kg）、阿托伐他汀給藥組（15 mg／kg），每組10 只，1 次／d，連續(xù)飼養(yǎng)12 周。普通飲食組及高脂飲食組每天灌 胃 0.5% 羧甲基纖維素鈉（carboxymethylcellulose sodium，CMC?Na），阿托伐他汀給藥組、田薊苷給藥組每天灌胃用0.5%CMC?Na 溶解的相應(yīng)藥物。普通飲食組小鼠給予普通飼料，高脂組，田薊苷低、中、高劑量組和阿托伐他汀組小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)。

2.2 血脂代謝水平檢測 12 周后，6組ApoE?／?小鼠禁食不禁水12 h，5%戊巴比妥麻醉后，腹主動脈采血，3 000 r／min 離心10 min，收集上清，分裝標(biāo)記。嚴(yán)格按照試劑盒說明書檢測血清TC、TG、HDL?C、LDL?C、ALT、AST、TBA、空腹血糖（fasting blood glucose，F(xiàn)BG）水平。

2.3 田薊苷對ApoE?／?小鼠肝臟組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 稱取肝臟組織約50 mg 至1 mL T?PER／cocktail 裂解液中，生物樣品均質(zhì)器破碎40 s，16 000g離心10 min，吸取上清，1∶4 稀釋，BCA蛋白定量，添加蛋白上樣緩沖液，煮沸10 min，Western blot 檢測肝臟組織PI3K、磷酸化?PI3K（p?PI3K）、AKT、磷酸化?AKT（p?AKT）、SREBP?2和LDLR 蛋白水平的變化。

2.4 田薊苷對ApoE?／?小鼠主動脈的影響 動脈粥樣硬化程度由主動脈上油紅O 染色的脂質(zhì)沉積來進行評估，在解剖鏡下將主動脈外周多余的脂肪剝離，剝凈后將主動脈沿背部剖開，接下來進行油紅O 染色，用Image J 測定面積，計算主動脈斑塊面積占總血管面積之比。

2.5 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 17.0 軟件進行分析，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較的事后檢驗分析采用Student?Newmnan?Keuls 檢驗法。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 田薊苷對ApoE?／?小鼠血糖血脂的影響 與普通飲食組比較，高脂飲食組ApoE?／?小鼠連續(xù)服用高脂飼料12 周后血清中TC、TG、LDL?C 和FBG水平均升高，而HDL?C 和TBA 水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.01）。與高脂飲食組相比，田薊苷高劑量組和阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清TC 水平降低，田薊苷高劑量組ApoE?／?小鼠血清TG 水平降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；田薊苷低、中劑量組和阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清TG 水平無明顯變化（P＞0.05）。

與高脂飲食組比較，田薊苷低、中、高劑量組和阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清LDL?C 水平均降低（P＜0.05，P＜0.01）；血清HDL?C 和FBG 水平無明顯變化（P＞0.05）。與高脂飲食組比較，阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清TBA 水平降低（P＜0.05），田薊苷低、中、高劑量組ApoE?／?小鼠血清中TBA 水平無明顯變化（P＞0.05）。見圖1。

圖1 給藥12 周后各組ApoE?／?小鼠血糖血脂代謝水平（， n＝10）Fig.1 Levels of blood lipids and sugar in ApoE?／?mice on high?fat diet after 12?week administration（， n＝10）

3.2 田薊苷對ApoE?／?小鼠肝臟功能的影響 12 周后，各組ApoE?／?小鼠血清ALT 和AST 水平無明顯變化（P＞0.05）。見圖2。

圖2 給藥12 周后各組ApoE?／?小鼠肝功能變化（， n＝10）Fig.2 Changes in liver functions of ApoE?／?mice on high?fat diet after 12?week administration（， n＝10）

3.3 田薊苷對ApoE?／?小鼠主動脈斑塊的影響 12周后，油紅O 染色結(jié)果顯示，與普通飲食組比較，高脂飲食組ApoE?／?小鼠主動脈斑塊增多（P＜0.01）。與高脂飲食組比較，田薊苷低、中、高劑量給藥組及阿托伐他汀給藥組ApoE?／?小鼠主動脈斑塊的沉積減少（P＜0.05，P＜0.01）。見圖3。

圖3 給藥12 周后各組ApoE?／?小鼠主動脈斑塊變化（， n＝10）Fig.3 Changes in aortic plaque area of ApoE?／? mice on high?fat diet after 12?week administration（，n＝10）

3.4 田薊苷對ApoE?／?小鼠肝臟組織中相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 12 周后，檢測結(jié)果顯示，與普通飲食組比較，高脂飲食ApoE?／?小鼠肝臟組織中PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），p?PI3K、p?AKT、SREBP?2 和LDLR 蛋白表達(dá)降低（P＜0.05）。與高脂飲食組比較，田薊苷高劑量組和阿托伐他汀給藥組ApoE?／?小鼠肝臟組織中PI3K 和AKT 蛋白表達(dá)無明顯變化（P＞0.05），p?PI3K、p?AKT、SREBP?2 和LDLR 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。見圖4。

圖4 給藥12 周后各組ApoE?／?小鼠相關(guān)蛋白表達(dá)（，n＝10）Fig.4 Changes in hepatic protein expressions of ApoE?／?mice on high?fat diet after 12?week administration（， n＝10）

4 討論

ApoE?／?小鼠是研究動脈粥樣硬化疾病常用的動物模型之一［9?10］，原因是ApoE?／?小鼠血脂代謝存在異常，可顯著誘發(fā)多余脂質(zhì)在血管內(nèi)堆積，自發(fā)形成動脈粥樣硬化斑塊，通過高脂飲食可加速ApoE?／?小鼠血管動脈粥樣硬化斑塊的形成，其斑塊分布和病理學(xué)特征與人體血管動脈粥樣硬化斑塊較為相似。因此，本研究以高脂飲食的ApoE?／?小鼠為動脈粥樣硬化動物模型。國內(nèi)研究人員發(fā)現(xiàn)［11］，通過非極性和極性溶劑，如石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇和水提取的香青蘭成分均能夠降低正常大鼠TC、TG 和LDL?C 水平，提示香青蘭中黃酮類及萜類等多種活性成分具有調(diào)節(jié)血脂水平的作用。田薊苷在香青蘭總黃酮中含量最高，故本研究探討田薊苷對高脂飲食ApoE?／?小鼠血脂代謝和抗動脈粥樣硬化的作用。

本研究給予高脂飲食ApoE?／?小鼠田薊苷12 周后，發(fā)現(xiàn)與高脂飲食組比較，田薊苷高劑量組和阿托伐他汀組ApoE?／?小鼠血清TC 水平降低，田薊苷低、中、高劑量組和阿托伐他汀組血清LDL?C 水平降低、主動脈斑塊的沉積減少，說明田薊苷可降低高脂飲食ApoE?／?小鼠血脂代謝水平，減少主動脈斑塊沉積。研究發(fā)現(xiàn)［12?13］PI3K／AKT 信號通路參與調(diào)控HepG2細(xì)胞脂質(zhì)代謝和LDLR 蛋白的表達(dá)。LDLR 蛋白的表達(dá)受到多層次的調(diào)控，但在LDLR的啟動子區(qū)內(nèi)存在SREBPs 結(jié)合位點，哺乳動物細(xì)胞中SREBP?2 是LDLR 的主要激活因子在脂蛋白的代謝中發(fā)揮重要作用［14］。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，與高脂飲食組比較，田薊苷高劑量給藥組和陽性對照阿托伐他汀給藥組均能上調(diào)ApoE?／?小鼠肝組織的SREBP?2 和LDLR 蛋白的表達(dá)，說明田薊苷抗動脈粥樣硬化作用可能與調(diào)節(jié)肝臟中SREBP?2 和LDLR蛋白表達(dá)有關(guān)。SREBP?2 蛋白可激活PI3K／AKT 信號通路［15］，該信號通路在抗動脈粥樣硬化中發(fā)揮重要作用［16］。本研究發(fā)現(xiàn)，與普通飲食組比較，高脂飲食可以導(dǎo)致ApoE?／?小鼠肝臟p?PI3K、p?AKT、SREBP?2 和LDLR 蛋白表達(dá)降低，高劑量田薊苷和阿托伐他汀可上調(diào)SREBP?2 蛋白的表達(dá)。田薊苷發(fā)揮調(diào)節(jié)血脂代謝、抗動脈粥樣硬化的關(guān)鍵靶點是否與SREBP?2 蛋白有關(guān)，課題組將在后續(xù)的研究中通過體外細(xì)胞實驗，沉默SREBP?2 蛋白的表達(dá)，進一步觀察田薊苷的作用機制。此外，田薊苷高劑量組在降低ApoE?／?小鼠血清中TC 和LDL?C 水平，減少主動脈及主動脈根部斑塊，以及減少肝臟脂質(zhì)沉積效果與阿托伐他汀組效果相近，但田薊苷與阿托伐他汀的作用機制是否相同，仍需進一步研究。

綜上所述，田薊苷能降低ApoE?／?小鼠血清中TC 和LDL?C 水平，并存在劑量依賴性。同時，高劑量的田薊苷可上調(diào)ApoE?／?小鼠肝臟中p?PI3K、p?AKT、SREBP?2 和LDLR 蛋白的表達(dá)，減少主動脈斑塊沉積和肝臟脂質(zhì)沉積。由此推測田薊苷發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用可能與激活肝臟中PI3K／AKT信號通路，調(diào)節(jié)SREBP?2 蛋白表達(dá)，從而上調(diào)LDLR 蛋白表達(dá)，增加LDL?C 被攝取途徑有關(guān)，但其機制還需進一步深入研究。