升陷湯標準煎液HPLC?ELSD 特征指紋圖譜建立及3種成分測定

常麗靜李明月韋花花陳 新

（長春中醫(yī)藥大學長白山道地藥材藥效物質重點研究室，吉林 長春130117）

升陷湯是《古代經(jīng)典名方目錄（第一批）》中第73 首方劑，源于《醫(yī)學衷中參西錄》，由君藥黃芪、臣藥柴胡及升麻、佐藥知母、使藥桔梗組成，主治胸中大氣下陷，氣短不足以息，或努力呼吸，有似乎喘，或氣息將停，危在頃刻?，F(xiàn)代研究表明，該方對急性呼吸窘迫綜合征患者療效明顯［1］，加味聯(lián)合硫酸沙丁胺醇治療慢性阻塞性肺疾病急性加重期的作用明顯優(yōu)于單用硫酸沙丁胺醇，可改善呼吸力學指標、血氣分析指標，調節(jié)血清過氧化脂質水平［2］，不良反應少，是一種安全有效的治療策略［3］，但目前缺乏其質量評價及監(jiān)測方法，也尚無關于其物質基準的報道。

本實驗采用HPLC?ELSD 法建立了升陷湯標準煎液的特征指紋圖譜，并通過電導儀、PH 計對其質量進行實時監(jiān)控，可彌補該方成分分析與質量控制的空缺，并為其他復方制劑物質基準的相關研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 LXJ?ⅡB 低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）；HWS12型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學儀器有限公司）；Agilent 1260 高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；Centrifuge 5810R高速冷凍離心機（德國艾本德公司）；DDSJ?308A電導率儀（上海雷磁儀器廠）；實驗室PH 計［梅特勒?托利多儀器（上海）有限公司］。

1.2 試劑與藥物 黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 對照品（批號110781?201616、111839?201505、111851?201708，純 度 96.9%、94.5%、96.9%，中國食品藥品檢定研究院）。乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）；水為蒸餾水。

1.3 藥材 黃芪（產(chǎn)地甘肅、河北、內蒙古）、柴胡（產(chǎn)地山西、甘肅、陜西）、升麻（產(chǎn)地吉林）、桔梗（產(chǎn)地河北）、知母（產(chǎn)地河北）各15批，均購自吉林省安國藥業(yè)集團有限公司、吉林省北藥藥材加工有限公司，經(jīng)長春中醫(yī)藥大學藥學院實驗中心肖井雷教授鑒定為正品。升陷湯中上述5味飲片均為生用，將其切制成厚片，并予以編號。

2 方法

2.1 標準煎液制備 《醫(yī)學衷中參西錄》［4］記載，升陷湯原方為“生箭芪六錢，知母三錢，柴胡一錢五分、桔梗一錢五分、升麻一錢”，而在清代一兩（37.3 g）為十錢，一錢為十分，則一錢為3.73 g，五分為1.865 g，即方中組方藥材用量分別為黃芪22.4 g、知母11.2 g、柴胡5.6 g、桔梗5.6 g、升麻3.7 g。根據(jù)前期遵古研究升陷湯煎煮工藝，以桑柴火為煎煮用火，結合醫(yī)家用藥習慣“知母后下”“煮數(shù)沸”“次煎原不可廢”確定煎煮方法，以煎出量“一大盅”確定加水量，通過HPLC?DAD 紫外指紋圖譜進行電加熱工藝擬合，具體方法為按處方劑量稱取藥味共48.5 g，先將黃芪、升麻、柴胡、桔梗飲片置于分體黑陶壺中，加10 倍量水浸泡30 min，200 ℃電陶爐加熱至沸，沸后8 min 下知母飲片，繼續(xù)煎煮7 min，濾過，藥渣加8 倍量水，200 ℃電陶爐加熱至沸，沸后繼續(xù)煎煮10 min，濾過，煎液合并2 次，適當煎煮至500 mL，即得。信息見表1。

表1 15 批樣品信息Tab.1 Information of fifteen batches of samples

2.2 色譜條件

2.2.1 特征指紋圖譜 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）?水（B），梯度洗脫（0～20 min，90%～75%A；20～50 min，75%～70% A；50～70 min，70%～68% A；70～80 min，68% A；80～90 min，68%～90%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；進樣量10 μL；蒸發(fā)器溫度80 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 600 mL／min。

2.2.2 黃芪甲苷含量測定 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（32∶68）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；進樣量2、10 μL（對照品）及10 μL（供試品）；蒸發(fā)器溫度50 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 400 mL／min.

2.2.3 知母皂苷BⅡ含量測定 Agilent ZORBAX Eclipse Plus C8色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈?水（25∶75）；體積流量1.0 mL／min；柱溫25 ℃；進樣量2、10 μL（對照品）及10 μL（供試品）；蒸發(fā)器溫度50 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 400 mL／min.

2.2.4 桔梗皂苷D 含量測定 YMC?Pack ODS?A色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 pm）；流動相乙腈?水（25∶75）；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量：進樣量2、10 μL（對照品）及10 μL（供試品）；蒸發(fā)器溫度80 ℃；霧化器溫度50 ℃；載氣體積流量1 600 mL／min.

2.3 對照品溶液制備 精密稱取黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 對照品適量，80%甲醇制備成含0.484 8 mg／mL 黃芪甲苷的對照品溶液，30%丙酮制備成含0.498 0 mg／mL 知母皂苷BⅡ的對照品溶液，甲醇制備成含0.499 7 mg／mL 桔梗皂苷D的對照品溶液。

2.4 供試品溶液制備

2.4.1 特征指紋圖譜 精密量取90 mL 標準煎液，加入95%乙醇至含醇量為70%，靜置過夜，醇沉液離心30 min，上清液蒸干，10 mL 蒸餾水分次溶解完全，10 000 r／min 離心10 min，吸取上清液，置于分液漏斗中，10 mL 乙酸乙酯振搖提取1 次，分取水層，水飽和正丁醇充分振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇層，氨試液洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨試液層，正丁醇液層于恒溫水浴鍋中蒸干，甲醇溶解定容至5 mL，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4.2 特征指紋圖譜陰性 按照全處方比例藥味48.5 g，稱取相應質量缺黃芪、缺柴胡、缺升麻、缺桔梗、缺知母的陰性處方，按“2.1”項下方法制備陰性標準煎液，再按“2.4.1”項下方法制備相應陰性供試品溶液。

2.4.3 黃芪甲苷含量測定 精密量取標準煎液50 mL，水飽和正丁醇充分振搖提取4 次，每次40 mL，合并正丁醇液，氨試液洗滌2 次，每次40 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，轉移至5 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4.4 知母皂苷BⅡ含量測定 精密量取標準煎液20 mL，水浴濃縮至浸膏狀，加2 g 硅藻土分散，10 mL 30% 丙酮超聲（400 W、40 kHz）處 理10 min，濾過，取續(xù)濾液，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.4.5 桔梗皂苷D 含量測定 精密量取升陷湯標準煎液150 mL，水浴濃縮至浸膏狀，加10 g 硅藻土分散，50 mL 50% 甲醇超聲（400 W、40 kHz）處理10 min，離心30 min，取25 mL 上清液蒸干，加20 mL 水溶解，水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，50 mL 氨試液洗滌，棄去氨液，正丁醇飽和水洗滌，棄去水液，正丁醇液蒸干，殘渣加適量甲醇溶解，轉移至2 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過濾，即得。

2.5 特征指紋圖譜方法學考察

2.5.1 專屬性試驗 取“2.3”“2.4.1”“2.4.2”項下溶液適量，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1。由此可知，各成分分離度理想，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

圖1 各成分HPLC?ELSD 色譜圖Fig.1 HPLC?ELSD chromatograms of various constituents

2.5.2 精密度試驗 取“2.1”項下標準煎液（S1），按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定6 次，以4號峰（桔梗皂苷D）為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.15%、1.79%，表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.1”項下標準煎液（S1），按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，于0、1.5、3.0、4.5、9、12、18、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以4號峰（桔梗皂苷D）為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.32%、2.77%，表明供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復性試驗 取“2.1”項下標準煎液（S1），按“2.4.1”項下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，以4號峰（桔梗皂苷D）為參照，測得各共有峰相對保留時間、相對峰面積RSD分別小于0.18%、3.25%，表明該方法重復性良好。

2.6 HPLC?ELSD 特征指紋圖譜建立 取“2.1”項下標準煎液15 批，按“2.4.1”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項色譜條件下進樣測定，色譜圖見圖1，將其導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012 版）”軟件，采用自動匹配法生成共有模式對照圖譜，以S1 為參照，發(fā)現(xiàn)6個共有峰，按保留時間先后依次編號1～6（圖2）。經(jīng)與對照品溶液對比，確定3號峰為知母皂苷BⅡ，4號峰為桔梗皂苷D，6號峰為黃芪甲苷，其中4號峰響應值較高，分離度較好，保留時間相對穩(wěn)定，故選擇其作為參照峰。

圖2 15 批樣品HPLC?ELSD 特征指紋圖譜Fig.2 HPLC?ELSD characteristic fingerprints of fifteen batches of samples

保留時間窗口設定為0.5 min，采用多點校正后進行自動匹配，測得15 批樣品與對照指紋圖譜的相似度分別為0.911、0.962、0.983、0.960、0.963、0.976、0.956、0.942、0.940、0.940、0.950、0.982、0.964、0.966、0.935，表明各成分比較穩(wěn)定，對照指紋圖譜具有很好的代表性。

由圖1 可知，2號、3號（知母皂苷BⅡ）、5號峰歸屬于知母，4號（桔梗皂苷D）峰歸屬于桔梗，6號峰歸屬于黃芪，以4號峰為參照，計算6個共有峰相對峰面積，見表2，并計算其相對保留時間，見表3。由此可知，各共有峰相對保留時間RSD 均小于0.49%，表明對照指紋圖譜穩(wěn)定可靠，可反映標準煎液中各藥味化學特征。

表2 15 批樣品共有峰相對峰面積Tab.2 Relative peak areas of common peaks of fifteen batches of samples

表3 15 批樣品共有峰相對保留時間Tab.3 Relative retention time of common peaks of fifteen batches of samples

2.7 各成分含量測定

2.7.1 線性關系考察 吸取黃芪甲苷對照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，知母皂苷BⅡ對照品溶液2.5、5、7.5、10、12.5、15 μL，桔梗皂苷D 對照品溶液1、2、5、10、15、20、25 μL，分別在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項色譜條件下進樣測定。以各成分峰面積對數(shù)為縱坐標（Y），進樣量對數(shù)為橫坐標（X）進行回歸，結果見表4，可知各成分在各自范圍內線性關系良好。

表4 各成分線性關系Tab.4 Linear relationships of various constituents

2.7.2 精密度試驗 取升陷湯物質基準（S1），分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項色譜條件下各進樣測定6 次，測得黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 峰面積RSD分別為0.26%、0.42%、0.31%，表明儀器精密度良好。

2.7.3 重復性試驗 取升陷湯物質基準（S1），分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項下方法制備供試品溶液各6 份，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項色譜條件下進樣測定，測得黃芪甲苷、知母皂苷B Ⅱ、桔梗皂苷D含量RSD分別為0.63%、1.16%、0.59%，表明該方法重復性良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗 取升陷湯物質基準（S1），分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項下方法制備供試品溶液，于0、3、6、9、12、15、18、21、24 h 在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項色譜條件下進樣測定，測得黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 峰面積RSD分別為0.85%、1.28%、0.74%，表明溶液在24 h 內穩(wěn)定性良好。

2.7.5 加樣回收率試驗 取升陷湯物質基準（S1），分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項下方法制備供試品溶液，精密加入含黃芪甲苷0.484 8 mg／mL、知母皂苷BⅡ0.498 0 mg／mL、桔梗皂苷D 0.499 7 mg／mL的對照品溶液1、4、1 mL，計算回收率。結果，黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 平均加樣回收率分別為95.64%、103.42%、97.42%，RSD分別為1.82%、3.34%、2.06%。

2.8 結果 取15 批升陷湯物質基準，分別按“2.4.3”“2.4.4”“2.4.5”項下方法制備供試品溶液，在“2.2.2”“2.2.3”“2.2.4”項色譜條件下進樣測定，計算含量，結果見表5，色譜圖見圖3。

圖3 各成分HPLC 色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of various constituents

表5 各成分含量測定結果Tab.5 Results of content determination of various constituents

2.9 理化指標測定 取15 批標準煎液及缺相應藥材的陰性煎液，采用電導儀及實驗室pH 計趁熱（50～70 ℃）測定總溶解固體（TDS）、鹽度、電導率、pH值、電位，結果見表6，可知各批樣品物質基準理化指標差異不大，較為一致。因此，可通過理化指標監(jiān)測對升陷湯標準煎液的一致性進行判斷，要求各數(shù)值應在表4 范圍內波動，從而實現(xiàn)對該方物質基準制備過程的質量監(jiān)控。

除加水量以全處方計外，按“2.1”項下方法制備缺相應藥材的陰性煎液，測定理化指標，結果見表7。由此可知，當煎法錯誤時，TDS、鹽度、電導率與表6 相比有明顯差異，故測定理化指標可迅速對升陷湯物質基準質量進行判斷，并為該方后期中間體、制劑制備及工業(yè)化大生產(chǎn)提供在線監(jiān)測的質量研究思路，并且操作者可立即發(fā)現(xiàn)問題，從而減少煎錯藥、少煎藥的風險。

表6 15 批樣品理化指標測定結果Tab.6 Results of physical and chemical index determination of fifteen batches of samples

3 討論

物質基準的指紋圖譜信息是經(jīng)典名方開發(fā)過程中主要成分遷移的重要表達［5］，主要特點是突出該品種與其他品種不同的特異性成分。研究表明，黃芪中黃芪甲苷可抑制哮喘發(fā)展和嚴重程度［6］、保護損傷心肌細胞［7］；對知母的考察主要集中在知母皂苷BⅡ及芒果苷、新芒果苷等成分，其中知母皂苷BⅡ具有一定促血管新生、修復受損血管的作用［8］，芒果苷可抑制缺氧復氧損傷所造成的心肌細胞活力下降及細胞凋亡［9］；桔梗中桔梗皂苷D具有明顯的鎮(zhèn)痛、抑制癌細胞作用［10?11］；柴胡中主要化學成分為皂苷類，以柴胡皂苷a、d 為代表；升麻主要含有環(huán)阿爾廷型三萜皂苷、酚酸類等成分，阿魏酸、異阿魏酸是其潛在活性物質［12?13］。另外，黃芪甲苷、知母皂苷BⅡ、桔梗皂苷D 無紫外吸收，需采用蒸發(fā)光檢測器，而芒果苷、柴胡皂苷a、柴胡皂苷d、異阿魏酸需采用紫外檢測器，并且檢測波長集中在210、260 nm。

《醫(yī)學衷中參西錄》 中黃芪、知母同用的方劑共18 首，張錫純將兩者相互作用描述為“黃芪性稍熱，故以知母之涼潤者濟之”，凸顯出復方配伍的重要性，而對使藥桔梗的作用描述為“藥中之舟楫，能載諸藥之力上達胸中，故用之為向導也”。依據(jù)君臣佐使配伍原則及指標成分檢測條件，本實驗首先建立以黃芪、知母、桔梗為主要代表的升陷湯標準煎液HPLC?ELSD 特征圖譜。

電導率是用來描述物質中電荷流動難易程度的參數(shù)，而純水無電導率，在升陷湯煎煮過程中皂苷、黃酮、多糖、無機鹽等成分透過細胞壁向水中擴散，由此產(chǎn)生信號［14?15］。由于方中桔梗、升麻中含有較多的酚酸類物質，故其pH 呈弱酸性。TDS 是指1 L 水中能溶解的溶解性固體量，其數(shù)值越高，表明水中溶解物越多。本實驗通過檢測TDS、電導率、電位、pH值等理化指標可實現(xiàn)升陷湯物質基準的質量在線監(jiān)控，并能為其他復方制劑質量及制藥過程的一致性評價提供研究思路。