王紅敏 郭 瑛(北京市垂楊柳醫(yī)院,北京100022)
結(jié)腸癌是一種臨床常見消化系統(tǒng)的惡性腫瘤,隨著近些年人們生活水平的逐漸提高以及人類飲食結(jié)構(gòu)的改變,結(jié)腸癌的發(fā)生率、死亡率均明顯升高,在消化系統(tǒng)惡性腫瘤中,結(jié)腸癌的發(fā)病率已躍居第三位,且該病的5年生存率僅為50%[1-2]。目前,對于結(jié)腸癌的治療,臨床主要有手術(shù)、化療、放療及分子靶向治療等方式,隨著腫瘤及免疫學(xué)研究進展,有望發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌新的治療措施[3]。IL-33是近年發(fā)現(xiàn)的IL-1家族的一種新成員,由于其最早發(fā)現(xiàn)于小靜脈高壁內(nèi)皮細胞,所以又稱為“高壁內(nèi)皮細胞來源的核因子”[4]。有研究證實在多種慢性炎癥發(fā)病過程中,IL-33表達明顯增強,在多種惡性腫瘤(如卵巢癌、肺癌、乳腺癌及結(jié)腸癌等)的發(fā)病過程中,IL-33也高度表達,在腫瘤的臨床診斷及評估預(yù)后中也是重要標志物,同時還有研究人員發(fā)現(xiàn)IL-33在抗腫瘤反應(yīng)中起誘導(dǎo)作用,可稱為新的抗腫瘤抑制劑[5-7]??梢?,IL-33是一種雙功能蛋白,既是一種誘發(fā)炎癥反應(yīng)的細胞因子,又是可調(diào)控轉(zhuǎn)錄的細胞核因子[8]。本次研究的目的在于探討結(jié)腸癌患者其外周血內(nèi)IL-33水平及其相關(guān)的臨床意義。
1.1 資料 納入2016年1月至2017年12月我院收入治療的結(jié)腸癌患者進行研究。納入標準:患者經(jīng)臨床病理診斷后確診是結(jié)腸惡性腫瘤,病理類型均為結(jié)腸腺癌;患者既往無神經(jīng)系統(tǒng)疾病、嚴重的器質(zhì)性疾病及心理精神等疾病。排除標準:結(jié)腸惡性腫瘤的病理類型屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或其他類型,不屬于結(jié)腸腺癌的患者;出現(xiàn)嚴重的肝腎功能損傷或機體內(nèi)環(huán)境紊亂者;近期曾服用精神類藥品或?qū)λ幬镉羞^度依賴者;研究過程中自動退出者。根據(jù)上述標準,共納入110例結(jié)腸腺癌患者作為觀察組,同時選擇同期來我院健康體檢的100名成年人作為對照組。本研究已通過我院醫(yī)學(xué)倫理委員會的審議,患者及其家屬簽署本次研究知情同意書。
1.2 方法
1.2.1 實驗分組 收集兩組成員基本臨床資料(性別、年齡等),觀察組按照Ducks癌癥分期標準,A~B期63例,C~D期47例;根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟及美國癌癥聯(lián)合委員會制定的癌癥TNM分期標準,Ⅰ~Ⅱ期52例,Ⅲ~Ⅳ期58例;有淋巴轉(zhuǎn)移者49例,無淋巴轉(zhuǎn)移者61例。根據(jù)觀察組結(jié)腸腺癌的分化程度進行分級,若腺上皮細胞呈管狀/乳頭狀排列,且未見明顯的異性細胞,核分裂較少,為高分化(29例),若腫瘤細胞的排列呈實質(zhì)狀/片狀,僅見灶性的腺樣組織結(jié)構(gòu),見明顯的異性細胞、核分裂較多且有壞死,為低分化(37例),介于以上兩種分化程度的為中分化(44例)。觀察組分為3個亞組,即高分化組29例、中分化組44例、低分化組37例。
1.2.2 ELISA和免疫組化實驗檢測IL-33水平及IL-33、IFN-γ、IL-4表達的數(shù)目 抽取觀察組與對照組的空腹靜脈血各5 ml,采用ELISA檢測外周血中IL-33水平。觀察組接受手術(shù)切除治療,術(shù)中切取腫瘤病理組織,制作切片并分別進行免疫組化染色,染色后進行封片,在顯微鏡下觀察,以500個細胞為1個計數(shù)單位,記錄其中IL-33、IFN-γ、IL-4呈陽性表達的數(shù)目。在結(jié)腸癌的腫瘤組織內(nèi),上述幾種細胞因子呈陽性的細胞主要在細胞質(zhì)內(nèi)表達,呈現(xiàn)淺黃色或者棕黃色。具體計分標準:細胞未染色者為0分,細胞呈較少的淡黃色為1分,細胞呈較多的棕黃色為2分,細胞呈大量的深棕色為3分。在顯微鏡下觀察時,每500個細胞視野內(nèi),染色細胞數(shù)<30%者記1分,30%≤染色細胞數(shù)<76%者記2分,染色細胞數(shù)≥76%者記3分。以上兩項得分相乘,0分者為“-”,1~4分者為“+”,大于4分者為“++”,“-”為IL-33陰性,“+”及“++”為IL-33陽性。
1.2.3 觀察組患者術(shù)后隨訪 對觀察組患者術(shù)后進行為期2年的隨訪,統(tǒng)計觀察組患者不同TNM分期術(shù)后2年的死亡率,對影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的因素進行Logistic回歸分析。
1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 本項研究中的相關(guān)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS22.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理及分析。經(jīng)檢測,本研究中所有計量資料均符合正態(tài)分布,計量資料以±s的形式表示,比較時使用t檢驗法;計數(shù)資料進行比較采用χ2,多因素回歸分析使用Logistic法,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
2.1 比較兩組患者的臨床相關(guān)資料及血清IL-33水平 兩組患者性別、年齡均差異無統(tǒng)計學(xué)差異(P>0.05),觀察組血清IL-33水平為(44.23±11.31)pg/ml,明顯高于對照組(28.35±7.86)pg/ml,P=0.000,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義,見表1。
表1 兩組患者的臨床相關(guān)資料及血清IL-33水平(±s)Tab.1 Clinical data and serum IL-33 level were compared between two groups(±s)
表1 兩組患者的臨床相關(guān)資料及血清IL-33水平(±s)Tab.1 Clinical data and serum IL-33 level were compared between two groups(±s)
Groups Observation Control t/χ2 P n 110 100 Gender(male/female)56/54 52/58 0.291 0.590 Age(year)57.28±6.55 58.71±6.39 1.590 0.111 IL-33(pg/ml)44.23±11.31 28.35±7.86 11.703 0.000
2.2 比較觀察組血清IL-33水平與結(jié)腸腺癌臨床病理特征相關(guān)性 觀察組血清IL-33水平與患者的年齡、性別無關(guān),與腫瘤病理分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān),T3~4期的IL-33水平明顯高于T1~2期(P<0.05),TNMⅢ~Ⅳ期的IL-33水平明顯高于Ⅰ~Ⅱ期(P<0.05),有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的IL-33水平明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P<0.05),見表2。
表2 觀察組血清IL-33水平與結(jié)腸腺癌臨床病理特征相關(guān)性(±s)Tab.2 Correlation between serum IL-33 level and clinicopathological characteristics of colon adenocarcinoma in observation group(±s)
表2 觀察組血清IL-33水平與結(jié)腸腺癌臨床病理特征相關(guān)性(±s)Tab.2 Correlation between serum IL-33 level and clinicopathological characteristics of colon adenocarcinoma in observation group(±s)
Clinicopathological characteristics Age(year)<60≥60 Gender Male Female Tstage T1~2 T3~4 TNMstageⅠ~ⅡⅢ~ⅣLymph node metastasis Yes No n 48 62 56 54 59 51 52 58 49 61 IL-33(pg/ml)45.48±9.16 42.34±8.24 48.32±8.71 46.05±8.63 38.18±7.62 45.35±8.44 40.31±9.17 46.47±8.62 45.88±5.92 43.19±6.27 t 1.888 1.373 4.682 3.631 2.307 P 0.062 0.173 0.000 0.000 0.023
2.3 免疫組化檢測觀察組不同病理特征患者IL-33表達水平 免疫組化法檢測觀察組腫瘤組織IL-33陽性表達細胞數(shù),發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度較低、臨床分期較高的患者腫瘤組織中IL-33陽性表達數(shù)目較高,見表3。
表3 免疫組化檢測觀察組不同病理特征患者IL-33表達水平(±s)Tab.3 Expression levels of IL-33 in patients with different pathological characteristics were detected by immunohistochemistry(±s)
表3 免疫組化檢測觀察組不同病理特征患者IL-33表達水平(±s)Tab.3 Expression levels of IL-33 in patients with different pathological characteristics were detected by immunohistochemistry(±s)
Note:Compared with high differentiated tumors,1)P<0.05;compared with low differentiated tumors,2)P<0.05.
Pathological characteristics Degreeof tumor differentiation Low differentiation Moderatedifferentiation High differentiation Tstage T1~2 T3~4 Nstage N0 N1~2 TNMstageⅠ~ⅡⅢ~Ⅳn 37 44 29 59 51 67 43 52 58 IL-33 positive cell number 4.94±2.31 3.19±2.11 2.15±1.39 2.45±1.62 4.17±2.37 2.11±1.70 3.99±.23 2.47±1.72 4.27±2.14 t 5.736 2.338 4.492 5.002 4.731 P 0.0002)0.0001)0.000 0.000 0.000
2.4 免疫組化檢測觀察組3個亞組IL-33、IL-4、IFN-γ表達水平比較 觀察組3個亞組中IL-33、IL-4表達水平為低分化組>中分化組>高分化組(P<0.05),IFN-γ表達水平無明顯差異(P>0.05),見表4。
表4 免疫組化檢測觀察組3個亞組IL-33、IL-4、IFN-γ表達水平比較(±s)Tab.4 Comparison of expression levels of IL-33,IL-4 and IFN-γin three subgroups of observation group by immunohistochemistry(±s)
表4 免疫組化檢測觀察組3個亞組IL-33、IL-4、IFN-γ表達水平比較(±s)Tab.4 Comparison of expression levels of IL-33,IL-4 and IFN-γin three subgroups of observation group by immunohistochemistry(±s)
Note:Compared with high differentiated tumors,1)P<0.05;compared with low differentiated tumors,2)P<0.05.
Groups Low differentiation Moderate differentiation High differentiation n 37 44 29 IL-33 positive cell number 4.94±2.311)3.19±2.112)2.15±1.39 IL-4 positive cell number 10.84±2.02 1)8.36±1.80 2)6.02±1.05 IFN-γpositive cell number 24.81±5.43 24.66±4.80 25.40±5.61
2.5 術(shù)后2年隨訪并統(tǒng)計觀察組患者死亡率 術(shù)后2年隨訪發(fā)現(xiàn),觀察組腫瘤組織病理分期越高的死亡率越高,見表5。
表5 術(shù)后2年隨訪并統(tǒng)計觀察組結(jié)腸腺癌患者死亡率[例(%)]Tab.5 Mortality rate of patientswith colorectal adenocarcinoma in observation group was statistically analyzed after 2 years of follow-up[n(%)]
2.6 影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的多因素回歸分析Logistic多因素回歸分析,IL-33水平是影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的獨立危險因素,見表6。
表6 影響結(jié)腸腺癌患者預(yù)后的多因素回歸分析Tab.6 Multivariate regression analysisof prognosis in patients with colon adenocarcinoma
IL-1家族新成員IL-33在巨噬細胞、上皮細胞、肥大細胞及內(nèi)皮細胞等多種細胞中均可表達,當機體細胞受損時會有大量IL-33生成,IL-33亦稱“警戒素”,在多種慢性炎癥,如關(guān)節(jié)炎、結(jié)腸炎、哮喘等發(fā)病過程中大量表達[9]。由于細胞類型的差別,IL-33可誘發(fā)多種炎癥反應(yīng),如IL-33誘導(dǎo)機體肥大細胞產(chǎn)生IL-4、IL-5、IL-6等多種細胞因子,誘導(dǎo)Th2淋巴細胞生成IL-5和IL-13等細胞因子[10-11]。大量研究證實,機體慢性炎癥與腫瘤的發(fā)病具有相關(guān)性,在腫瘤發(fā)生的炎癥微環(huán)境中,IL-33是主要成分并可進一步誘發(fā)腫瘤[12-13]。有研究人員在乳腺癌動物模型中發(fā)現(xiàn)IL-33誘導(dǎo)IL-10、IL-13及調(diào)節(jié)性T細胞(Treg)的生成,加重腫瘤的發(fā)展浸潤[14];在胃癌動物模型中,IL-33增加IL-6及金屬蛋白酶(MMP-3)的分泌,誘發(fā)癌細胞浸潤轉(zhuǎn)移[15]。
本研究對比結(jié)腸癌患者與健康人血清中IL-33水平,發(fā)現(xiàn)IL-33在結(jié)腸癌患者中表達明顯升高;血清IL-33水平在不同年齡、不同性別的結(jié)腸癌患者之間無顯著差異;根據(jù)結(jié)腸癌患者腫瘤分化程度及TNM分期不同,進一步比較亞組患者血清中IL-33水平,發(fā)現(xiàn)腫瘤分化程度較低、臨床病理分期較高的患者血清IL-33明顯升高。免疫組化法對觀察組結(jié)腸癌患者的腫瘤組織進行檢測,發(fā)現(xiàn)隨著結(jié)腸癌患者腫瘤組織的分化程度降低、臨床病理分期較高的患者腫瘤組織中IL-33陽性表達數(shù)目較高。術(shù)后2年隨訪發(fā)現(xiàn),腫瘤組織病理分期較高的死亡率隨之增高。
惡性腫瘤的發(fā)生與機體免疫系統(tǒng)Th1/Th2細胞失衡有關(guān),腫瘤細胞的分化可抑制Th1型細胞因子的分泌、促進Th2型細胞因子的生成,導(dǎo)致免疫逃逸及Th1/Th2失衡[16]。關(guān)于IL-33在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮作用的相關(guān)研究,發(fā)現(xiàn)IL-33是促進Th2型細胞因子生成的誘導(dǎo)劑,IL-33可抑制鈣黏蛋白在腫瘤細胞間的表達,并對腫瘤血管內(nèi)皮細胞分化、增殖具有較強的刺激作用,促進血管的形成[17-18]。ST2是一種在Th2細胞中大量表達的IL-33受體,有研究發(fā)現(xiàn)IL-33由IL-33/ST2L信號通路誘導(dǎo)惡性腫瘤的發(fā)生,同時激活自然殺傷性細胞相關(guān)通路、促進Th2型細胞因子的表達[19-20]。Th1型細胞因子主要有IFNγ、IL-12,Th2型細胞因子主要有IL-4、IL-10等。為進一步研究和探討IL-33引發(fā)結(jié)腸癌的免疫學(xué)機制,本研究發(fā)現(xiàn),IL-33、IL-4表達水平隨觀察組患者分化程度的不同而有明顯差異,IL-33、IL-4表達水平為低分化組>中分化組>高分化組??梢姡只潭仍降偷慕Y(jié)腸癌患者,IL-33、IL-4表達水平越高,IL-33促進Th2型細胞因子的分泌及Th1/Th2失衡,與前人研究一致。
綜上,本研究發(fā)現(xiàn)在結(jié)腸癌患者外周血中IL-33水平明顯升高,IL-33與結(jié)腸癌病情程度呈正相關(guān),IL-33的檢測對結(jié)腸癌的診斷具有積極意義,但是,近年隨著對IL-33研究的深入,發(fā)現(xiàn)IL-33能誘導(dǎo)機體CD8+T細胞分泌IFN-γ,提高機體免疫應(yīng)答反應(yīng),對腫瘤的監(jiān)測及抑制具有積極作用,有學(xué)者在肺癌動物模型體內(nèi)發(fā)現(xiàn)IL-33的表達能抑制腫瘤細胞的生長及轉(zhuǎn)移[19-20]。關(guān)于IL-33在腫瘤中作用的相關(guān)研究目前尚未有定論,在不同的腫瘤組織中,IL-33發(fā)揮的作用不同,仍有待進一步的研究。