C3a及C5a在45例兒童紫癜性腎炎診斷中的應用價值①

徐閃閃 王 龍 李雪軍 高 敏 張 霞 丁 櫻（河南中醫(yī)藥大學研究生處，鄭州450000）

紫癜性腎炎（henoch-sch?nlein purpura nephritis，HSPN）是繼發(fā)于過敏性紫癜的腎小球疾病，多發(fā)于兒童時期，其中90%的患兒年齡在10歲以下，臨床表現主要以血尿和（或）蛋白尿為特征［1］。過敏性紫癜（henoch-sch?nlein purpura，HSP）的發(fā)病率為（3～27例）/10萬［2-3］，且逐年呈升高的趨勢，其中約30%～50%的患兒發(fā)展為HSPN［4］，大部分患兒預后良好，但仍有20%的患兒出現腎功能不全甚至發(fā)展為終末期腎衰竭，威脅患兒生命健康［5］。腎臟受累的嚴重程度影響著遠期預后，故及時評估腎臟的病理變化情況，對采取規(guī)范的治療及改善遠期預后至關重要。目前，腎臟穿刺是評估腎臟病變的公認標準，但其是一項創(chuàng)傷性操作，有潛在風險，多數情況下不能被患者家屬接受，腎臟穿刺技能要求嚴格，基層醫(yī)院鮮有具備腎臟穿刺操作的條件，因此尋找安全、無創(chuàng)及便捷的方法評估HSPN的病情變化是國內外學者研究的熱點及難點。

HSPN的發(fā)生、發(fā)展與免疫、環(huán)境、遺傳及細胞因子、炎性介質等多種因素有關，其中補體系統活化是非常重要的因素。補體系統是人體固有免疫不可或缺的成分，除參與機體防御反應和維持內環(huán)境穩(wěn)定外，也是介導組織損傷和細胞免疫的橋梁，與多種腎臟疾病的發(fā)生、發(fā)展相關［6-7］。研究發(fā)現IgAN患者血漿中C3a的水平高于健康人，且與IgAN的活動及嚴重程度相關［8］，在HSPN患者的腎臟及血清中同樣檢測到C3a、C5b-9、B因子等補體因子［9-10］，而C3a、C5a作為補體系統激活釋放的小分子產物，是促炎的主要介質，需要與特應性受體C3aR及C5aR結合而發(fā)揮作用，但其在HSPN診斷價值中的研究較少。

本研究擬比較HSPN患兒急性期與恢復期血清中C3a及C5a的水平，并分析與24 h尿蛋白定量、肌酐及腎臟病理的相關性，以探討C3a及C5a在HSPN診斷中的價值。

1 資料與方法

1.1 資料 本研究為單中心前瞻性臨床對照研究，選擇2018年5月至2018年12月河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院兒科腎臟病區(qū)住院的45例HSPN患兒、15例HSP患兒及同期體檢的15例健康兒童作為研究對象，本研究經河南中醫(yī)藥大學倫理委員會批準。健康兒童15例，男孩9例，女孩7例，平均年齡（8.59±2.60）歲，平均體重（32.40±9.43）kg；HSP患兒15例，男孩8例，女孩7例，平均年齡（8.35±2.34）歲，平均體重（32.00±11.96）kg；HSPN患兒45例，男孩30例，女孩15例，平均年齡（9.00±2.35）歲，平均體重（34.47±14.01）kg，3組兒童在性別、年齡、體重上差異無統計學意義（P＞0.05）。HSPN患兒中有22例行腎臟穿刺術，其中病理類型Ⅱa級4例，Ⅱb級2例，Ⅲa級13例，Ⅲb級3例。

1.2 方法

1.2.1 納排標準 納入標準：①所有的HSPN患兒及HSP患兒均符合歐洲風濕病聯盟（EULAR）制定的診斷標準；②年齡在2～18歲；③尿常規(guī)異常出現1周以上，病程不超過2個月；④針對尿檢異常未使用過激素及雷公藤多苷片、CTX等免疫抑制劑；⑤患兒的監(jiān)護人已同意并簽署參與試驗的知情同意書。排除標準：①臨床診斷中發(fā)現除腎臟損傷以外的其他臨床表現；②雖符合臨床診斷標準，但其監(jiān)護人未同意參與本次試驗的患兒。

1.2.2 腎臟病理分級 腎臟的病理分級是根據國際腎臟疾病分類研究（ISKDC）病理學家推薦，分為6級，具體如下：Ⅰ級，微小改變；Ⅱ級，單純系膜增生；Ⅲ級，系膜增生伴新月形/節(jié)段性病變（硬化、黏連、血栓形成）＜50%的腎小球；Ⅳ級，50%～75%的腎小球系膜增生伴新月形/節(jié)段性病變（與Ⅲ相同）；Ⅴ級，75%以上的腎小球系膜增生伴新月形/節(jié)段性病變（與Ⅲ相同）；Ⅵ級，膜增生樣病變。

1.2.3 數據采集 HSPN患兒急性期為入院后進行治療前即0周，恢復期為進行治療12周后停藥。采集所有入組兒童的年齡、性別、體重及HSPN患兒尿常規(guī)、24 h尿蛋白定量、腎臟病理類型等臨床數據。尿常規(guī)及尿蛋白定量由醫(yī)院兒科實驗室進行檢測，腎臟病理由兒科腎臟病理室進行檢測。收集健康兒童、HSP患兒及HSPN患兒0周與12周的空腹靜脈血，室溫下靜置1 h，3 000 r/min離心10 min，提取血清，標記后在-80℃冰箱里冷藏備用，使用酶聯免疫檢測試劑盒（武漢伊萊瑞特公司）檢測血清中C3a及C5a的濃度，其中酶聯免疫檢測嚴格按照試劑盒說明書中的操作進行。

1.3 統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行統計分析。計量資料以±s表示，組間比較采用t檢驗。非正態(tài)分布資料以中位數（最小值～最大值）表示，組間比較采用秩和檢驗。使用ROC曲線評價診斷指標的敏感度和特異度。計數資料采用χ2檢驗比較。P＜0.05為差異有統計學意義。采用Pearson分析血清中C3a及C5a的水平與24 h尿蛋白定量的相關性，采用Spearman分析血清中C3a及C5a的水平與腎臟病理的相關性。

2 結果

2.1 3組兒童血清中的C3a和C5a水平比較 與健康兒童及HSP患兒相比，HSPN患兒血清中C3a水平差異有統計學意義（P＜0.01），健康兒童與HSP患兒血清中C3a水平差異有統計學意義（P＜0.01）；與健康兒童及HSP患兒相比，HSPN患兒血清中C5a水平差異有顯著統計學意義（P＜0.01），健康兒童與HSP患兒血清中C5a水平差異有統計學意義（P＜0.05）。說明HSPN患兒體內存在著補體系統的激活，且血清中的C3a與C5a與腎臟損傷有關，具體見表1。

表1 3組兒童血清中C3a及C5a水平的比較（±s）Tab.1 Comparison of serum C3a and C5a levels among threegroups of children（±s）

表1 3組兒童血清中C3a及C5a水平的比較（±s）Tab.1 Comparison of serum C3a and C5a levels among threegroups of children（±s）

Note：Compared with healthy and HSP，1）P＜0.01；compared with healthy，2）P＜0.001；compared with healthy，3）P＜0.05.

Index C3a（pg/ml）C5a（ng/ml）Healthy 3 862.63±586.67 34 495.59±18 630.28 HSP 7 258.59±2 234.442）60 581.93±33 608.233）HSPN 9 590.87±2 742.581）89 244.82±33 254.491）

2.2 HSPN患兒急性期與恢復期血清中C3a和C5a水平的比較 本實驗檢測了HSPN患兒急性期及恢復期血清中C3a及C5a水平，在急性期（治療前）血清中C3a及C5a的水平顯著高于恢復期（治療12周后），差異有統計學意義（P＜0.001），說明血清中的C3a及C5a的水平與疾病的活動性相關，具體見表2。

表2 HSPN患兒急性期與恢復期血清中C3a與C5a水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of serum C3a and C5a levels in children with HSPN during acute phase and recovery phase（±s）

表2 HSPN患兒急性期與恢復期血清中C3a與C5a水平的比較（±s）Tab.2 Comparison of serum C3a and C5a levels in children with HSPN during acute phase and recovery phase（±s）

Index C3a（pg/ml）C5a（ng/ml）Acutephase 9 590.87±2 742.58 89 244.82±33 254.49 Recovery phase 3 427.34±981.12 27 010.25±18 276.64 T 15.65 10.13 P 0.000 1 0.000 1

2.3 HSPN患兒急性期血清中C3a和C5a與24 h尿蛋白定量的相關性 HSPN患兒急性期血清中C3a的水平與24 h尿蛋白定量呈正相關，相關系數為0.37，且P＜0.05，C5a的水平與24 h尿蛋白定量不相關，表明HSPN患兒血清中C3a的水平與尿蛋白排泄有關，具體見圖1、2。

圖1 血清中C3a與24 h尿蛋白定量散點圖Fig.1 Quantitative scatter plot of serum C3a and 24 h urine protein

2.4 HSPN患兒血清中C3a和C5a與肌酐的相關性 HSPN患兒急性期血清中C3a和C5a的水平與血肌酐不相關，表明HSPN患兒體內存在補體系統的整體激活和局部激活，且局部激活占主要作用，具體見圖3、4。

圖2 血清C5a與24 h尿蛋白定量散點圖Fig.2 Quantitative scatter plot of serum C5a and 24 h urine protein

圖4 血清C5a與血肌酐散點圖Fig.4 Scatter plot of serum C5a and serum creatinine

2.5 HSPN患兒血清中C3a和C5a與腎臟病理的相關性 45例HSPN患兒有22例行腎臟穿刺術，經Sperman檢驗腎臟穿刺患兒的血清中C3a和C5a的水平與腎臟病理等級呈正相關，相關系數分別為0.858及0.502，且P＜0.05，說明血清中C3a及C5a的水平可能與腎臟病理相關。

2.6 C3a和C5a檢測HSPN的敏感性及特異性C3a診斷HSPN的敏感性為0.822，特異性為0.722，ROC曲線下面積為0.897，截點為7 621.94 ng/ml；C5a診斷HSPN的敏感性為0.756，特異性為0.611，ROC曲線下面積為0.835，截點為73 423 pg/ml，C3a聯合C5a診斷HSPN的敏感性為0.822，特異性為0.867，ROC曲線下面積為0.909。見圖5。

圖5 C3a、C5a診斷HSPN的特異性及敏感性Fig.5 Specificity and sensitivity of C3a and C5a in diagnosis of HSPN

3 討論

HSPN又稱IgAVN，病理表現為IgA為主免疫復合物在系膜區(qū)沉積，伴有補體因子及大量中性粒細胞的浸潤，臨床表現為血尿和（或）蛋白尿，伴有腎外小血管炎性病變?yōu)橹?。HSPN的發(fā)病機制目前尚不明確，但補體系統激活參與了HSPN的發(fā)病及發(fā)展。補體系統作為先天免疫的一部分而發(fā)揮作用，補體激活后產生炎癥因子、趨化因子，促使中性粒細胞趨化和單核細胞產生蛋白酶、氧自由基和花生四烯酸代謝產物，而單核細胞的吞噬功能使得腎小球基膜降解、細胞受損以及腎小球濾過率降低，從而導致腎臟損傷［11-12］。在腎臟疾病患者的血液、尿液及腎組織中能檢測到各類補體成分［13-14］。

補體系統的激活有3條途徑，即經典途徑、旁路途徑和凝集素途徑［15-16］。經典途徑由與抗原結合的IgM或IgG引發(fā)，抗原抗體復合物結合C1q，通過裂解C4和C2，形成C3轉化酶（C4b2b）；凝集素途徑是由細菌直接結合甘露聚糖凝集素（MBL）啟動，病原微生物感染機體后，誘導機體產生MBL并與相關絲氨酸蛋白酶1和2（MASP1和MASP2）結合，進而裂解C4和C2，最終形成與經典途徑相同的C3轉化酶C4b2b，這種補體激活機制可在凋亡或壞死組織激活補體中起重要作用，并加重IgA介導的腎臟損傷［17］；替代激活途徑既不需要抗原-抗體復合物，也不需要激活C1、C2和C4，補體C3自發(fā)水解后形成C3（H2O）Bb，進而結合B因子，在D因子的酶解作用下形成C3轉化酶（C3bBb）。

C3是3條途徑的共同匯聚點，補體系統被激活后，以C3轉化酶為核心依次產生C3a、C5a及膜攻擊復合物（MAC），從而導致靶細胞溶解。研究發(fā)現C3a能夠激活內皮細胞，從而上調血管細胞黏附分子-1（VCAM-1）和細胞間黏附分子-1（ICAM-1）的表達［18］。C5a的作用比C3a更強烈，能夠促進IL-1、IL-6、IL-17及TNF-α等炎癥因子的釋放，損傷內皮細胞，參與HSPN患兒急性期的炎癥反應［19］。

YANG等［20］研究發(fā)現30例HSP患者急性期血清中C3a及C5a的水平高于健康兒童，恢復期出現下降，30例HSP患者中僅有6例出現腎臟損害，但未對HSPN與HSP非腎臟損害患者血清中C3a與C5a的水平進行比較。本研究首次將HSPN患兒與HSP非腎臟損傷的患兒血清中C3a及C5a的水平進行比較，以驗證血清中C3a及C5a是否參與了腎臟的損傷，研究發(fā)現HSP患者存在補體系統的激活，且C3a及C5a的水平可能與腎臟的損傷及病情活動相關。

ABOU-RAGHEB等［21］發(fā)現46名IgAN/HSPN患者血清中C3a的水平升高，且C3a的水平與血肌酐的水平相關，但與24 h尿蛋白排泄無關。有研究發(fā)現MBL的沉積與尿蛋白的排泄增加、肌酐升高及嚴重的組織學病理損害相關［22］。本研究對HSPN患兒血清中C3a和C5a的水平與24 h尿蛋白、肌酐及腎臟病理均做了相關性分析，結果發(fā)現HSPN患者血清中C3a與尿蛋白排泄相關，但與肌酐無關，而C5a的水平與尿蛋白及肌酐均不相關，行腎臟穿刺22例HSPN患者血清中C3a和C5a的水平與腎臟病理的分級相關。我們推測補體系統在腎臟局部均存在著異常激活，且局部激活對病情進展的誘導作用更大。血清中的C3a和C5a與相應受體結合而發(fā)揮作用，但全身循環(huán)中C3a和C5a的半衰期較短，補體系統局部的激活，可能直接損害相應的靶器官，而不是系統性的改變，補體系統沉積于腎臟，局部的激活從而導致相應的病理改變。

本研究存在一定的局限性：首先我們納入的標本量相對較少，尤其是腎臟穿刺的患者僅有22例，且腎臟病理以Ⅲa級為主，存在一定的選擇偏倚，且有限數量的患者限制了我們的進一步分析，也可能導致目前結果的偏差，我們需要多中心及更大數量的標本量來進一步研究HSPN中的補體激活機制。其次我們未對行腎穿患兒的腎臟組織中C3a和C5a的沉積進行檢測，僅分析了血清中C3a和C5a與腎臟病理的相關性，可能導致結果有一定的誤差，需要擴大樣本量完善腎臟組織中C3a和C5a沉積的檢測，以進一步證實C3a和C5a在HSPN診斷中的應用價值。

目前我們的研究表明補體系統激活可能與HSPN的發(fā)病及疾病的嚴重程度相關，從而推測抑制補體激活可能有助于HSPN的治療。補體抑制藥的治療試驗對于確認補體激活是不是參與了病情的進展也很必要。目前補體抑制藥物依庫珠單抗已用于C3腎小球疾病，并取得了一定的成效［23］，但尚無使用依庫珠單抗治療HSPN的案例，后續(xù)我們可以試驗性使用依庫珠單抗治療難治性HSPN，希望能夠為HSPN患者帶來一種新的治療方案。如果補體激活參與HSPN的發(fā)病得到證實，補體激活片段可作為HSPN患者無創(chuàng)性、方便、靈活的監(jiān)測指標，同時阻斷其受體也可作為疾病的潛在治療靶點，為HSPN患者的治療提供新思路及依據。

綜上所述，補體激活的炎性小片段C3a和C5a可能參與了HSPN的發(fā)病，且與疾病的嚴重程度相關，可作為一種監(jiān)測病情的指標。