改良SELEX技術(shù)篩選福氏志賀菌2a特異性適配體①

王國(guó)臻 王玉格 蘭春陽(yáng) 李 翔 李明成 付桂蓮（北華大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院，吉林132013）

細(xì)菌性痢疾主要流行于衛(wèi)生條件較差的發(fā)展中國(guó)家，全世界每年的病例總數(shù)高達(dá)1.647億，死亡人數(shù)超過(guò)了60萬(wàn)人［1］，在發(fā)展中國(guó)家大多數(shù)細(xì)菌性痢疾由福氏志賀菌（占60%）引起，在我國(guó)最為流行的是福氏和宋內(nèi)志賀菌［2］，主要檢測(cè)方法有分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)及分子生物學(xué)等方法。這些方法存在靈敏度低、成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、操作繁瑣等缺點(diǎn)。因此建立一種快速、穩(wěn)定、高效、特異性高、價(jià)格低的檢測(cè)技術(shù)，對(duì)痢疾防治和臨床用藥都具有十分重要的意義［3］。

適配體是一種新型的分子識(shí)別元件，原理是基于指數(shù)富集技術(shù)（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）從隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)中篩選對(duì)靶物質(zhì)具有高親和性與高特異性的寡核苷酸序列單鏈DNA（ssDNA）或RNA［4］。與傳統(tǒng)抗體相比，適配體優(yōu)點(diǎn)是識(shí)別的靶分子范圍廣，可以與各種腫瘤細(xì)胞、細(xì)菌、蛋白質(zhì)多肽、金屬離子和病理切片等進(jìn)行結(jié)合識(shí)別；有較高的特異性和親和性；識(shí)別精細(xì)的抗原結(jié)構(gòu)，也可鑒別交叉抗原；易于修飾，可大量和快速在體外合成。篩選周期短、成本低，比起抗體的制備，尤其是單克隆抗體的制備，整體制備周期縮短了60%以上的時(shí)間［5］。全細(xì)菌消減SELEX技術(shù)（whole-bacteria SELEX）是一種以完整細(xì)菌為靶標(biāo)的篩選方法，經(jīng)過(guò)12～15輪的篩選，中間采用消減菌篩選技術(shù)，即用與其種屬相近、致病性相似的菌進(jìn)行反向篩選，增強(qiáng)其特異性。目前，全細(xì)菌SELEX技術(shù)已經(jīng)成功篩選出多種適配體，包括腸炎沙門氏菌、化膿性鏈球菌等適配體，實(shí)驗(yàn)證明適配體可顯著抑制細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞，發(fā)揮抗微生物感染的功效［6］。

本研究采用whole-bacteria SELEX技術(shù)制備福氏志賀菌2a特異性核酸適配體，在制備適配體過(guò)程中，首次應(yīng)用Lambda外切酶切割dsDNA獲得ssDNA，應(yīng)用Sephacryl凝膠層析技術(shù)將dsDNA、ssDNA和酶切碎片進(jìn)行分離，極大縮短適配體的制備時(shí)間，同時(shí)可有效提高核酸適配體的特異性。本研究建立的核酸適配體制備技術(shù)，為適配體的廣泛應(yīng)用起到示范推廣作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 福氏志賀菌2a（CICC：21534）由吉林市疾控中心提供；腸炎沙門氏菌（CICC：21482）、大腸埃希菌（ATCC：25922）購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection，CICC）；大腸埃希菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒GUPXT19-TVector購(gòu)自北京天根生化科技有限公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 1×結(jié)合緩沖液（Banding Buffer，BB；主要成分：Tris-base、酵母tRNA、牛血清白蛋白）購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；基因擴(kuò)增儀購(gòu)自蘇州東勝興業(yè)科學(xué)儀器有限公司；LB液體培養(yǎng)基購(gòu)自Sigma公司；高速冷凍離心機(jī)、分析天平購(gòu)自德國(guó)Sartorius公司；流式細(xì)胞儀購(gòu)自北京艾格斯生物科技有限公司；微量核酸分析儀購(gòu)自美國(guó)Quwell公司。

1.2 方法

1.2.1 核酸適配體初級(jí)文庫(kù)（ssDNA）的制備 福氏志賀菌2a核酸適配體初級(jí)文庫(kù)參考文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由Gene公司采用隨機(jī)引物合成法合成［7］。隨機(jī)ssDNA文庫(kù)全長(zhǎng)為76 nt，其兩端為固定引物序列，上游引物序列為5'-ATCCAGAGTGACGCAGCA-3'，下游引物為5'-TGGACACGGTGGCTTAGT-3'，中間為35個(gè)堿基的隨機(jī)序列。用BB稀釋至10 nmol/μl，配制成貯存液，使用時(shí)用雙蒸水進(jìn)行10倍稀釋。混勻后放入EP管中，95℃加熱5 min，置于冰上備用。

1.2.2 靶標(biāo)菌與消減菌的制備 分別挑取福氏志賀菌、大腸埃希菌、沙門菌接種到30 ml LB液體培養(yǎng)基中，置于37℃、50 r/min，振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期（A600=0.3），收集菌液，6 000 r/min離心5 min，棄上清，用1×BB洗滌沉淀3次，重懸于500μl BB中。

1.2.3 ssDNA文庫(kù)與福氏志賀菌2a細(xì)胞淘選 將制備好的適配體初級(jí)文庫(kù)與靶標(biāo)菌結(jié)合，設(shè)定反應(yīng)總體系為500μl，ssDNA文庫(kù)為2 nmol，細(xì)菌總量為107cfu/ml，37℃、180 r/min孵育1 h，3 500 r/min離心5 min，棄上清，用BB洗兩次。95℃熱變性10 min，立即冰浴10 min，4℃、8 000 r/min離心7 min，獲得的上清即為該輪篩選的產(chǎn)物。

1.2.4 PCR大量擴(kuò)增及條件優(yōu)化 通過(guò)梯度PCR擴(kuò)增上清液中的ssDNA，制備高純度dsDNA。設(shè)定PCR體系為12.5 ml（2×Taqmix 6.25 ml，上游引物0.5 ml，下游引物0.5 ml，去離子雙蒸水2.25 ml，模板3 ml），分別將模板進(jìn)行5×、10×、20×稀釋，循環(huán)數(shù)設(shè)定為6 cycle、8 cycle、10 cycle、12 cycle。最后放大PCR體系至100 ml，挑選在無(wú)污跡、無(wú)非特異性擴(kuò)增的優(yōu)化條件下產(chǎn)生的dsDNA，并在下游引物進(jìn)行磷酸標(biāo)記，用于外切酶的識(shí)別。

1.2.5 Lambda外切酶酶切及葡聚糖凝膠（Sephacryl）純化 利用Lambda外切酶可以識(shí)別下游引物5′端帶磷酸的dsDNA，將dsDNA切割成ssDNA。反應(yīng)體系及條件：Lambda外切酶2μl，去離子雙蒸水18μl，pH=9.4，37℃，10 min。制備葡聚糖凝膠層析柱，提前1 d用雙蒸水泡發(fā)好Sephacryl凝膠，按照長(zhǎng)度L與直徑D的比值（L/D=10），裝入層析柱中鋪勻，長(zhǎng)度L達(dá)到20 cm左右，用于PCR產(chǎn)物和酶切產(chǎn)物的純化。酶切產(chǎn)物上樣量200μl，間斷用去離子雙蒸水沖柱，加入上樣量2倍體積，2～3 s 1滴，1滴約為22μl，用96孔板收集，微量紫外分析儀檢測(cè)，繪制回收曲線。

1.2.6 次級(jí)ssDNAs文庫(kù)的制備 取12μg回收的ssDNA，醇沉，重懸于500μl BB中，置于95℃水浴10 min后，迅速置于冰上10 min，在4℃的條件下恢復(fù)其空間結(jié)構(gòu)，作為下一輪篩選的次級(jí)文庫(kù)。

1.2.7 消減菌的使用 分別在3、4、5輪加入腸炎沙門菌進(jìn)行反向篩選，6、7、8輪加入大埃希菌進(jìn)行反向篩選，消減菌保證了福氏志賀菌適配體的特異性。

1.2.8 克隆測(cè)序 將40μl X-gal和16μl IPTG 20 ml均勻的鋪在LB固體培養(yǎng)基上，將適配體連接到GU PXT19-T Vector上，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，藍(lán)白篩選，挑去白色菌落，送到上海生工工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.9 志賀菌適配體親和性的檢測(cè) 將上游引物5′端標(biāo)記磷酸，通過(guò)PCR擴(kuò)增產(chǎn)生帶熒光dsDNA，避光條件下，通過(guò)Lambda外切酶進(jìn)行酶切，酶切產(chǎn)物用Sephcryl凝膠層析純化后。取40μl 107cfu/ml福氏志賀菌，與10μl 100 ng/μl選取的自由能較小的幾條適配體進(jìn)行孵育，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)適配體結(jié)合熒光強(qiáng)度，從而篩選出親緣性高、特異性強(qiáng)、結(jié)合熒光能力強(qiáng)的適配體。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增ssDNA的篩選條件優(yōu)化 將模板進(jìn)行梯度稀釋，選擇5倍、10倍及20倍稀釋，同時(shí)分別進(jìn)行6 cycle、8 cycle、10 cycle、12 cycle循環(huán)，共設(shè)定16組條件，找到最適宜的擴(kuò)增條件。結(jié)果當(dāng)模板10倍稀釋時(shí)，10個(gè)循環(huán)的條件下能夠擴(kuò)增出單一目的條帶，將這一輪篩選出來(lái)的ssDNA全部擴(kuò)增（圖1）。

圖1 PCR大量擴(kuò)增ssDNA優(yōu)化條件瓊脂糖凝膠電泳圖譜Fig.1 Agarose gel electrophoresis of largely amplifying ssDNA by PCR in optimized conditions

2.2 Lambda外切酶切割dsDNA反應(yīng)條件 重復(fù)酶切試驗(yàn)證明最適宜反應(yīng)體系為20μl體系。分別選擇酶切底物濃度為700 ng/μl、600 ng/μl、500 ng/μl；Lambda外切酶為2μl，10×緩沖液2μl，去離子雙蒸水補(bǔ)齊。將實(shí)驗(yàn)分為兩組：1倍酶量和2倍酶量（20μl反應(yīng)體系中，外切酶量4μl），時(shí)間設(shè)定15 min和30 min。結(jié)果顯示底物為700 ng/μl、600 ng/μl，2倍酶量進(jìn)行酶切，反應(yīng)時(shí)間為30 min時(shí)，可獲得單一目的條帶。隨著酶切時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)緩慢降解ssDNA，產(chǎn)生非磷酸化底物（圖2）。

圖2 不同濃度、不同酶量PCR產(chǎn)物酶切效果的變性聚丙烯凝膠電泳圖Fig.2 Denaturing polypropylene gel electrophoresis of PCR products with different concentration and enzyme activity

2.3 Sephacryl凝膠層析純化及Lambda外切酶酶切產(chǎn)物回收曲線 設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)?zāi)７旅盖谢旌衔?，?00 ng/μl dsDNA和100 ng/μl ssDNA以2∶1比例混合共300μl，繪制回收曲線（圖3）。按照公式計(jì)算：回收率=實(shí)際回收ssDNA量/加入ssDNA估計(jì)的量×100%，結(jié)果ssDNA回收率高達(dá)84.40%，說(shuō)明Sephacryl凝膠層析柱可以回收純化ssDNA產(chǎn)物。按此方法，回收600 ng/μl酶切混合物150μl，平均回收率高達(dá)72.33%（圖4）。

圖3 微量紫外分析儀檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)７旅盖谢旌衔飐sDNA回收曲線Fig.3 Recovery curve of ssDNA detected from mimic mixtures after enzyme digestion by micro UV analyzer

圖4 微量紫外分析儀檢測(cè)600 ng/μl酶切混合物ssDNA回收曲線Fig.4 Recovery curve of ssDNA detected from 600 ng/μl mixtures after enzyme digestion by micro UV analyzer

2.4 適配體一級(jí)結(jié)構(gòu) 福氏志賀菌2a的ssDNA經(jīng)過(guò)10輪正向篩選和6輪消減菌篩選，最終得到第九輪與第十輪熒光強(qiáng)度基本完全相同，通過(guò)熒光分光光度計(jì)最終確認(rèn)完成富集。將得到特異適配體與T載體連接，轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，藍(lán)白斑篩選，挑去60個(gè)白色菌落進(jìn)行測(cè)序。應(yīng)用MEGA 5.0對(duì)測(cè)序回來(lái)的隨機(jī)序列進(jìn)行同源性分析，將適配體分為3大族，選取3個(gè)家族同源性較高的有代表性的3個(gè)序列，分別命名為ZH-17、ZH-21、ZH-28（圖5）。

圖5 福氏志賀菌2a適配體同源性分析Fig.5 Homology analysisof aptamersof Shigellaflexneri2a

2.5 核酸適配體的親和性 選取3條結(jié)合特異性好的適配體，分別與福氏志賀菌2a進(jìn)行孵育，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分析，適配體ZH-21與志賀菌結(jié)合親和性最好，熒光強(qiáng)度最高，而與種屬相近的兩種消減菌腸炎沙門菌和大腸埃希菌結(jié)合能力弱（圖6、7）。

圖6 福氏志賀菌3條親和性高適配體流式細(xì)胞儀熒光強(qiáng)度比對(duì)Fig.6 Comparison of fluorescence intensity of three highly compatible ligands of Shigella flexneri by flow cytometry

2.6 適配體的二級(jí)結(jié)構(gòu) 將3個(gè)代表序列輸入預(yù)測(cè)DNA和RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)在線工具mfold（http：//unafold.rna.albany.edu/？q=mfold），得到了ZH-17、ZH-21和ZH-28三個(gè)適配體的空間結(jié)構(gòu)和自由能，根據(jù)流式細(xì)胞儀實(shí)驗(yàn)結(jié)果，ZH-21結(jié)合特異性最高，測(cè)序其一級(jí)結(jié)構(gòu)為ATCCAGAGTGACGCAGCACGCACACACCTTCTTTCTTTCTGTCCCCTTCTTTCTTTCCTGGACACGGTGGCTTAGT，其二級(jí)結(jié)構(gòu)自由能小且有發(fā)卡、莖環(huán)和凸環(huán)等結(jié)構(gòu)（圖8）。

圖7 ZH-21適配體與志賀菌、腸炎沙門菌、大腸埃希菌的結(jié)合比對(duì)Fig.7 Comparison of bingding ratio for aptamer ZH-21 to Shigella，Samonella enteritidis and Escherichia coli

圖8 福氏志賀菌親和性最高適配體ZH-21二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.8 Secondary structure of the highest affinity ligand ZH-21 of Shigella flexneri

3 討論

志賀菌常規(guī)檢驗(yàn)技術(shù)包括有增菌培養(yǎng)、分離純化、生化檢驗(yàn)和血清型分型鑒定等，為了得到最好的分離效果，定性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中同時(shí)采用低敏感性麥康凱培養(yǎng)基、強(qiáng)選擇性木糖賴氨酸去氧膽酸鈉培養(yǎng)基或HE培養(yǎng)基來(lái)提高檢出率，且應(yīng)該對(duì)沙門菌-志賀菌分離培養(yǎng)基（SS）謹(jǐn)慎使用，因其會(huì)抑制某一些志賀菌1型的生長(zhǎng)，對(duì)其檢測(cè)結(jié)果造成誤差。ELISA法特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性強(qiáng)、準(zhǔn)確度好且易于自動(dòng)化操作，但試劑專一性強(qiáng)，無(wú)法同時(shí)檢測(cè)出多種成分，且會(huì)出現(xiàn)與結(jié)構(gòu)類似化合物結(jié)合交叉反應(yīng)，此外，特異抗體還受制備、保存、溫度、時(shí)間、環(huán)境和保存方法的影響，故限制了其應(yīng)用［8］。PCR技術(shù)包括常規(guī)PCR、多重PCR、熒光定量PCR等，縮短了相應(yīng)的檢測(cè)時(shí)間，且可以對(duì)多種菌同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，但其操作易產(chǎn)生污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性，且DNA和RNA易被降解，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果［9］。對(duì)志賀菌的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)存在著操作繁瑣且特異性低，難以滿足公眾對(duì)大批量人體健康體檢和突發(fā)性公眾衛(wèi)生事件的需求［10］。

傳統(tǒng)制備適配體過(guò)程中，主要采用離心沉淀法或使用Streptavidin Sepharose堿變性親和層析柱將與靶標(biāo)結(jié)合和未結(jié)合的寡核苷酸序列分離，這種適配體制備時(shí)間需要5～6 d，層析柱分離法成本高，存在著提高特異性和大規(guī)模制備的技術(shù)障礙［11］。在整個(gè)適配體篩選過(guò)程中，ssDNA文庫(kù)的產(chǎn)量與特異性對(duì)適配體篩選至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)利用Lambda核酸外切酶可以作用于雙鏈DNA，聯(lián)合Sephacryl凝膠層析獲得ssDNA和非磷酸化底物。凝膠層析又被稱為分子篩過(guò)濾、排阻層析等，它突出優(yōu)點(diǎn)是層析所用的凝膠屬于惰性載體、不帶電荷、吸附力弱、操作條件比較溫和，可在相當(dāng)廣的溫度范圍下進(jìn)行，凝膠層析技術(shù)多用于蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)物的分離。Sephacryl是葡聚糖與甲叉雙丙烯酰胺（N，N'-methylenebisacrylamide）交聯(lián)而形成的，是一種新型葡聚糖凝膠，分離范圍極大，機(jī)械穩(wěn)定性高［12］。本實(shí)驗(yàn)引入Sephacryl凝膠層析技術(shù)純化ssDNA混合物，摸索了小劑量和大劑量制備適配體Lambda酶與dsDNA最佳工作條件。進(jìn)行大規(guī)模制備時(shí)，回收效率高達(dá)70%以上，而傳統(tǒng)瓊脂糖凝膠切膠回收效率只有10%左右［13］。

實(shí)驗(yàn)首次將Lambda外切酶和Sephacryl凝膠層析技術(shù)應(yīng)用于適配體ssDNA和酶切碎片篩選，極大縮短了適配體的制備時(shí)間，同時(shí)可有效提高核酸適配體的特異性。提高了適配體的制備效率，增加了適配體的結(jié)合特異性，將整個(gè)制備周期縮短至3～4 d，且尤其適用于工廠、公司大規(guī)模制備適配體，該技術(shù)極大地推廣了適配體的大規(guī)模使用。

福氏志賀菌2a是中國(guó)地區(qū)常致感染性腹瀉的病原菌，因此快速、有效的應(yīng)用適配體檢測(cè)志賀菌技術(shù)，也對(duì)疾病防治和臨床選擇用藥具有十分重要的意義［14］。但本研究尚不能為該適配體的其他3種志賀菌進(jìn)行特異性檢測(cè)。為了優(yōu)化適配體的制備，保證其特異性，下一步我們計(jì)劃利用生物信息技術(shù)比對(duì)靶標(biāo)菌的特異性蛋白質(zhì)，通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)和蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)來(lái)反向設(shè)計(jì)適配體的一級(jí)結(jié)構(gòu)和二級(jí)結(jié)構(gòu)，將其命名為限制性指數(shù)富集技術(shù)，意為將設(shè)計(jì)好的若干種適配體與靶標(biāo)菌進(jìn)行結(jié)合，極大地提高其特異性和篩選效率。