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      復(fù)方苦參注射液聯(lián)合奧希替尼介導(dǎo)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在肺腺癌細(xì)胞H1975中的作用機(jī)制①

      2021-08-23 01:52:36曾建昌劉君麗王楚明蘇彥奇華中科技大學(xué)協(xié)和江北醫(yī)院武漢430100
      中國(guó)免疫學(xué)雜志 2021年10期
      關(guān)鍵詞:奧希替尼苦參腺癌

      曾建昌 劉 艷 楊 俊 李 奔 周 翔 陳 丹 李 榮 姚 馳 楊 柳 劉君麗 王楚明 蘇彥奇 羅 蓉(華中科技大學(xué)協(xié)和江北醫(yī)院,武漢430100)

      肺腺癌是一種非小細(xì)胞肺癌,該病主要起源于支氣管黏膜上皮,早期無(wú)明顯癥狀,手術(shù)、放射以及藥物治療仍是當(dāng)前針對(duì)肺腺癌治療的主要手段[1]。奧希替尼為第三代表皮生長(zhǎng)因子受體酪氨酸激酶抑制劑,該藥已被證實(shí)在延長(zhǎng)非小細(xì)胞肺癌患者生存期,減輕患者痛苦和疾病風(fēng)險(xiǎn)中效果顯著,被廣泛應(yīng)用于非小細(xì)胞肺癌的治療[2]。復(fù)方苦參注射液由中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥所研制,主要由苦參和白土苓兩味藥組成,在清熱利濕、涼血解毒、解結(jié)止痛、緩解癌性疼痛、出血、提升化療效果以及免疫功能方面具有良好效果[3]。近年來(lái)復(fù)方苦參注射液被越來(lái)越多的應(yīng)用于乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌等多種癌癥的治療中并且效果顯著[4-6]。何敏等[7]在研究中發(fā)現(xiàn),復(fù)方苦參注射液聯(lián)合順鉑、拓?fù)涮婵档饶軌蝻@著減輕肺癌患者疼痛,提高機(jī)體免疫能力并減少不良反應(yīng)的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)絕大多數(shù)非小細(xì)胞肺癌患者體內(nèi)存在PI3K/AKT/mTOR通路激活的情況,PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑聯(lián)合免疫治療等手段也被越來(lái)越多的應(yīng)用于肺癌的治療中[8-9]?,F(xiàn)階段奧希替尼聯(lián)合中藥處方治療肺腺癌逐漸成為醫(yī)療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn),但其具體作用機(jī)制仍有待探討。本研究旨在分析復(fù)方苦參注射液聯(lián)合奧希替尼對(duì)肺腺癌H1975細(xì)胞的影響及作用機(jī)制,為后續(xù)治療奠定研究基礎(chǔ)?,F(xiàn)報(bào)告如下。

      1 材料與方法

      1.1 材料 H1975細(xì)胞由美國(guó)物種保留中心(Amer-ican Type Culture Collection,ATCC)提供;RPMI 1640培養(yǎng)基購(gòu)自Invitrogen;Trizol試劑盒購(gòu)自Gibco;RT-PCR試劑盒購(gòu)自大連寶生物有限公司;PCR引物序列由華大基因合成;BCA蛋白定量試劑盒購(gòu)自Sigma;Western blot中抗體購(gòu)自Abcam;MTT溶液、Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自北京索萊寶公司;Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒購(gòu)自貝博生物公司;PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑特異性抑制劑BEZ235購(gòu)自Selleck。

      1.2 方法

      1.2.1 細(xì)胞分組 使用含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基,在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),使用0.25%胰蛋白酶進(jìn)行消化傳代。之后將人肺腺癌H1975細(xì)胞分為如下組:陰性對(duì)照組(Negative control,NC組,生理鹽水干預(yù))、苦參注射液組(苦參注射液干預(yù))、奧希替尼組(奧希替尼干預(yù))、苦參注射液+奧希替尼組(苦參注射液+奧希替尼干預(yù))、BEZ235組(PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑干預(yù))、苦參注射液+奧希替尼+BEZ235組(苦參注射液+奧希替尼+PI3K/AKT/mTOR通路抑制劑干預(yù))??鄥⒆⑸湟菏褂脻舛葹? mg/ml,奧希替尼為10μmol/L,BEZ235溶于無(wú)菌DMSO配制濃度為5 mmol/L的原液,使用前將原液用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋至0.1μmol/L。

      1.2.2 MTT細(xì)胞活力檢測(cè) 將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種至96孔板,4×105個(gè)/孔細(xì)胞,每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。加入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng),分別于培養(yǎng)24 h、48 h和72 h時(shí)換液并每孔加入20μl MTT溶液。孵育4 h后棄上清,加入100μl Formanzan溶液后繼續(xù)孵育4 h。酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)下的各孔吸光度值。

      1.2.3 Transwell實(shí)驗(yàn) 按照1∶10的比例將Matrigel膠用無(wú)血清DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋,之后于上室加入100μl Matrigel膠,重懸細(xì)胞后稀釋細(xì)胞濃度至3×105個(gè)/ml,將100μl細(xì)胞加入上室,于Transwell下室加入600μl DMEM培養(yǎng)基(含10%血清),依據(jù)Transwell說(shuō)明書(shū)進(jìn)行結(jié)晶紫染色。染色結(jié)束后于光學(xué)顯微鏡下觀察染色結(jié)果,計(jì)算侵襲細(xì)胞數(shù)。

      1.2.4 Annexin V-FITC/PI雙染法 采用Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒檢測(cè)H19175細(xì)胞凋亡情況,實(shí)驗(yàn)步驟如下:PBS洗滌細(xì)胞,以2 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min,加入500μl結(jié)合緩沖液,調(diào)整細(xì)胞密度為4×105個(gè)/ml,加入5μl Annexin V-FITC并混勻,避光室溫溫育10 min。加入5μl PI,混勻,于5 min內(nèi)上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。激發(fā)波長(zhǎng)為480 nm,530 nm處檢測(cè)FITC,>575 nm處檢測(cè)PI。

      1.2.5 qRT-PCR檢測(cè) Trizol試劑盒一步法提取總RNA,取3μg總RNA,用M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行熒光定量PCR,操作步驟依據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行,使用qRT-PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增,相對(duì)表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參。記錄各孔Ct值(擴(kuò)增動(dòng)力曲線拐點(diǎn))。2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)水平,引物序列見(jiàn)表1。

      表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

      1.2.6 Western blot檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),將200μl含有蛋白酶抑制劑的細(xì)胞裂解液加入培養(yǎng)孔。細(xì)胞離心后借助BCA蛋白定量試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行測(cè)定。之后每孔50μg蛋白行SDSPAGE凝膠電泳。轉(zhuǎn)膜,脫脂牛奶封閉后加入兔抗人一抗p-PI3K、p-AKT、p-mTOR、Bax、Bcl-2、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin,4℃孵育過(guò)夜,TBST沖洗后加入山羊抗兔二抗IgG,37℃孵育1 h,TBST沖洗,使膜與ECL反應(yīng)液反應(yīng)1 min,觀察結(jié)果。蛋白相對(duì)表達(dá)量為目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶的灰度值之比。

      1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件對(duì)本研究中數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,計(jì)量資料以±s的形式表示,兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間比較采用單因素方差分析。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用重復(fù)測(cè)量方差分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

      2 結(jié)果

      2.1 復(fù)方苦參注射液、奧希替尼及聯(lián)合使用抑制H1975細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡 使用MTT以及流式細(xì)胞術(shù)對(duì)各組細(xì)胞增殖、凋亡情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于NC組,苦參注射液組和奧希替尼組細(xì)胞凋亡率提高,且細(xì)胞增殖活力被抑制,苦參注射液+奧希替尼組效果更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖1。

      圖1 各組細(xì)胞增殖、凋亡情況檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Results of cell proliferation and apoptosis in each group

      2.2 復(fù)方苦參注射液、奧希替尼及聯(lián)合使用抑制H1975細(xì)胞侵襲 Transwell檢測(cè)結(jié)果顯示,相對(duì)于NC組,苦參注射液組和奧希替尼組中細(xì)胞侵襲數(shù)目減少(均P<0.05),同時(shí),與苦參注射液+奧希替尼組比較,苦參注射液組和奧希替尼組細(xì)胞侵襲數(shù)目增多(均P<0.05),表明苦參注射液和奧希替尼二者聯(lián)合使用在抑制H1975細(xì)胞侵襲中效果更為顯著。見(jiàn)圖2。

      圖2 各組細(xì)胞侵襲檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Cell invasion results in each group

      2.3 復(fù)方苦參注射液和奧希替尼抑制H1975細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路的激活 為進(jìn)一步探討復(fù)方苦參注射液和奧希替尼調(diào)控H1975細(xì)胞生物學(xué)特性的具體機(jī)制,對(duì)細(xì)胞給予了BEZ235處理,qRT-PCR和Western blot檢測(cè)各組細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)因子的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于NC組,苦參注射液+奧希替尼組、BEZ235組中PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)因子的表達(dá)被顯著抑制,且苦參注射液+奧希替尼+BEZ235組中抑制效果更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖3。

      圖3 各組細(xì)胞中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路相關(guān)因子的表達(dá)Fig.3 PI3K/AKT/mTOR related factors expressions in each group

      2.4 復(fù)方苦參注射液和奧希替尼通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制H1975細(xì)胞增殖,促進(jìn)凋亡相對(duì)于NC組,苦參注射液+奧希替尼組、BEZ235組細(xì)胞凋亡增多,細(xì)胞增殖活力被抑制,Bax表達(dá)增多,Bcl-2表達(dá)降低,且苦參注射液+奧希替尼+BEZ235組效果更為顯著(P<0.05)。表明苦參注射液+奧希替尼能夠通過(guò)調(diào)節(jié)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路進(jìn)而影響H1975細(xì)胞的增殖凋亡。見(jiàn)圖4。

      圖4 各組細(xì)胞增殖和凋亡結(jié)果Fig.4 Cell proliferation and apoptosis results of each group

      2.5 復(fù)方苦參注射液和奧希替尼通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制H1975細(xì)胞侵襲 對(duì)各組細(xì)胞侵襲情況進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于NC組,苦參注射液+奧希替尼組、BEZ235組細(xì)胞侵襲被抑制,且苦參注射液+奧希替尼+BEZ235組侵襲數(shù)目減少更為顯著(P<0.05)。見(jiàn)圖5。

      圖5 各組細(xì)胞侵襲結(jié)果Fig.5 Cell invasion results in each group

      2.6 復(fù)方苦參注射液和奧希替尼通過(guò)PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制H1975細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 對(duì)各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子表達(dá)進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于NC組,苦參注射液+奧希替尼組、BEZ235組細(xì)胞中N-cadherin、Vimentin表達(dá)被抑制,E-cadherin表達(dá)增強(qiáng),苦參注射液+奧希替尼+BEZ235組各因子變化更為明顯(P<0.05)。見(jiàn)圖6。

      圖6 各組細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子表達(dá)檢測(cè)結(jié)果Fig.6 Epithelial mesenchymal transformation related factors expression in each group

      3 討論

      本研究探討了奧希替尼聯(lián)合中藥復(fù)方苦參注射液對(duì)肺腺癌H1975細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),聯(lián)合使用奧希替尼和復(fù)方苦參注射液能夠更顯著的促進(jìn)H1975細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖和侵襲,而該作用的實(shí)現(xiàn)可能與抑制PI3K/AKT/mTOR通路的激活有關(guān)。

      奧希替尼為臨床上用于治療局部晚期或者轉(zhuǎn)移性肺癌的常用藥物之一,相對(duì)于傳統(tǒng)藥物,其具有靶向性強(qiáng)、具有良好治療效果且不良反應(yīng)較少等優(yōu)點(diǎn)[10]。而復(fù)方苦參注射液作為中藥制劑,被證實(shí)能夠顯著改善放療患者肺損傷程度、減少放射性肺炎的發(fā)生,同時(shí)還能夠顯著改善肺炎患者癥狀,促進(jìn)機(jī)體的耐受程度增強(qiáng)[11]。本研究首先通過(guò)對(duì)H1975細(xì)胞給予復(fù)方苦參注射液、奧希替尼等處理,結(jié)果發(fā)現(xiàn),同時(shí)給予復(fù)方苦參注射液和奧希替尼對(duì)于H1975細(xì)胞的增殖和侵襲的抑制,以及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的效果更顯著。為了探討復(fù)方苦參注射液聯(lián)合奧希替尼作用于H1975的具體機(jī)制,對(duì)細(xì)胞給予BEZ235處理。

      研究證實(shí)PI3K/AKT通路在多種實(shí)體瘤中均處于激活狀態(tài),AKT是絲氨酸蘇氨酸蛋白激酶家族的重要成員,其在PI3K/AKT通路中處于最核心的位置,具有調(diào)控細(xì)胞增殖凋亡的作用[12-14]。mTOR在細(xì)胞的增殖、代謝以及骨架形成過(guò)程中起關(guān)鍵作用,還能夠參與激活A(yù)KT的過(guò)程,因其在腫瘤學(xué)中的作用,也成為多種藥物研發(fā)的重要針對(duì)目標(biāo)[15]。為探究復(fù)方苦參注射液與奧希替尼在肺腺癌細(xì)胞H1975中發(fā)揮作用的具體機(jī)制,使用qRT-PCR和Western blot檢測(cè)各組PI3K/AKT/mTOR通路相關(guān)因子的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),相對(duì)于NC組,苦參注射液+奧希替尼組中通路相關(guān)因子的表達(dá)被顯著抑制。同時(shí)BEZ235組中細(xì)胞增殖、侵襲被抑制,顯著誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,同時(shí)給予苦參注射液、奧希替尼以及BEZ235則效果更明顯。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化指的是上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的過(guò)程,其能夠賦予細(xì)胞入侵以及轉(zhuǎn)移的能力,在癌癥的發(fā)生和發(fā)展中起重要作用[16-17]。另外有研究表明PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路在上皮源性惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,該通路的激活能夠促進(jìn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過(guò)程[18]。本研究進(jìn)一步探討了各組H1975細(xì)胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)因子的表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn),BEZ235或苦參注射液+奧希替尼能夠顯著抑制N-cadherin和Vimentin、促進(jìn)E-cadherin的表達(dá)而聯(lián)合使用效果更明顯,這也進(jìn)一步說(shuō)明了奧希替尼、苦參注射液等對(duì)肺腺癌的影響可能與調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關(guān)。

      綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn),復(fù)方苦參注射液聯(lián)合奧希替尼能夠抑制H1975細(xì)胞增殖、侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,該作用可能是通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的,本研究在探討藥物效果的基礎(chǔ)上進(jìn)一步明確了其具體作用機(jī)制,并在肺腺癌的治療中有一定指導(dǎo)意義。

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