大黃消痔栓的工藝改進(jìn)及有效成分含量測(cè)定*

倪志濤 杜曉鳳 史玉攀 商婷 王謹(jǐn)慧

(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020)

痔瘡是一種位于肛門部位的常見疾病，任何年齡都可發(fā)病，且隨著年齡增長(zhǎng)，發(fā)病率逐漸增高，素有“十人九痔”的說法[1]。有學(xué)者認(rèn)為，90%以上的痔瘡患者可以通過非手術(shù)治療得以治愈[2-3]。中醫(yī)辨證治療痔瘡優(yōu)勢(shì)明顯，具有使用方便、價(jià)格低廉、依從性好、療效顯著、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)[4-5]。朱震亨云：“痔者，皆因臟腑本虛，外傷風(fēng)濕，內(nèi)蘊(yùn)熱毒?！盵6]又《東垣十書》曰：“治痔瘺大法，以瀉火、涼血、除濕、潤(rùn)燥為主”。[7]初步確定了痔瘡的辨證與治法。大黃消痔栓是我院肛腸科特色中藥制劑，具有清熱涼血，止痛通便的功效，臨床用于混合痔術(shù)后止痛、止血、促愈效果顯著[8]。最新研究表明，大黃消痔栓對(duì)于濕熱瘀阻型CABP/CPPS也有較好的治療效果[9]，具有廣闊的應(yīng)用前景。但生產(chǎn)工藝存在脫模時(shí)需冷凍，生產(chǎn)效率低，成品常溫貯存易融化變形等缺點(diǎn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)原處方工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用HPLC法對(duì)栓劑中君藥大黃的指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定，為更好地控制該栓劑質(zhì)量及推廣使用提供依據(jù)。

1 材料

1.1儀器 waters高效液相色譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；超聲波清洗器，上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司；S26s數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市大地自動(dòng)化儀器；AE240S電子天平，梅特勒一托利多儀器(上海)有限公司；RBY-4自動(dòng)融變時(shí)限檢查儀，昆山廣測(cè)儀器設(shè)備有限公司。

1.2藥品與試劑 黃蜂蠟(批號(hào)20180123)東光縣永盛蠟制品廠，混合脂肪酸甘油酯(硬脂)(批號(hào)180302)成都瀘天化科森有限責(zé)任公司，大黃(批號(hào)1903012)甘肅中天藥業(yè)有限責(zé)任公司，槐角(批號(hào)1810012)甘肅中天藥業(yè)有限責(zé)任公司，冰片(批號(hào)180435)云南林緣香料有限公司，甲醇(批號(hào)119110630G002)廣州艾欣科學(xué)儀器有限公司，三氯甲烷(批號(hào)20120916)利安隆博華醫(yī)藥化學(xué)有限公司，注射用水(批號(hào)M19020906)四川科倫藥業(yè)股份有限公司，蘆薈大黃素(批號(hào)110786-201042)、大黃酸(批號(hào)110765-201076)、大黃素(批號(hào)110794-201087)、大黃酚(批號(hào)110789-201107)、大黃素甲醚(批號(hào)110773-201055)均購于中國食品藥品檢定研究院。

2 方法與結(jié)果

2.1基質(zhì)比例的確定 按處方量藥粉配比，以栓劑成型為前提，以混合脂肪酸甘油酯與蜂蠟不同比例為考察因素，采用綜合評(píng)分法評(píng)價(jià)制得栓劑的優(yōu)劣，以外觀形態(tài)(Q1)、重量差異(Q2)、融變時(shí)限(Q3)為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行評(píng)分，綜合得分為三種指標(biāo)分?jǐn)?shù)總和。Q1：觀察栓劑外觀完整度、表面光滑度、硬度。外觀完整得1分、表面光滑得1分、硬度適宜得1分，最高得3分，最低得0分；Q2：栓劑重量差異，重量差異≤3%得2分，5%<重量差異≤7.5%得1分，重量差異>7.5%得0分；Q3：按2015年版《中國藥典》通則0922融變時(shí)限檢查法測(cè)定，融變時(shí)限≤30 min者為10分，在30～40 min者每延長(zhǎng)1 min，分?jǐn)?shù)相應(yīng)減少1分。根據(jù)得分分析，原基質(zhì)中加入少量蜂蠟?zāi)苡行Ц纳破涑尚涡?，且?duì)栓劑融變時(shí)限有一定影響，當(dāng)蜂蠟量低于9∶1時(shí)，成形性不好，但隨著蜂蠟量的增加，當(dāng)蜂蠟量大于7∶1時(shí)，融變時(shí)限達(dá)不到要求，當(dāng)蜂蠟量大于5∶1時(shí)，兩種基質(zhì)難以混勻，導(dǎo)致重量差異大。綜合考慮，混合脂肪酸甘油酯與蜂蠟比例為8∶1時(shí)，栓劑成形性好，硬度適宜，重量差異小，融變時(shí)限符合規(guī)定，為最佳基質(zhì)比例。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表1。

表1 大黃消痔栓處方篩選試驗(yàn)安排

2.2灌模時(shí)溫度的選擇 按優(yōu)選的基質(zhì)配比和處方量藥粉制備栓劑，其他條件保持不變，對(duì)灌模時(shí)的溫度進(jìn)行考察。分為70、75、80 ℃三組，以栓劑外觀為考察指標(biāo)對(duì)灌模溫度進(jìn)行優(yōu)選。結(jié)果，當(dāng)灌模溫度為70 ℃時(shí)，栓劑外表粗糙、色澤不均勻；當(dāng)灌模溫度為75 ℃時(shí)，制備的栓劑外觀完整光滑，色澤均勻；而當(dāng)灌模溫度為 80 ℃時(shí)，栓劑頂端存在中空現(xiàn)象，且藥粉與基質(zhì)有分層現(xiàn)象。綜上所述，灌模溫度選擇75 ℃為宜。

2.3脫模時(shí)間的選擇 按優(yōu)選的基質(zhì)配比和處方量藥粉制備栓劑，其他條件保持不變，對(duì)常溫脫模冷卻時(shí)間進(jìn)行考察。分3組，脫模冷卻時(shí)間分別為2、5、10 min。結(jié)果顯示，當(dāng)脫模冷卻時(shí)間為2 min時(shí)，栓劑尚不能完全冷凝脫模，容易斷裂，5 min時(shí)能完全冷凝脫模，成品外觀完整光滑、色澤均勻，與10 min脫模時(shí)近似。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，考慮到生產(chǎn)效率，最終確定常溫脫模冷卻時(shí)間為5 min，相較于原工藝?yán)鋬?0 min脫模，優(yōu)選后的工藝操作簡(jiǎn)便、效率高。

2.4計(jì)算置換價(jià) 以質(zhì)量比8∶1稱取混合脂肪酸甘油酯、蜂蠟，水浴加熱，保持溫度85 ℃至完全熔化，加入處方量藥粉或不加藥粉，常溫冷卻至75 ℃，邊攪拌邊灌模。常溫冷卻5 min，削去溢出部分，脫模，分別制備大黃消痔栓和空白基質(zhì)栓，置換價(jià)(displacement value，DV)以公式DV=W/[G-(M-W)]計(jì)算[10]，大黃消痔栓DV為1.35。

2.5驗(yàn)證試驗(yàn) 根據(jù)試驗(yàn)優(yōu)選的最佳制備條件，分別按比例稱取混合脂肪酸甘油酯和蜂蠟，水浴加熱保持85 ℃，熔化后加入處方量藥粉，混合均勻，待冷卻至75 ℃時(shí)邊攪拌邊灌模，常溫冷卻5 min后，削去溢出部分，脫模。栓劑成品外觀完整光滑、硬度適宜，重量差異為1.6%，按2015年版《中國藥典》通則0922融變時(shí)限檢查法測(cè)定，三批樣品的平均融變時(shí)限為19 min。各項(xiàng)數(shù)據(jù)符合規(guī)定，工藝可行。

3 大黃消痔栓中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的含量測(cè)定

3.1溶液的制備

3.1.1混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取蘆薈大黃素標(biāo)準(zhǔn)品22.5 mg、大黃酸標(biāo)準(zhǔn)品13.6 mg、大黃素標(biāo)準(zhǔn)品19.0 mg、大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品19.0 mg、大黃素甲醚標(biāo)準(zhǔn)品7.0 mg，分別置于100 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解并稀釋至刻度，搖勻。分別精密量取上述各標(biāo)準(zhǔn)品溶液2 mL，混勻，作為對(duì)照品溶液(濃度為：蘆薈大黃素45.0 μg·mL-1，大黃酸27.2 μg·mL-1，大黃素38.0 μg·mL-1，大黃酚38.0 μg·mL-1，大黃素甲醚14.0 μg·mL-1)。

3.1.2供試品溶液的制備 取大黃消痔栓剪碎，精密稱取3.0 g，置于錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，冷卻至常溫，用甲醇補(bǔ)足損失重量，-20 ℃冷卻1 h，濾過，取續(xù)濾液10 mL，于燒瓶中揮去溶劑，加入8%鹽酸20 mL，超聲處理2 min，加入三氯甲烷20 mL加熱回流1 h，放冷，置于分液漏斗中，用少量三氯甲烷洗滌容器，并入分液漏斗中，分取三氯甲烷層，酸液再用三氯甲烷萃取3次，每次20 mL，合并三氯甲烷液，揮去溶劑，殘?jiān)蛹状际谷芙?，轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，取續(xù)濾液過0.45 μm微孔濾膜后，作為供試品溶液。

3.1.3陰性對(duì)照品溶液的制備 取除大黃外的其他處方量藥粉，按大黃消痔栓制備工藝制成陰性空白栓，按供試品溶液制備方法制成陰性對(duì)照品溶液。

3.2色譜條件 色譜柱：symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；以甲醇-0.1%磷酸水溶液(85∶15)作為流動(dòng)相；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL；流速：1 mL·min-1，理論塔板數(shù)按大黃素峰計(jì)算不低于3000。

3.3系統(tǒng)適用性 取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照品溶液各適量，在“3.2”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣10 μL，觀察色譜圖，混合對(duì)照品、供試品中各組分分離度良好，且陰性無干擾，表明方法專屬性強(qiáng)。色譜圖見圖1。

注：1.蘆薈大黃素；2.大黃酸；3.大黃素；4.大黃酚；5.大黃素甲醚

3.4線性關(guān)系的考察 取“3.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液，分別精密吸取0.5，1，2，4，6，8 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“3.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣濃度(x，μg·mL-1)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程與線性范圍，見表2。

表2 回歸方程與線性范圍

3.5精密度試驗(yàn) 精密量取“3.1.1”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻。按“3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.23%、1.62%、0.85%、0.97%6、1.42%(n=6)，表明儀器精密度良好。

3.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取供試品溶液，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件，在0，2，4，6，8，10，12 h各測(cè)定1次，記錄峰面積。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.25%、0.95%、0.84%、1.53%、0.78%(n=6)。表明供試品溶液12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.7重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批(190301)樣品適量，按“3.1.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚峰面積的RSD分別為1.47%、0.85%、1.43%、0.97%、1.13%(n=6)。表明方法可重復(fù)性良好。

3.8加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的樣品(190301)，隨機(jī)分為低、中、高組，分別精密加入樣品中蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚含量的80%、100%、120%標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別記錄峰面積，帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程并計(jì)算平均回收率及RSD。結(jié)果，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚平均回收率分別為98.2%(RSD=0.6%)、103.5%(RSD=1.3%)、97.1%(RSD=0.8%)、96.0%(RSD=0.7%)、99.3%(RSD=1.6%)(n=3)。表明該方法回收率高。

3.9樣品含量測(cè)定 稱取3批樣品各3份，按“3.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“3.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果見表3。

表3 樣品測(cè)定結(jié)果(n=3)

4 討論

大黃消痔栓以混合脂肪酸甘油酯為基質(zhì)，具有較好的穩(wěn)定性，但制劑脫模時(shí)需冷凍，貯存溫度高時(shí)易變形，本實(shí)驗(yàn)在混合脂肪酸甘油酯中加入少量蜂蠟，能顯著提高栓劑的成形性、縮短脫模冷卻時(shí)間、改善貯存溫度要求，使大黃消痔栓能更好的推廣應(yīng)用。

大黃消痔栓中大黃涼血解毒，逐瘀通經(jīng)為君藥，黃連清熱燥濕、瀉火解毒，槐角清熱瀉火、涼血止血共為臣藥，冰片清熱止痛用于瘡瘍腫痛、潰后不斂等為佐藥。全方具有清熱燥濕、通便活血、消腫止痛、涼血止血之功。研究表明大黃蒽醌類成分對(duì)多種病原微生物具有抑制作用，能有效改善機(jī)體發(fā)熱、疼痛、腫脹等癥狀[11]，另有研究提出蒽醌類成分是大黃止血作用的物質(zhì)基礎(chǔ)[12-13]，與大黃消痔栓清熱、涼血、止痛功效相一致。大黃蒽醌含量測(cè)定專屬性強(qiáng)，結(jié)果準(zhǔn)確，可用于大黃消痔栓的質(zhì)量控制。

2015版《中國藥典》共收錄栓劑35種，其中中藥栓僅10種[14]，相對(duì)片劑、膠囊劑及注射劑等劑型較少，但隨著中空栓、海綿栓、緩釋栓等新型栓劑的深入研究[15]及中藥現(xiàn)代化事業(yè)的發(fā)展，中藥栓劑在臨床中具有更為廣闊的應(yīng)用前景，也越來越受到醫(yī)學(xué)工作者的重視。