孕婦VDR基因FokI位點(diǎn)多態(tài)性與胎兒孤立性股骨短小的相關(guān)性*

陳楊萍，李苑艷，朱非白，胡曉霞，周麗麗

(溫州市中心醫(yī)院 a.婦產(chǎn)科 325000;b.中心實(shí)驗(yàn)室,溫州 325000)

胎兒肢體畸形是最常見(jiàn)的先天性骨骼系統(tǒng)畸形之一，據(jù)有關(guān)研究其發(fā)病率為1/500[1]。胎兒股骨長(zhǎng)度(femur length,FL)是孕期超聲檢查評(píng)價(jià)胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)及骨骼發(fā)育的常用指標(biāo)，胎兒孤立性股骨短小(isolated short femur,ISF)指在超聲檢查中發(fā)現(xiàn)胎兒雙側(cè)對(duì)側(cè)性股骨短小，無(wú)其余結(jié)構(gòu)畸形，且無(wú)異常細(xì)胞、分子遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)。國(guó)內(nèi)外關(guān)于引起ISF的病因研究較少，且無(wú)有效的宮內(nèi)治療措施。亦有研究表明[2-3]，孕婦鈣的攝入量與胎兒FL相關(guān)，而孕婦鈣的攝入量受體內(nèi)維生素D及維生素D受體(Vitamin D receptor，VDR)基因的調(diào)控。目前研究發(fā)現(xiàn)，VDR基因FokI位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)骨代謝有重要的影響。本課題組研究孕婦VDR基因FokI多態(tài)性與ISF的相關(guān)性，探討胎兒ISF的發(fā)生遺傳易感因素。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2018年6月至2020年1月在溫州市中心醫(yī)院產(chǎn)檢的B超提示胎兒股骨短小的120例孕婦作為觀察組。納入標(biāo)準(zhǔn)：胎兒股骨短小參照低于同孕周平均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差[4]。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并其他超聲結(jié)構(gòu)異常及胎兒染色體異常的非孤立性股骨短?。?2)妊娠期糖尿病、高血壓病、風(fēng)濕免疫性疾病、染色體異常、甲狀腺異常及骨代謝異常相關(guān)疾病。隨機(jī)選取120例胎兒超聲結(jié)構(gòu)正常的正常產(chǎn)檢孕婦作為對(duì)照組，本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，孕婦知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法 于孕早期測(cè)量孕婦身高、體重及其配偶身高，孕23周行胎兒系統(tǒng)超聲檢測(cè)時(shí)測(cè)胎兒股骨長(zhǎng)度，設(shè)計(jì)問(wèn)卷調(diào)查表，記錄孕婦產(chǎn)次、孕期戶外活動(dòng)時(shí)間、服用鈣量及維生素D等情況。

1.3 PCR-Pyrosequencing遺傳分析技術(shù)(PCR-焦磷酸測(cè)序)測(cè)定血清VDR基因FokI位點(diǎn) 用長(zhǎng)沙三濟(jì)生物科技有限公司全血DNA基因提取試劑盒提取患者DNA，置-20℃保存。反應(yīng)體系25μL，擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3min；95℃ 15s,60℃ 1min，共45個(gè)循環(huán)。前引物：GTGGCCTGCTTGCTGTTC，后引物：ACAGATCCGGGGCACGTT，測(cè)序引物：TTGCTGTTCTTACAGGG。用PyroMark Q24測(cè)序儀隨機(jī)選擇10%樣本PCR產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸基因測(cè)序，用PyroMarkQ24MDxSoftware查看測(cè)序結(jié)果。酶聯(lián)免疫法檢測(cè)分娩前孕婦血清及新生兒臍靜脈血25-羥維生素D[25-hydroxyvitamin D，25(OH)D]水平。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn) 為評(píng)價(jià)基因頻率估計(jì)的可靠性，對(duì)120例對(duì)照組孕婦VDR基因FokI位點(diǎn)的基因型進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示其等位基因的位點(diǎn)分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，表明該組資料在人群中具有良好的代表(χ2=1.67，P>0.05)。

2.2 孕婦的基本情況 觀察組和對(duì)照組的孕婦身高、年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、產(chǎn)次、日照時(shí)間、服用鈣量和配偶身高比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

表1 孕婦的基本情況

2.3 觀察組和對(duì)照組基因型對(duì)比 觀察組TT型37例，占30.83%，孕婦及新生兒臍血25-羥維生素D分別為(35.14±11.89)mmol/L和(35.42±11.78)mmol/L;TC型63例，占52.5%,孕婦及新生兒臍血25-羥維生素D分別為(43.28±14.00)mmol/L和(45.71±13.67)mmol/L;CC型20例，占20.83%，孕婦及新生兒臍血25-羥維生素D分別為(55.14±13.71)mmol/L和(55.85±16.07)mmol/L。對(duì)照組孕婦中TT型28例，占23.33%，孕婦及新生兒臍血25-羥維生素D分別為(36.00±9.67)mmol/L和(38.71±9.57)mmol/L;TC型57例，占47.5%，對(duì)應(yīng)的25-羥維生素D分別為(44.57±10.73)mmol/L和(47.71±13.27)mmol/L;CC型35例，占29.16%,對(duì)應(yīng)的25-羥維生素D分別為(54.00±8.58)mmol/L和(57.57±10.17)mmol/L;不同基因型中以TT型的孕婦及新生兒臍血25-羥維生素D的含量最低，CC型最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(表2、3)。觀察組TT+TC基因型的比例(83.33%)大于對(duì)照組(70.83%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=5.307,P=0.015)(表4)。

表2 觀察組不同基因型孕婦血清及臍血25(OH)D比較

表3 對(duì)照組不同基因型孕婦血清及臍血25(OH)D比較

表4 兩組孕婦VDR基因FokI位點(diǎn)不同基因型的比率比較[n(%)]

3 討 論

胎兒肢體骨骼發(fā)育畸形是一種常見(jiàn)的先天性畸形，股骨長(zhǎng)度是篩查胎兒骨骼系統(tǒng)異常及評(píng)估是否胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限的重要指標(biāo)。胎兒股骨短小國(guó)際上一般采用低于同孕周胎兒股骨長(zhǎng)的第5百分位數(shù)，而國(guó)內(nèi)一般采用低于同孕周平均值2個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差或FL/足長(zhǎng)比值<0.88。根據(jù)股骨短小是否合并其他超聲結(jié)構(gòu)異?；蚣?xì)胞遺傳學(xué)異常分為孤立性股骨短小和非孤立性股骨短小。目前國(guó)內(nèi)外研究較多的是非孤立性股骨短小，其常見(jiàn)原因是遺傳性骨骼系統(tǒng)疾病。目前研究明確的四種遺傳性骨病主要有：(1)致死性骨發(fā)育不良(thanatophoric dysplasia，TD):常染色體顯性遺傳，是有FGFR3基因的第7外顯子發(fā)生點(diǎn)突變所致；(2)成骨發(fā)育不全(osteogenesis imperfecta，OI)：一種常染色體顯性遺傳病，是一種由編碼I型膠原蛋白α鏈的COL1A1/COL1A2基因突變導(dǎo)致膠原代謝紊亂的全身結(jié)締組織疾??；(3)軟骨發(fā)育不全(achondroplasia，ACH)：亦是常染色體顯性遺傳，是由FGFR3基因第10外顯子發(fā)生點(diǎn)突變引起;(4)單純性短肢畸形：十分罕見(jiàn)，可能與染色體異常相關(guān)，但具體機(jī)制不詳。前3種骨骼畸形共同的主要表現(xiàn)為嚴(yán)重的短肢畸形伴發(fā)其它超聲結(jié)構(gòu)異常，且可通過(guò)介入性產(chǎn)前診斷得到病因?qū)W診斷。另有一些研究表明與胎兒非整倍體染色體異常有關(guān)，尤其是21-三體綜合征，但陽(yáng)性預(yù)測(cè)值不高[6]。對(duì)于以上明確基因突變的骨骼發(fā)育異常的非孤立性股骨短小胎兒均選擇終止妊娠。因孤立性股骨短小較難從病因上診斷，故目前國(guó)內(nèi)外對(duì)其研究較少。Goetzinger等[7]的大樣本回顧性分析對(duì)照研究表明,ISF組的胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限發(fā)生率高于對(duì)照組。Ozlü等[8]研究表明，ISF組早產(chǎn)兒發(fā)生率、新生兒重癥監(jiān)護(hù)病房住院率、低出生體質(zhì)量?jī)喊l(fā)生率及孕婦吸煙率均高于對(duì)照組，孕婦體質(zhì)量指數(shù)、分娩期體質(zhì)量指數(shù)及平均身高低于對(duì)照組。表明ISF發(fā)生可能與孕母的身高、體重及吸煙相關(guān)。有報(bào)道[9]指出，ISF與母體因素或父母身高矮小導(dǎo)致骨相關(guān)生長(zhǎng)因子異?；蛱貉髟俜植加嘘P(guān)。亦有研究表明，孕婦鈣的攝入量與胎兒股骨的長(zhǎng)度相關(guān)[10]，而孕婦鈣的攝入量受體內(nèi)維生素D及VDR基因的調(diào)控。目前研究發(fā)現(xiàn)，VDR基因多態(tài)性主要有4個(gè)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)位點(diǎn)對(duì)骨代謝有重要的影響，分別為FokI、Bsm I、Apa I及Taq I限制性酶切位點(diǎn)。FokI限制性位點(diǎn)多態(tài)性位于2號(hào)外顯子，存在T/C轉(zhuǎn)換多態(tài)性，導(dǎo)致編碼氨基酸密碼子427ACG>ATG突變，是目前所了解的VDR基因多態(tài)性中唯一改變氨基酸序列長(zhǎng)度的位點(diǎn)[11]，以等位基因F、f表示，f表示存在FokI酶切位點(diǎn)，F(xiàn)表示缺乏FokI酶切位點(diǎn)，可有3種不同的組合(FF、Ff、ff或CC、TC、TT)。VDR在造骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞中均有表達(dá)[12]，其可特異地結(jié)合1，25(OH)2D3，并作用于靶細(xì)胞核，發(fā)揮調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞分化、增生的生物學(xué)作用，從而影響骨鈣化、骨骺生長(zhǎng)。目前研究表明，VDR基因FokI位點(diǎn)多態(tài)性與骨質(zhì)疏松[13]、鈣吸收及佝僂病[14]等骨代謝性疾病相關(guān)。Minamitani等[15]報(bào)道VDR基因FokI多態(tài)性與人的身高相關(guān)。蔣旭等[16]指出人的身高與VDR基因的多態(tài)性相關(guān)。吳越等[17]的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中提示VDR基因多態(tài)性與子代的骨骼發(fā)育相關(guān)。Endo I等[18]研究中，敲除VDR基因的小鼠中可出現(xiàn)肌纖維的萎縮，表明VDR基因可促進(jìn)肌纖維的發(fā)育。維生素D是人體必須的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在體內(nèi)經(jīng)25羥化酶羥化后生成25(OH)D3，再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成1,25(OH)2D3，最終與細(xì)胞內(nèi)特異的維生素D受體結(jié)合，調(diào)控免疫和細(xì)胞生長(zhǎng)，發(fā)揮調(diào)節(jié)鈣磷代謝和胰島素等內(nèi)分泌作用。25-羥維生素D3是循環(huán)中維生素D的主要存在形式，因其半衰期較長(zhǎng)，可達(dá)1～2個(gè)月，而且?guī)缀醪皇苋魏我蛩卣{(diào)節(jié)，故一般以血清25(OH)D3水平作為反映體內(nèi)維生素D的營(yíng)養(yǎng)狀況[19]。目前多數(shù)專家對(duì)維生素D不足及缺乏的標(biāo)準(zhǔn)是：不足為25(OH)D3水平處于50～74nmol/L，缺乏為25(OH)D3水平低于50nmol/L[20]。維生素D與人體的骨骼代謝有著密切的關(guān)系，維生素D通過(guò)與VDR相結(jié)合而發(fā)揮生物效應(yīng)。本研究中我國(guó)孕婦的維生素D水平大多不足或者缺乏，TT型基因型的孕婦及臍血25(OH)D3含量最低，TC型基因型次之，CC型的基因型最高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明VDR基因位點(diǎn)TT型吸收維生素D能力差，與本課題組前期研究結(jié)果一致[21]。本研究中，觀察組的TT+TC基因型的比例高于CC基因型，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),表明攜帶突變基因F(C)有利于胎兒股骨的發(fā)育，其機(jī)理可能是因?yàn)榈任换騠突變成F,使基因轉(zhuǎn)錄活性增強(qiáng)，增強(qiáng)了VDR蛋白對(duì)維生素D的親和力及活性，同時(shí)增加了腸道吸收維生素D的能力，有助于胎兒骨骼和肌纖維的發(fā)育。本研究中，TT型孕母血清中維生素D的水平較低。胎兒體內(nèi)的VitD來(lái)自母體，當(dāng)母體VitD缺乏時(shí)直接導(dǎo)致胎兒體內(nèi)VitD水平的下降；另一方面，VDR在本質(zhì)上是一種配體依賴性核轉(zhuǎn)錄因子，需由配體激活，當(dāng)作為配體的VitD水平下降時(shí)，會(huì)引起其受體蛋白降解加快，從而導(dǎo)致VDR表達(dá)減少[22]。VDR表達(dá)減少影響了對(duì)靶基因，如與骨骼發(fā)育有關(guān)基因DMP1、BMP2、Cbfα1等的轉(zhuǎn)錄和翻譯，導(dǎo)致骨骼發(fā)育不良。本實(shí)驗(yàn)表明，孕婦VDR基因FokI位點(diǎn)T基因可能是孤立性股骨短小發(fā)生的易感因素。但本研究樣本量不大，尚需多中心大樣本研究予以進(jìn)一步驗(yàn)證。