基于主客體作用的氟硼二吡咯超分子熒光調(diào)控及細(xì)胞成像應(yīng)用

李星宇，曠桂超

（中南大學(xué)粉末冶金研究院，湖南長沙 410083）

超分子化合物是一類由非共價(jià)鍵作用力形成的復(fù)合物。由于非共價(jià)鍵作用具有動態(tài)可逆性，使得超分子化合物可以對外界刺激做出響應(yīng)。BODIPY（氟硼二吡咯）作為一類傳統(tǒng)有機(jī)染料，具有許多優(yōu)異的光物理性質(zhì)，如高熒光量子產(chǎn)率、高摩爾消光系數(shù)、穩(wěn)定的熒光發(fā)射等，并且由于其低細(xì)胞毒性與多位點(diǎn)易于修飾的特性，BODIPY 在細(xì)胞成像中也有十分廣闊的應(yīng)用前景。

本文合成了一種8 位萘亞甲基吡啶鎓鹽修飾的BODIPY 衍生物（Naph-BDP）。通過主客體作用和靜電力作用，與葫蘆脲（CB）成功構(gòu)筑了一種新型Naph-BDP/CB 超分子化合物，采用等溫滴定量熱、熒光光譜、核磁滴定、掃描電鏡等測試方法表征了超分子化合物的結(jié)果及光物理性質(zhì)。結(jié)果表明，通過改變主客體之間的摩爾比，可以有效調(diào)控超分子化合物的熒光強(qiáng)度及聚集體形貌。進(jìn)一步理論分析表明，在超分子化合物形成過程中，客體分子與主體分子存在的靜電作用及分子間電荷轉(zhuǎn)移是提高熒光發(fā)射的主要原因。最后，成功將該新型超分子化合物應(yīng)用在細(xì)胞成像中。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 藥品和儀器

2，4-二甲基吡咯，AR；三氟乙酸；三氟化硼乙醚溶液，AR；N，N-二異丙基乙胺，AR；4-吡啶甲醛，AR；2-溴甲基萘，AR，上述均為薩恩化學(xué)技術(shù)（上海）有限公司；葫蘆脲（CB），AR，西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司；甲苯，AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

RCT Basic 型磁力攪拌器，德高 IKA 集團(tuán)；BUCHI R-210 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，瑞士 BUCHI 公司；CP124C 型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；Bruker Avance 400 Hz核磁共振波譜儀，德國 Bruker 公司；Nano SEM 230 型掃描電子顯微鏡，荷蘭Nova 公司；Hitachi U-5100型紫外可見光光度計(jì)，日本日立公司；Hitachi F-2700型熒光分光光度計(jì)，日本日立公司；FV1000 型共聚焦顯微鏡，Olympus 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 化合物Naph-BDP的制備（圖1）

圖1 化合物Naph-BDP的制備流程

化合物1: 根據(jù)文獻(xiàn)[9]合成了化合物1 并得到紅色晶體狀固體產(chǎn)物（產(chǎn)量177 mg，產(chǎn)率27%）。H NMR（CDCl）δ 8.78（dd，J = 4.4，1.5 Hz，2H），7.30（dd，J =4.3，1.6 Hz，2H），6.00（s，2H），2.55（s，6H），1.40（s，6H）。

化合物Naph-BDP：將化合物1（324 mg，1 mmol）與二溴甲基萘（343 mg，1.67 mmol）溶解于甲苯（200 mL）中。在N保護(hù)下，該混合溶液加熱至120℃并持續(xù)回流48 h。溶液冷卻后，將沉淀物過濾并將殘余物用甲苯（200 mL）洗滌。在40℃下真空干燥后，獲得紅色粉末狀固體產(chǎn)物（產(chǎn)量456 mg，產(chǎn)率86%）。H NMR（DMSO-d）. δ 9.45（d，J = 6.7 Hz，2H），8.50（d，J = 6.7 Hz，2H），8.02（d，J = 8.5 Hz，2H），7.97- 7.82（m，3H），7.65- 7.55（m，3H），6.28（s，2H），6.14（s，2H），2.47（s，6H），1.39（s，6H）.C NMR（DMSO-d），δ 156.9，151.3， 146.5， 142.4， 134.7， 132.9， 132.7， 132.0，129.1， 129.0， 128.8， 128.0， 128.0， 127.8， 127.2，127.1，125.3，122.5，63.8，40.1，40.0，39.9，39.8，39.7，39.6，39.4，39.2，39.1，14.8，14.4 ppm. ESI-MS m/z（CHBBrFN），calculated（M-Br）: 466.226 1，found:466.226 1。

1.2.2 化合物Naph-BDP與CB主客體實(shí)驗(yàn)

取不同質(zhì)量的CB溶解于相同濃度的Naph-BDP 的水溶液，形成一定比例梯度的Naph-BDP/CB 紫外熒光與一維核磁的待測液。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 超分子化合物Naph-BDP/CB結(jié)構(gòu)分析

如圖 2 所示，在 Naph-BDP 水溶液中，添加 CB 進(jìn)行滴定實(shí)驗(yàn)，可以計(jì)算出Naph-BDP/CB 的超分子復(fù)合物的摩爾比為2∶1，結(jié)合常數(shù)為4.3×10M。

圖2 Naph-BDP 與CB 等溫滴定量熱曲線（上）與TWO-SET模型擬合獲得熱力學(xué)參數(shù)（下）

為了探究Naph-BDP/CB 的超分子復(fù)合物結(jié)構(gòu)，配制系列摩爾比的混合溶液進(jìn)行一維核磁滴定（見圖3）。H NMR 滴定結(jié)果表明，在Naph-BDP 溶液中添加CB至其摩爾比為1∶0.25時，萘基和吡啶鎓鹽基團(tuán)的上的質(zhì)子信號會部分寬化并分裂。當(dāng)Naph-BDP/CB 的摩爾比增加到1∶0.5時，這些信號峰會發(fā)生更大的移動甚至消失。但是，當(dāng)加入更多的CB后，上述信號峰幾乎不再發(fā)生變化，表明該超分子復(fù)合物達(dá)到平衡，并進(jìn)一步證明了Naph-BDP/CB主客體結(jié)構(gòu)的結(jié)合比為2∶1。另外，e、f處的質(zhì)子峰較大程度向高場位移，但氟硼二吡咯基團(tuán)上的質(zhì)子峰無明顯變化，可以證明當(dāng)Naph-BDP/CB摩爾比為1∶0.5時，兩Naph-BDP分子會在CB空腔內(nèi)形成結(jié)構(gòu)為萘基和吡啶鎓基團(tuán)平行重疊的二聚體。

圖3 Naph-BDP與CB一維核磁滴定（上）與結(jié)構(gòu)示意圖（下）

2.2 超分子化合物Naph-BDP/CB[8]熒光增強(qiáng)分析

配制CB/Naph-BDP 摩爾比分別為10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%系列混合水溶液，并使Naph-BDP 濃度固定不變，在365 nm 波長下激發(fā)，得到一系列熒光發(fā)射圖譜（見圖4）。

圖4 水中不同摩爾比的復(fù)合CB/Naph-BDP的熒光光譜

從圖4可知，當(dāng)CB摩爾比增加時，超分子化合物的熒光強(qiáng)度增強(qiáng)，并且當(dāng)Naph-BDP/CB 摩爾比為1∶0.5時，熒光強(qiáng)度增強(qiáng)基本停止，這說明Naph-BDP/CB 的超分子復(fù)合物的摩爾比為2∶1，即一個CB 主體分子兩個Naph-BDP 客體分子相結(jié)合。由此可以推測，熒光增強(qiáng)的原因可能是靜電力與主客體雙重作用的結(jié)果。CB外圍的高電負(fù)性羰基會中和吡啶鎓鹽的電正性，從而減弱氟硼二吡咯基團(tuán)到吡啶鎓鹽基團(tuán)的電荷轉(zhuǎn)移，進(jìn)而增強(qiáng)了氟硼二吡咯基團(tuán)的本征發(fā)光，即圖4 中550～600 nm的熒光發(fā)射。另外，CB 環(huán)空腔剛好與雙萘基的尺寸匹配，有很強(qiáng)的主客體作用。

2.3 超分子化合物Naph-BDP/CB在細(xì)胞成像上的應(yīng)用

分別使用含有Naph-BDP（5 μM）溶液以及Naph-BDP/CB 溶液（摩爾比為1∶0.5）將人直腸癌細(xì)胞SW480染色7 h，PBS洗滌細(xì)胞3次，同時使用商用染色劑ADPI進(jìn)行示蹤，對細(xì)胞進(jìn)行共聚焦成像，見圖5。

圖5 細(xì)胞成像（上）與熒光強(qiáng)度對比（下）

圖5 中，從（a）Naph-BDP（5 μM）和（e）Naph-BDP/CB（Naph-BDP 濃度為5 μM，CB濃度為2.5 μM）的共聚焦圖像可得，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)僅存在Naph-BDP 分子時，熒光強(qiáng)度較低，但此時向該細(xì)胞中加入CB時，熒光強(qiáng)度顯著增加，具有有效的細(xì)胞成像功能，這也與在熒光光譜中得到的數(shù)據(jù)一致。（b，f）為商用染色劑ADPI；（c，g）為明場圖像，（d，h）為疊加圖，可以發(fā)現(xiàn)該熒光超分子有較強(qiáng)的染色能力，同時說明超分子化合物Naph-BDP/CB 在細(xì)胞染色與示蹤上有一定的應(yīng)用前景。

2.4 超分子化合物Naph-BDP/CB[8]微觀結(jié)構(gòu)調(diào)控分析

配制一系列不同摩爾比的超分子化合物Naph-BDP/CB水溶液，噴金后進(jìn)行掃描電鏡測試，見圖6。

圖6 Naph-BDP:CB 濃度比分別為（a，b，c）10 μM∶2.5 μM;（d，e，f）10 μM∶5 μM;（g，h，i）10 μM∶7.5 μM（j，k，l）10 μM∶10 μM的SEM圖像

從圖6 可以觀察到，當(dāng)Naph-BDP/CB 摩爾比為1∶0.25 時，超分子化合物聚集成球狀，當(dāng)摩爾比上升為1∶0.5 時，形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)榧{米球狀。而當(dāng)摩爾比繼續(xù)提高到1∶0.75 或1∶1 時，超分子結(jié)構(gòu)由球狀變化為具有高度結(jié)晶性的塊狀晶體。根據(jù)上文的結(jié)構(gòu)表征推測，當(dāng)Naph-BDP 與CB 形成主客體超分子時，能顯著改善該復(fù)合物的水溶性，并且當(dāng)摩爾比為1∶0.5 時，水溶性最佳。而當(dāng)CB 摩爾比過高時，超分子化合物更多表現(xiàn)出結(jié)晶性，從而可以通過改變摩爾比來調(diào)控超分子化合物的形貌。

3 結(jié)論

（1）本文介紹了一種通過萘基溴化物和內(nèi)消旋-（4-吡啶基）-取代的BODIPY 之間的N-烷基化反應(yīng)得到的BODIPY 衍生物分子Naph-BDP，并探究了其與CB結(jié)合形成超分子化合物的過程，證明了超分子結(jié)合摩爾比為2∶1，結(jié)合常數(shù)為4.3×10M。

（2）通過改變超分子化合物中主客體的相對含量，可以對其熒光強(qiáng)度及微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)控，并成功應(yīng)用在細(xì)胞成像中。