CV-A5抗體制備及ELISA抗原檢測(cè)方法的建立①

張小宇 靳衛(wèi)平 王文輝 吳 杰 盧 佳 孟勝利 王澤鋆 申 碩

（武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司病毒性疫苗研究一室，國(guó)家聯(lián)合疫苗工程技術(shù)研究中心，武漢430207）

手足口?。╤and，foot and mouth disease，HFMD）是由人腸道病毒（human enterovirus，HEV）引起的嬰幼兒感染為主的流行性傳染病，在我國(guó)丙類(lèi)傳染病中發(fā)病率位居第一，主要癥狀包括患兒手、足、口腔等處皮膚皰疹、潰瘍，并伴有發(fā)熱、乏力和精神萎靡等全身癥狀，少數(shù)患者可出現(xiàn)嚴(yán)重中樞神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，嚴(yán)重危害嬰幼兒健康和生命安全［1］。武漢生物制品研究所于2016～2017年在湖北省襄陽(yáng)市進(jìn)行的HFMD病原學(xué)研究表明，3 216例HFMD患兒臨床樣本中柯薩奇病毒A組5型（Coxsackievirus A5，CV-A5）感染呈高比例，且與CV-A2、CV-A6、CVA10、CV-A16和腸道病毒71型（Enterovirus 71，EV-71）共同流行，是HFMD的主要病原體之一［2-5］。CVA5屬小RNA病毒科腸道病毒屬，呈20面體球形對(duì)稱(chēng)，為單股正鏈RNA，長(zhǎng)度為7 400～7500 nt，編碼多聚蛋白?；蚪M5?末端至3?末端依次排列5?UTR，編碼區(qū)為P1、P2、P3、3?UTR及多聚腺苷酸尾。P1編碼主要結(jié)構(gòu)蛋白，終產(chǎn)物為VP1～VP4。VP1～VP3暴露于病毒粒子表面，VP4存在于病毒內(nèi)部［6］。CV-A5與諾如病毒（norovirus，NoV）GⅡ.4共同感染可能誘發(fā)間歇性楓糖尿癥（MSUD）6歲患兒首次嚴(yán)重急性腦病；CV-A5與乙型流感病毒共同感染可能引發(fā)瑞氏綜合征，對(duì)肝臟和大腦產(chǎn)生巨大損傷，如不及時(shí)治療將迅速導(dǎo)致肝腎衰竭、腦損傷，甚至死亡；CVA5原型株與EV-71重組可能導(dǎo)致HFMD暴發(fā)，并伴有嚴(yán)重神經(jīng)系統(tǒng)癥狀［7-9］。研發(fā)包含CV-A5的HFMD多價(jià)疫苗，對(duì)預(yù)防和控制CV-A5及其他腸道病毒暴發(fā)及引發(fā)的重癥具有重要意義?？乖瓩z測(cè)是疫苗工藝穩(wěn)定、質(zhì)量可控的重要保證，是質(zhì)控方法不可缺少的環(huán)節(jié)。本研究通過(guò)制備高效價(jià)CV-A5兔多克隆抗體及單克隆抗體，建立ELISA抗原檢測(cè)方法，對(duì)其準(zhǔn)確度、精密度、特異性、耐用性及穩(wěn)定性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，并應(yīng)用于非洲綠猴腎（Vero）細(xì)胞基質(zhì)十層細(xì)胞工廠(chǎng)純化病毒液過(guò)程中樣品的抗原檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材料CV-A5、狂犬病毒疫苗（rabies virus vaccine，RV）、輪狀病毒疫苗（rotavirus vaccine，Rota）、NoV、CV-A2、CV-A4、CV-A6、?？刹《?1型（echovirus 11，Echo11）、CV-A16、EV-71、SP2∕0骨髓瘤細(xì)胞、Vero細(xì)胞由武漢生物制品研究所有限公司保存；SPF級(jí)雌性BALB∕c小鼠、雄性日本大耳白兔由武漢生物制品研究所有限責(zé)任公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物室提供；HAT鹽、HT鹽、PEG∕DMSO（Mw，1450）、羊抗小鼠HRP-IgG和 羊抗兔HRP-IgG購(gòu)自武漢博士德公司；抗體亞類(lèi)鑒定試劑盒購(gòu)自洛陽(yáng)賽爾維實(shí)驗(yàn)器材有限公司；氯化銫（CsCl）、弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；Pierce BCA定量分析試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；ELISA相關(guān)試劑為本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.2 方法

1.2.1 抗原制備及鑒定 取CV-A5（7.68 lgC CID50∕ml）按照0.001 MOI接種十層細(xì)胞工廠(chǎng)培養(yǎng)，37℃培 養(yǎng)48～72 h，細(xì) 胞 病 變（cytopathic effect，CPE）達(dá)90%時(shí)收獲病毒液，濃縮，20%（W∕V）蔗糖墊底，蔗糖密度梯度離心、CsCl密度梯度離心等得到CV-A5純化抗原，12% SDS-PAGE和透射電鏡鑒定蛋白純度和顆粒完整性，BCA法測(cè)定蛋白濃度，?20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 多克隆抗體和單克隆抗體制備、純化及鑒定

1.2.2.1 多克隆抗體制備 將純化的CV-A5抗原與等體積弗氏佐劑混合（初次免疫和第1次加強(qiáng)免疫佐劑為弗氏完全佐劑，后續(xù)加強(qiáng)免疫佐劑為弗氏不完全佐劑）［10］，背部皮下多點(diǎn)注射免疫日本大耳白兔，200 μg∕劑，免疫間隔為0、3、14、28、42 d各免疫1次，末次免疫10 d后，頸動(dòng)脈采血，分離血清，即兔抗CV-A5多克隆抗體。

1.2.2.2 單克隆抗體制備 將純化的CV-A5抗原與等體積弗氏佐劑混合（首次免疫佐劑為弗氏完全佐劑，后續(xù)加強(qiáng)免疫佐劑為弗氏不完全佐劑），背部皮下及腹腔注射免疫雌性BALB∕c小鼠，60 μg∕劑，分別于0、14、28、42 d各免疫1次，第52天眼眶采血，分離血清，間接ELISA和中和試驗(yàn)檢測(cè)血清效價(jià)。選擇ELISA效價(jià)和中和抗體效價(jià)較高的小鼠進(jìn)行沖擊免疫，3 d后按照常規(guī)細(xì)胞融合技術(shù)將小鼠脾細(xì)胞與SP2∕0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。采用間接ELISA法和中和試驗(yàn)方法篩選雜交瘤細(xì)胞，篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞經(jīng)3次克隆后進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，制備腹水。

1.2.2.3 抗體純化及鑒定 采用三步飽和硫酸銨法純化CV-A5兔多克隆抗體和CV-A5單抗腹水，間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)［11］，SDS-PAGE法分析抗體純度。

1.2.3 CV-A5內(nèi)參制備 取1.2.1制備的CV-A5抗原，采用蛋白保護(hù)劑稀釋至10 μg∕ml，分裝保存作為內(nèi)參。

1.2.4 CV-A5抗原檢測(cè)法建立 包被CV-A5兔多克隆抗體從800 ng∕孔開(kāi)始進(jìn)行2倍系列陪比稀釋?zhuān)瑱z測(cè)抗體2C2-HRP按照1：200進(jìn)行2倍系列倍比稀釋?zhuān)疥嚨味ǚù_定包被抗體和酶標(biāo)抗體最佳工作濃度，建立CV-A5抗原檢測(cè)方法。

1.2.4.1 包被抗體和檢測(cè)抗體選擇 為保證雙抗體夾心ELISA體系最大程度捕獲待測(cè)CV-A5抗原，選擇高效價(jià)CV-A5兔抗血清純化后的多抗作為包被抗體。為保證雙抗體夾心ELISA體系的特異性，選擇特異性強(qiáng)的單克隆抗體2C2作為檢測(cè)抗體，采用過(guò)碘酸鈉氧化法對(duì)2C2進(jìn)行標(biāo)記，偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶分子制備2C2-HRP。

1.2.4.2 CV-A5抗原檢測(cè)方法建立 通過(guò)對(duì)ELISA檢測(cè)條件的優(yōu)化，建立CV-A5抗原檢測(cè)方法。將純化的CV-A5兔多抗用0.05 mol∕L碳酸鹽緩沖液（pH=9.6）稀釋至1 μg∕ml，包被微孔板，100 μl∕孔，4℃包被過(guò)夜。PBST洗板3次，加入封閉液（PBST配制的1% BSA），200 μl∕孔，37℃封閉1 h，棄封閉液37℃干燥2 h制備包被微孔板。加入稀釋的待測(cè)樣品，100 μl∕孔，37℃孵育1 h；洗板5次，加入2C2-HRP（1：1 000），100 μl∕孔，37℃孵育1 h；TMB顯色30 min，2 mol∕L H2SO4終止反應(yīng)，讀取A450∕A630值，繪制CV-A5抗原含量與A450∕A630均值的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，得到標(biāo)準(zhǔn)品的線(xiàn)性公式，代入A450∕A630均值，計(jì)算CV-A5抗原含量。

1.2.5 CV-A5抗原檢測(cè)方法驗(yàn)證 按照《中國(guó)藥典》四部（2015版）通則9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證［12］。

1.2.5.1 線(xiàn)性范圍及靈敏度 采用含1%牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBST將CVA5內(nèi)參依次稀釋至1 000.0、500.0、250.0、125.0、62.5、31.3、15.6 ng∕ml，按照1.2.4進(jìn)行檢測(cè)，確定線(xiàn)性范圍，重復(fù)檢測(cè)5次。

1.2.5.2 特異性 采用建立的方法分別檢測(cè)CVA5收獲液、CV-A5空心顆粒（empty particles，EP）、CV-A5實(shí)心顆粒（full particles，F(xiàn)P）、RV、Rota、NoV、CV-A2、CV-A4、CV-A6、Echo11、CV-A16、EV-71、BSA、Vero細(xì)胞裂解液，各待檢抗原的蛋白濃度均調(diào)整為10 μg∕ml。

1.2.5.3 準(zhǔn)確度 將CV-A5內(nèi)參稀釋至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個(gè)濃度，采用CV-A5抗原檢測(cè)法分別對(duì)3個(gè)濃度樣品進(jìn)行檢測(cè)，各樣品平行檢測(cè)5孔，試驗(yàn)重復(fù)測(cè)定2次，計(jì)算回收率。

1.2.6 精密度檢測(cè)

1.2.6.1 重復(fù)性 將CV-A5內(nèi)參稀釋至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個(gè)濃度，同一試驗(yàn)人員不同時(shí)間采用CV-A5抗原檢測(cè)法分別對(duì)3個(gè)濃度樣品進(jìn)行3次檢測(cè)，計(jì)算同一濃度樣品測(cè)定結(jié)果的CV。

1.2.6.2 中間精密度 將CV-A5內(nèi)參稀釋至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個(gè)濃度，不同試驗(yàn)人員采用CV-A5抗原檢測(cè)法分別對(duì)3個(gè)濃度樣品進(jìn)行檢測(cè)，計(jì)算同一濃度樣品測(cè)定結(jié)果的CV。

1.2.7 耐用性檢測(cè) ①孵育時(shí)間變化檢測(cè)每步孵育時(shí)間偏差對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的影響，即每組操作加入待檢抗原、酶結(jié)合物、底物A和B的孵育時(shí)間分別為55 min～55 min～25 min；60 min～60 min～30 min；65 min～65 min～35 min。②孵育溫度變化檢測(cè)孵育溫度偏差對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的影響，即每組操作中采用的孵育溫度分別為35℃、37℃、39℃。③加樣體積變化檢測(cè)每步加樣體積偏差對(duì)最終檢測(cè)結(jié)果的影響，即每組操作中采用的加樣體積分別為95 μl、100 μl、105 μl。

1.2.8 穩(wěn)定性檢測(cè) 將包被的酶標(biāo)板置于37℃孵育3 d，將CV-A5內(nèi)參稀釋至高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個(gè)濃度，37℃孵育3 d和4℃放置的CV-A5抗原檢測(cè)試劑分別對(duì)3個(gè)濃度樣品進(jìn)行檢測(cè)，比較37℃孵育3 d和4℃放置試劑的檢測(cè)結(jié)果差異。

1.2.9 建立檢測(cè)方法的初步應(yīng)用 用建立的方法檢測(cè)CV-A5細(xì)胞工廠(chǎng)純化過(guò)程樣品1～7［CV-A5 Vero細(xì)胞病毒收獲液、濃縮液、濃縮后廢液、20%（W∕V）蔗糖墊底上清樣品及重懸樣品、CsCl密度梯度離心后樣品］的抗原含量。

2 結(jié)果

2.1 CV-A5全病毒顆?？乖b定12% SDSPAGE結(jié)果顯示，純化的CV-A5抗原在相應(yīng)位置出現(xiàn)VP1、VP2和VP3目的蛋白條帶，其他位置未出現(xiàn)明顯條帶（圖1A）。電鏡分析結(jié)果顯示，純化的CVA5全病毒顆粒直徑為27～30 nm，形態(tài)完整，大小均一（圖1B）。

圖1 病毒顆粒純化鑒定Fig.1 Purification identification of virus particle

2.2 單克隆抗體篩選鑒定 間接ELISA法共篩選出9株CV-A5單克隆抗體，9株單抗同時(shí)進(jìn)行中和實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，均無(wú)法中和CV-A5病毒，表明這9株單抗均無(wú)中和活性。其中，1A11和1H4可識(shí)別其他型別腸道病毒，為群特異性廣譜單抗。其他與CV-A5特異性結(jié)合的單抗中，2C2僅與CV-A5反應(yīng)，且ELISA效價(jià)最高，經(jīng)抗體亞類(lèi)鑒定其亞型為IgG2b（圖2）。

圖2 單克隆抗體特異性分析Fig.2 Specific identification of monoclonal antibody

2.3 CV-A5多克隆抗體和單克隆抗體純化鑒定ELISA結(jié)果顯示，抗CV-A5兔多抗及抗CV-A5單抗2C2腹水的效價(jià)分別為107和106。SDS-PAGE顯示，純化的CV-A5兔多抗及CV-A5單抗2C2腹水在相對(duì)分子質(zhì)量50 kD～25 kD分別可見(jiàn)與預(yù)期重鏈、輕鏈相對(duì)分子質(zhì)量一致的條帶，其他位置未見(jiàn)明顯條帶（圖3）。

圖3 抗體純化鑒定Fig.3 Purification identification of antibody

2.4 CV-A5抗原檢測(cè)方法驗(yàn)證

2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)范圍及靈敏度 重復(fù)檢測(cè)3次的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程分別為：y=514.48x-68.45，y=509.45x-64.57，y=502.11x-64.78，r2分 別 為0.98、0.98、0.97。檢測(cè)范圍為15.6～1 000.0 ng∕ml，檢測(cè)范圍內(nèi)抗原含量與相應(yīng)A值呈顯著相關(guān)，r2＞0.97。

2.4.2 特異性 采用所建立的方法檢測(cè)抗原，結(jié)果顯示，抗原僅識(shí)別CV-A5收獲液、EP、FP，而不識(shí)別其他型別腸道病毒、Rota、NoV、RV，說(shuō)明所建立的抗原檢測(cè)方法特異性良好（圖4）。

圖4 特異性驗(yàn)證結(jié)果Fig.4 Specific verification results

2.4.3 準(zhǔn)確度CV-A5內(nèi)參高、中、低3個(gè)濃度樣品回收率分別為99.4%～128.7%，93.2%～103.1%，88.5%～95.0%，表明該方法準(zhǔn)確度良好（表1）。

表1 準(zhǔn)確度驗(yàn)證結(jié)果Tab.1 Accuracy verification results

2.4.4 定量檢測(cè)方法精密度分析

2.4.4.1 重復(fù)性CV-A5內(nèi)參高、中、低3個(gè)濃度樣品CV分別為1.3%、3.2%、1.2%，表明該方法重復(fù)性良好（表2）。

表2 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果Tab.2 Repeatability verification results

2.4.4.2 中間精密度CV-A5內(nèi)參高、中、低3個(gè)濃度樣品測(cè)定結(jié)果的CV分別為2.1%、2.2%和3.5%，表明該方法中間精密度良好（表3）。

表3 中間精密度驗(yàn)證結(jié)果Tab.3 Intermediate precision verification results

2.4.5 耐用性 理想操作即全程孵育溫度為37℃，孵育時(shí)間60 min～60 min～30 min，加樣體積為100 μl；偏差下限即全程孵育溫度為35℃，孵育時(shí)間55 min～55 min～25 min，加樣體積為95 μl；偏差上限即全程孵育溫度為39℃，孵育時(shí)間65 min～65 min～35 min，加樣體積為105 μl。高（500.0 ng∕ml）、中（250.0 ng∕ml）、低（125.0 ng∕ml）3個(gè)濃度不同檢測(cè)條件下，回收率為97.4%～127.6%，表明該方法耐用性良好（圖5）。

圖5 耐用性驗(yàn)證結(jié)果Fig.5 Durability verification results

2.4.6 穩(wěn)定性CV-A5抗原檢測(cè)試劑37℃孵育3 d后，用于檢測(cè)500.0、250.0、125.0 ng∕ml的CVA5抗原含量，樣品回收率為101.7%～106.9%，表明CV-A5抗原檢測(cè)試劑穩(wěn)定性良好（圖6）。

圖6 穩(wěn)定性驗(yàn)證結(jié)果Fig.6 Stability verification results

2.5 方法應(yīng)用 采用CV-A5抗原檢測(cè)方法檢測(cè)Vero細(xì)胞基質(zhì)十層細(xì)胞工廠(chǎng)純化過(guò)程樣品檢測(cè)，結(jié)果顯示其可用于CV-A5純化過(guò)程不同階段樣品的抗原含量監(jiān)測(cè)（圖7）。

圖7 方法應(yīng)用驗(yàn)證結(jié)果Fig.7 Method application verification results

3 討論

近年來(lái)，CV-A5在中國(guó)大陸地區(qū)腸道病毒病原譜中日益活躍，但國(guó)內(nèi)外對(duì)CV-A5的研究較少，CVA5單克隆抗體研制及相關(guān)抗原檢測(cè)方法的建立鮮有報(bào)道。目前針對(duì)抗病毒類(lèi)抗體的免疫原主要為全病毒和重組蛋白，重組蛋白作為免疫原制備的抗體存在反應(yīng)性不佳、穩(wěn)定性差、不與病毒發(fā)生反應(yīng)等問(wèn)題。本研究采用全病毒作為免疫原，制備高效價(jià)的單克隆抗體和多克隆抗體，并建立ELISA抗原檢測(cè)方法。ELISA法檢測(cè)病毒抗原具有快速、簡(jiǎn)單和成本低等優(yōu)點(diǎn)，是目前應(yīng)用廣泛的方法［13］。ELISA反應(yīng)體系易受外界因素影響，如加樣體積、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、試劑穩(wěn)定性等。本研究考慮到不同試驗(yàn)人員的操作誤差，在最大誤差波動(dòng)范圍內(nèi)進(jìn)行試驗(yàn)，回收率為97.4%～127.6%，并對(duì)其準(zhǔn)確度、精密度、特異性及穩(wěn)定性進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證，可初步應(yīng)用于Vero細(xì)胞基質(zhì)十層細(xì)胞工廠(chǎng)純化過(guò)程及各階段樣品的抗原檢測(cè)?？乖瓩z測(cè)結(jié)果提示，抗原純化過(guò)程中，不同純化步驟存在不同程度抗原損失，可針對(duì)損失抗原較多的純化方法進(jìn)行改良，以減少不必要損失。

綜上所述，本研究以CV-A5多克隆抗體為捕獲抗體，以單克隆抗體2C2為檢測(cè)抗體，初步建立了快速檢測(cè)CV-A5抗原的雙抗體夾心ELISA抗原檢測(cè)方法。該方法準(zhǔn)確性、精密度、特異性、耐用性等均符合《中華人民共和國(guó)藥典》四部（2015年版）通則9101要求，可用于CV-A5抗原的定量檢測(cè)，可為包含CV-A5的HFMD多價(jià)疫苗的質(zhì)量控制和工藝開(kāi)發(fā)提供參考。