蘿卜硫素對子宮內(nèi)膜異位癥模型大鼠在位內(nèi)膜增殖、血管生成及JAK2∕STAT3信號通路的影響①

盧建軍 戴曉怡 李 響 丁 陽 張 微（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，呼和浩特010059）

子宮內(nèi)膜異位癥（eutopic endometrium，EMT）為一種常見的婦科疾病，在育齡期女性中發(fā)病率比較高，且有逐年上升的趨勢；大部分EMT患者有痛經(jīng)和不孕，對女性的身體健康造成嚴(yán)重危害。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)EMT的在位內(nèi)膜和非EMT的正常子宮內(nèi)膜在分子生物學(xué)特征和組織學(xué)上有顯著不同，這些功能異常的EMT在位內(nèi)膜具有更強(qiáng)的腹腔種植潛能，在EMT的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［1］。蘿卜硫素（sulforaphane，SFN）為一種比較有前景的化合物，在惡性腫瘤的防治中具有重要價值，SFN具有調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、影響細(xì)胞增殖和凋亡、影響血管生成等方面具有重要作用，故對多種疾病具有治療作用［2-3］。SFN在EMT中作用也引起大家關(guān)注，王靜等［4］研究發(fā)現(xiàn)，SFN可抑制EMT大鼠的病灶體積和黏連評分，對大鼠EM具有保護(hù)作用。但SFN對EMT在位內(nèi)膜的影響尚不十分清楚。本文研究SFN對EMT模型大鼠在位內(nèi)膜增殖、血管生成及JAK2∕STAT3信號通路的影響，探討SFN對ENT大鼠在位內(nèi)膜的影響及可能機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 材料 實驗動物：清潔級雌性SD大鼠，8～9周齡，體重230～250 g，購自北京市醫(yī)療器械檢驗所，許可證號：SYXK（京）2015-0005。主要試劑和儀器：胡蘿卜素（美國Sigma公司）；兔抗鼠增殖細(xì)胞核抗原（PCNA）單克隆抗體、兔抗鼠CD34單克隆抗體、兔抗鼠細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）單克隆抗體、兔抗鼠血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）單克隆抗體、兔抗鼠JAK2單克隆抗體、兔抗鼠磷酸化JAK2（p-JAK2）單克隆抗體、兔抗鼠STAT3單克隆抗體、兔抗鼠p-STAT3單克隆抗體（美國BD公司）；DAB顯色試劑盒（美國Santa Cruz公司）；倒置相差顯微鏡（美國Beckman Coulter公司）等。

1.2 方法

1.2.1 建立EMT模型及分組 將75只大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，每天進(jìn)行陰道涂片檢查以了解大鼠的月經(jīng)周期，取動情周期4～5 d、有連續(xù)2個正常動情周期的大鼠70只，隨機(jī)取12只作為對照組（C組），其余58只在動情期建立EMT模型，具體方法［5］：造模前24 h給予戊酸雌二醇（0.2 mg∕只）灌胃，建模時采用腹腔注射3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，刮除腹部毛發(fā)，暴露腹腔，從子宮肌層獲取子宮內(nèi)膜組織，將其剪成5 mm×5 mm碎片，移植到大鼠腹壁內(nèi)表面，每只大鼠移植3塊子宮內(nèi)膜組織碎片。術(shù)后連續(xù)3 d給予青霉素鈉腹腔注射預(yù)防感染，術(shù)后10 d開始進(jìn)行戊酸雌二醇（0.2 mg∕只）灌胃，連續(xù)5 d。造模后第4周，選擇動情期大鼠剖腹檢查，見移植子宮內(nèi)膜體積增大，呈囊狀或透明結(jié)節(jié)狀，內(nèi)有液體聚集，表面有血管形成和結(jié)締組織覆蓋為造模成功。共造模成功49只大鼠，取其中48只，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字法分為模型組（M組）、SFN 5 mg∕kg、10 mg∕kg和15 mg∕kg組，每組12只。C組大鼠只開腹不移植。

1.2.2 處理 建模成功后，SFN 5 mg∕kg、10 mg∕kg和15 mg∕kg組大鼠每日清晨分別給予5 mg∕kg、10 mg∕kg、15 mg∕kg生理鹽水稀釋的SFN灌胃［4］；C組和M組大鼠每日清晨給予等量生理鹽水灌胃，共3周。

1.2.3 標(biāo)本采集 末次給藥24 h后，戊巴比妥鈉麻醉大鼠，開腹，剪下移植物和子宮，放入甲醛中固定。剝離子宮內(nèi)膜，將子宮內(nèi)膜組織分為2部分，一部分經(jīng)脫水、透明、石蠟包埋，切成4 μm厚切片，用于免疫組化染色；另一部分子宮內(nèi)膜組織用于Western blot測定。

1.2.4 移植物重量和體積測定 分離移植物，天平稱取移植物重量；游標(biāo)卡尺測量移植物長、寬和高，計算移植物體積（體積=0.52×長×寬×高）。

1.2.5 免疫組化染色測定在位內(nèi)膜組織中胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）表達(dá) 將石蠟切片進(jìn)行脫蠟、水化，過氧化氫室溫孵育10 min，山羊血清封閉30 min，加入一抗：兔抗鼠PCNA單克隆抗體（1：100）過夜孵育，加入二抗孵育1 h，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。高倍視野下觀察PCNA染色情況。以一抗生成商提供的PCNA表達(dá)陽性的組織切片為陽性對照，采用PBS代替一抗作為陰性對照。結(jié)果觀察：PCNA主要在子宮內(nèi)膜腺上皮細(xì)胞的胞漿中表達(dá)，鏡下呈棕黃色的顆粒為陽性細(xì)胞。采用Riosens Digital Imaging SystEMT系統(tǒng)分析圖像灰度值，灰度值越高表明陽性表達(dá)量越低，灰度值越低表明陽性表達(dá)越高。

1.2.6 免疫組化測定在位內(nèi)膜微血管密度（microvessel density，MVD） 采用常規(guī)SP法測定MVD（通過CD34）：將石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，加入過氧化氫孵育15 min滅活內(nèi)源性酶，將切片浸入枸櫞酸鹽緩沖液熱修復(fù)抗原，加入血清封閉液室溫放置15 min，加入一抗即兔抗鼠CD34單克隆抗體（1：200）過夜孵育，加入二抗孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復(fù)染，鹽酸乙醇分化，氨水返藍(lán)，常規(guī)脫水、透明、封片。以血管瘤組織切片為陽性對照，以PBS代替一抗為陰性對照。采用WEIDNER法［6］計數(shù)高倍視野下MVD。

1.2.7 Western blot測定在位內(nèi)膜組織中cyclin D1、VEGF、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平 將在位內(nèi)膜組織剪碎，加入RIPA裂解液，提取總蛋白，采用BCA法測定總蛋白濃度，每孔上樣30 μg，經(jīng)電泳分離、轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉封閉，加入一抗（1：200）兔抗鼠cyclin D1單克隆抗體、兔抗鼠VEGF單克隆抗體、兔抗鼠JAK2單克隆抗體、兔抗鼠p-JAK2單克隆抗體、兔抗鼠STAT3單克隆抗體、兔抗鼠p-STAT3單克隆抗體過夜孵育，加入二抗（1：3 000）孵育1 h，ECL發(fā)光，掃描圖像，以β-actin為內(nèi)參，Image J分析條帶灰度值。目標(biāo)蛋白水平=目標(biāo)蛋白條帶灰度值∕β-actin條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行分析，異位病灶重量和體積、在位內(nèi)膜厚度、PCNA灰度值、MVD值以及cyclin D1、VEGF、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平經(jīng)檢驗符合正態(tài)分布，以均±s表示，各組間比較采用單因素方差分析，組內(nèi)兩兩比較采用LSD檢驗，取P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度SFN對大鼠異位病灶重量和體積比較 各組大鼠異位病灶重量和體積比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。不同濃度SFN組大鼠異位病灶重量和體積均較小于模型組（P＜0.05），且SFN對大鼠異位病灶重量和體積的影響呈劑量依賴性。因3種劑量治療均有療效，故本文采用中劑量SFN 10 mg∕kg組進(jìn)行后續(xù)研究。見表1。

表1 各組大鼠異位病灶重量和體積比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of weight and volume of ectopic le?sions of in rats each group（±s，n=12）

表1 各組大鼠異位病灶重量和體積比較（±s，n=12）Tab.1 Comparison of weight and volume of ectopic le?sions of in rats each group（±s，n=12）

Note：Compared with M group，1）P＜0.05.

Groups M SFN 5 mg∕kg SFN 10 mg∕kg SFN 15 mg∕kg F P Weight（mg）148.37±22.46 117.35±18.731）103.24±19.021）86.54±18.431）21.197＜0.001 Volume（mm3）115.34±13.21 83.24±12.631）75.31±11.681）67.52±11.821）34.681＜0.001

2.2 各組大鼠在位內(nèi)膜厚度比較 各組大鼠在位內(nèi)膜厚度比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg組大鼠在位內(nèi)膜厚度小于M組（P＜0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中PCNA蛋白表達(dá)情況 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中PCNA蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），M組大鼠在位內(nèi)膜組織中PCNA蛋白灰度值低于C組（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg組大鼠在位內(nèi)膜組織中PCNA蛋白灰度值高于M組（P＜0.05）。見表2、圖1。

圖1 免疫組化測定各組大鼠在位內(nèi)膜組織中PCNA蛋白表達(dá)（×400）Fig.1 Immunohistochemistry determination of PCNA protein expression in eutopic endometrial tissue of rats in each group（×400）

2.4 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中MVD值 見表2、圖2，各組大鼠在位內(nèi)膜組織中MVD值比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），M組大鼠在位內(nèi)膜組織中MVD值高于C組（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg組大鼠在位內(nèi)膜組織中MVD值低于M組（P＜0.05）。

表2 各組大鼠在位內(nèi)膜厚度、PCNA灰度值、MVD值比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison of eutopic endometrial thickness，PC?NA gray value and MVD value of rats in each group（±s，n=12）

表2 各組大鼠在位內(nèi)膜厚度、PCNA灰度值、MVD值比較（±s，n=12）Tab.2 Comparison of eutopic endometrial thickness，PC?NA gray value and MVD value of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05.

Groups CM SFN 10 mg∕kg FP Eutopic endometrial thickness（μm）476.13±15.76 528.16±16.351）492.89±15.371）2）33.769＜0.001 PCNA gray 132.14±12.07 75.32±11.261）93.61±11.381）2）75.342＜0.001 MVD（pcs∕HP）9.71±1.56 15.32±1.621）13.24±1.471）2）40.111＜0.001

圖2 免疫組化測定各組大鼠在位內(nèi)膜組織中MVD（×400）Fig.2 Immunohistochemistry determination of MVD in eu?topic endometrial tissue of rats in each group（×400）

2.5 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中cyclin D1和VEGF蛋白表達(dá) 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中cyclin D1和VEGF蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），M組大鼠在位內(nèi)膜組織中cyclin D1和VEGF蛋白水平高于C組（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg組大鼠在位內(nèi)膜組織中cyclin D1和VEGF蛋白水平低于M組（P＜0.05）。見表3、圖3。

表3 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中cyclin D1和VEGF蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of cyclin D1 and VEGF protein levels in eutopic endometrial tissue of rats in each group（±s，n=12）

表3 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中cyclin D1和VEGF蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.3 Comparison of cyclin D1 and VEGF protein levels in eutopic endometrial tissue of rats in each group（±s，n=12）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05.

Groups CM SFN 10 mg∕kg F P cyclin D1 0.09±0.03 0.64±0.071）0.25±0.061）2）306.511＜0.001 VEGF 0.12±0.04 0.51±0.061）0.31±0.071）2）135.564＜0.001

圖3 Western blot測定各組大鼠在位內(nèi)膜組織中cyclin D1和VEGF蛋白水平Fig.3 Western blot determination of cyclin D1 and VEGF protein levels in eutopic endometrial tissue of rats in each group

2.6 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中JAK2∕STAT3信號通路相關(guān)蛋白表達(dá) 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中JAK2、STAT3蛋白水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；各組大鼠在位內(nèi)膜組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），M組大鼠在位內(nèi)膜組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平高于C組（P＜0.05），SFN 10 mg∕kg組大鼠在位內(nèi)膜組織中p-JAK2、p-STAT3蛋白水平低于M組（P＜0.05）。見表4、圖4。

表4 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein levels in eutopic endometrial tissue of each group of rats（±s，n=12）

表4 各組大鼠在位內(nèi)膜組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平比較（±s，n=12）Tab.4 Comparison of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein levels in eutopic endometrial tissue of each group of rats（±s，n=12）

Note：Compared with C group，1）P＜0.05；compared with M group，2）P＜0.05.

Groups CM SFN10 mg∕kg F P JAK2 0.39±0.06 0.40±0.07 0.37±0.08 0.564 0.574 p-JAK2 0.08±0.02 0.37±0.051）0.17±0.031）2）208.737＜0.001 STAT3 0.33±0.07 0.34±0.06 0.32±0.07 0.269 0.766 p-STAT3 0.09±0.02 0.54±0.091）0.18±0.031）2）217.149＜0.001

圖4 Western blot測定各組大鼠在位內(nèi)膜組織中JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白水平Fig.4 Western blot determination of JAK2，p-JAK2，STAT3 and p-STAT3 protein levels in eutopic endo?metrial tissue of each group of rats

3 討論

在EMT發(fā)病的多種學(xué)說中，經(jīng)血逆流學(xué)說占主導(dǎo)地位，在位內(nèi)膜異常在EMT的發(fā)生發(fā)展中的作用越來越受到重視，“在位內(nèi)膜決定論”證實基于對EMT在位內(nèi)膜在其發(fā)病中的作用提出的假說［7］。本研究發(fā)現(xiàn)EMT模型大鼠動情期子宮內(nèi)膜厚度大于對照組，表明EMT造?？筛淖冏訉m內(nèi)膜微環(huán)境，可促進(jìn)在位內(nèi)膜增殖。子宮內(nèi)膜的厚度和內(nèi)膜細(xì)胞的增殖關(guān)系密切，PCNA為細(xì)胞增殖的標(biāo)志，其表達(dá)升高表明細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)；cyclin D1的主要功能為促進(jìn)細(xì)胞增殖，其水平升高在一定程度上也可反映細(xì)胞增殖能力。血管生成為EMT種植生長維持的必要條件，MVD為評價血管生成的指標(biāo)，其值越高表明毛細(xì)血管越豐富；VEGF為促血管生成因子，其水平越高表明促血管生成作用越強(qiáng)。本研究發(fā)現(xiàn)EMT模型大鼠動情期在位內(nèi)膜組織PCNA、cyclin D1、MVD、VEGF均升高，表明EMT造?？蓪?dǎo)致在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖能力和血管生成能力增強(qiáng)，抑制在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖和血管生成有助于EMT治療。

SFN為西蘭花屬植物中提取的生物活性物質(zhì)，是比較強(qiáng)的抗氧化能力物質(zhì)之一，除了抗氧化作用，其在調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖、惡性腫瘤的多種疾病的防治，卵巢早衰、卵巢癌等女性生殖系統(tǒng)疾病中都發(fā)揮重要作用［8-10］。本文針對SFN對EMT的作用進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SFN可抑制EMT異位病灶的重量和體積，表明SFN對EMT具有治療作用。

多種研究發(fā)現(xiàn)SFN具有抑制細(xì)胞增殖的作用，如研究發(fā)現(xiàn)SFN可抑制卵巢癌、犬骨肉瘤、人皮鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖［11-13］。SFN在抑制血管生成中也發(fā)揮重要作用，如SFN可抑制黑色素瘤的血管生成發(fā)揮抗黑色素瘤體內(nèi)生長的能力，通過促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抗血管生成、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期等在惡性腫瘤的治療中發(fā)揮作用［14-15］。上述研究表明SFN可通過抑制血管生成發(fā)揮對惡性腫瘤生長的抑制作用?；贓MT在位內(nèi)膜的增殖和血管生成在EMT發(fā)病中發(fā)揮重要作用，SFN具有抑制細(xì)胞增殖和血管形成的作用。在EMT動物模型研究中發(fā)現(xiàn)造模可引起在位內(nèi)膜在細(xì)胞生長、細(xì)胞侵襲、血管生成、性激素代謝等方面異常，表明異位病灶可引起在位內(nèi)膜的生物學(xué)特征異常［16］；如果治療EMT的藥物在治療異位病灶的同時可糾正在位內(nèi)膜的異常狀態(tài)，可有助于EMT的治療，在防治EMT復(fù)發(fā)方面可能也具有一定作用。本文研究發(fā)現(xiàn)SFN可降低在位內(nèi)膜組織中PCNA、cyclin D1、MVD、VEGF水平，表明SFN對EMT在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖和血管生成具有抑制作用。分析SFN在治療EMT異位病灶的同時，可抑制EMT細(xì)胞增殖和血管生成發(fā)揮糾正EMT在位內(nèi)膜的異常狀態(tài)，從而發(fā)揮對EMT的保護(hù)作用。

SFN可通過多種信號通路發(fā)揮作用，如SFN可通過JAK2∕STAT3抑制脂多糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大；SFN通過JAK2∕STAT3信號通路發(fā)揮缺血再灌注心肌細(xì)胞的保護(hù)作用［17-19］。JAK2∕STAT3參與EMT的發(fā)病過程，可調(diào)控子宮內(nèi)膜異位細(xì)胞的遷移和侵襲［20-21］。SFN是否通過JAK2∕STAT3信號通路發(fā)揮對EMT的保護(hù)作用？本研究發(fā)現(xiàn)SFN可降低EMT在位內(nèi)膜組織中p-JAK2、p-STAT3水平，表明SFN可抑制EMT在位內(nèi)膜組織中JAK2∕STAT3信號通路的激活。研究發(fā)現(xiàn)JAK2∕STAT3參與細(xì)胞增殖和血管形成過程，故推測SFN可能通過抑制JAK2∕STAT3信號通路激活抑制在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖和血管形成，從而發(fā)揮對EMT的保護(hù)作用［22-23］。

綜上所述，SFN可能通過對EMT在位內(nèi)膜細(xì)胞增殖和血管生成的抑制作用發(fā)揮對EMT的保護(hù)作用，其機(jī)制可能與SFN抑制在位內(nèi)膜組織中JAK2∕STAT3信號通路的激活有關(guān)。