飼料中黃霉素A含量測(cè)定的研究進(jìn)展

周迎春 華向美 劉少博

1.河南進(jìn)口肉類指定口岸漯河查驗(yàn)區(qū)服務(wù)中心，河南漯河 462300；2.中華人民共和國(guó)漯河海關(guān)，河南漯河 462300；3.大咖國(guó)際食品有限公司，河南焦作 454850

黃霉素又稱富拉磷[1]、默諾霉素、斑伯霉素、黃磷脂素[2]或黃磷脂醇素、富樂(lè)霉素，它是一種多組分磷酸糖脂類抗生素，由灰綠鏈霉菌厭氧發(fā)酵產(chǎn)生[3-5]。黃霉素呈弱酸性，屬于強(qiáng)極性化合物，易溶于水、甲醇、二甲基甲酰胺等小分子物質(zhì)[6]；200 ℃開(kāi)始分解[7]，在中性水和甲醇溶液中穩(wěn)定[8]，紫外吸收峰為258 nm[9]。

現(xiàn)有研究表明，黃霉素有5種活性成分，皆具有類似的化學(xué)特性和抗菌活性[10-11]，黃霉素A 是黃霉素中最主要活性組分[12]，占活性組分總量60%～80%[13]，我國(guó)規(guī)定黃霉素A 的相對(duì)量應(yīng)大于50%[14]。由于黃霉素5種活性成分結(jié)構(gòu)相似且難以生產(chǎn)單一成分的標(biāo)準(zhǔn)品，因此，目前的研究中多通過(guò)檢測(cè)黃霉素A的含量來(lái)衡量黃霉素的含量。

1 黃霉素的應(yīng)用及危害

黃霉素作為國(guó)外上市最早的一種抗生素飼料添加劑，它曾是國(guó)外唯一允許在養(yǎng)殖業(yè)中使用的含磷糖脂類抗生素。黃霉素用量少，卻對(duì)牛、豬、雞等動(dòng)物促生長(zhǎng)效果突出[15]，提高飼料利用效率[16]，可用于預(yù)防球蟲(chóng)病[17]，抑制細(xì)菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌、雙球菌、巴氏桿菌、布氏桿菌等[18-20]，與其他藥物添加劑如維生素、氨基酸、微量元素等無(wú)配伍禁忌[21]。黃霉素具有的顯著優(yōu)勢(shì)使其被廣泛用于畜禽和水產(chǎn)養(yǎng)殖中。

在美國(guó)，黃霉素被批準(zhǔn)用于牛、豬和家禽，但使用水平應(yīng)在0.5～20 mg/kg，可以單獨(dú)使用，也可以與莫能菌素、拉沙里菌素或鹽霉素等離子載體抗生素聯(lián)合使用，以提高增重率和飼料效率[22]。2002年我國(guó)原農(nóng)業(yè)部正式批準(zhǔn)黃霉素預(yù)混劑為新獸藥，并在同年引進(jìn)外國(guó)先進(jìn)的黃霉素生產(chǎn)工藝技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模生產(chǎn)[23]。黃霉素以及所有與其有關(guān)的產(chǎn)品已被廣泛使用在我國(guó)畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖中來(lái)提高動(dòng)物的生長(zhǎng)繁殖性能[24]。2005年歐盟農(nóng)業(yè)部長(zhǎng)會(huì)議決定，自2006年1月1日起，禁止在飼料中添加黃霉素[25]，2009年9月30日起黃霉素僅允許用于兔子飼養(yǎng)過(guò)程中[1]。

研究表明，黃霉素可引起瘤胃細(xì)菌的適應(yīng)性反應(yīng)，從而顯著改變其抗生素敏感性[26]。黃霉素本身無(wú)抗原性，與其他常用的抗生素之間有無(wú)交叉抗原性有待深入研究。作為非代謝類藥物，黃霉素經(jīng)口服后幾乎不被吸收，一方面可能在動(dòng)物產(chǎn)品中殘留[27]，另一方面通過(guò)動(dòng)物糞便會(huì)不可避免地排到環(huán)境中，容易污染土壤、地表水等環(huán)境[28]，進(jìn)而可能給人類安全帶來(lái)威脅。長(zhǎng)期食用黃霉素殘留的動(dòng)物源食品會(huì)破壞人體腸道菌群[29]；對(duì)動(dòng)物的骨骼發(fā)育有影響，大量攝入甚至?xí)a(chǎn)生造血功能障礙[30]，其對(duì)動(dòng)物及人體的其他危害還有待于深入研究[15]。

2016年8月，國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委等十四部委聯(lián)合發(fā)布《遏制細(xì)菌耐藥國(guó)家行動(dòng)計(jì)劃（2016-2020年）》，黃霉素作為一種抗菌藥物，不可例外地受到風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估[31]。檢驗(yàn)檢疫部門(mén)也將黃霉素列為飼料和動(dòng)物源性食品殘留監(jiān)控計(jì)劃[32]。農(nóng)業(yè)農(nóng)村部第194號(hào)公告指出[33]，自2020年1月1日起，退出除中藥外的所有促生長(zhǎng)類藥物飼料添加劑品種，這其中就包含禁用黃霉素預(yù)混劑。對(duì)飼料中黃霉素A 的含量進(jìn)行檢測(cè)是實(shí)現(xiàn)源頭治理的關(guān)鍵，因此有必要深入了解黃霉素A測(cè)定方法的研究進(jìn)展。

2 黃霉素A 檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展及存在的問(wèn)題

目前針對(duì)黃霉素檢測(cè)技術(shù)的研究主要是對(duì)其主要活性組分黃霉素A 的測(cè)定，一般通過(guò)檢測(cè)黃霉素A 的含量間接計(jì)算樣品中黃霉素的添加量。檢測(cè)技術(shù)主要有液相色譜法[34]、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[30]、離子對(duì)高效液相色譜法[35]，測(cè)定對(duì)象多為飼料，個(gè)別為豬肉、禽類組織。

2.1 液相色譜法檢測(cè)進(jìn)展及存在問(wèn)題

2003年楊秀玉等[9]利用液相色譜法對(duì)規(guī)格為4%和8%的黃霉素預(yù)混劑及各生產(chǎn)廠家提供的標(biāo)準(zhǔn)品中黃霉素A 的相對(duì)量進(jìn)行了檢測(cè)。試驗(yàn)利用YMC-Pack ODS-A S 色譜柱、乙腈＋甲酸銨溶液(45＋55)等度洗脫對(duì)黃霉素5種活性組分進(jìn)行分離，采用高效液相色譜儀，在258 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)下，用紫外檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，最后利用歸一化法計(jì)算黃霉素A的相對(duì)量。該方法操作簡(jiǎn)便、快速，但定量結(jié)果與外標(biāo)法相比，誤差較大。

我國(guó)2006年版《進(jìn)口獸藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[36]指出，可通過(guò)液相色譜法來(lái)檢測(cè)黃霉素預(yù)混劑中黃霉素A含量。該測(cè)定方法與2003年楊秀玉等[9]研究方法相似，采用歸一化法定量，與外標(biāo)法相比，不能很好地反映黃霉素A實(shí)際含量。

江蘇省實(shí)施的地方標(biāo)準(zhǔn)《DB32/T 1279-2008 飼料和飼料添加劑中黃霉素A 的測(cè)定高效液相色譜法》[37]中指出：飼料和飼料添加劑中黃霉素A 經(jīng)甲醇水提取，中性氧化鋁柱凈化，乙腈＋甲酸銨溶液(45＋55)等度洗脫，C18 色譜柱分離，紫外檢測(cè)器258 nm 波長(zhǎng)測(cè)定，采用外標(biāo)法定量，可使飼料和飼料添加劑方法檢出限達(dá)到1 000μg/kg。

2010年，李會(huì)榮等[38]建立了利用高效液相色譜儀測(cè)定飼料中黃霉素A含量的方法。稱5 g飼料，樣品中的黃霉素經(jīng)甲醇甲酸銨2 次提取，用C18 小柱凈化除雜，其他條件與阮靜等[7]檢測(cè)方法一致，黃霉素A 方法定量限為1.5 mg/kg，黃霉素添加濃度為2、3、5 mg/kg 時(shí)，黃霉素A 的回收率在88.5%～113.2%，變異系數(shù)在2.2%～5.1%。 與《DB32/T 1279-2008 飼料和飼料添加劑中黃霉素A 的測(cè)定高效液相色譜法》相比，該方法定量限較高，且以黃霉素標(biāo)準(zhǔn)品換算成相當(dāng)于黃霉素A 的質(zhì)量來(lái)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，加之黃霉素各組分分離度較差，必然會(huì)增大實(shí)驗(yàn)誤差，不利于準(zhǔn)確定性、定量。

安徽省實(shí)施的地方標(biāo)準(zhǔn)《DB34/T 1358-2011 飼料中黃霉素的測(cè)定-高效液相色譜法》[39]中指出：飼料中黃霉素經(jīng)50%的甲醇提取后，用pH 6.0磷酸鹽緩沖液稀釋至所需濃度，上機(jī)條件與江蘇省《DB32/T1279-2008 飼料和飼料添加劑中黃霉素A 的測(cè)定高效液相色譜法》一致，該方法中黃霉素5種組分得到很好的分離，峰型好，方法檢出限為500μg/kg，有效提高了檢測(cè)的靈敏度。

2008年，曾兆國(guó)等[35]在流動(dòng)相中加入庚烷基磺酸鈉離子對(duì)試劑，利用液相色譜儀分離鑒別黃霉素。試驗(yàn)采用C18 色譜柱，以乙腈-3%庚烷基磺酸鈉水溶液(35 : 65)為流動(dòng)相，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，紫外檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)256 nm。黃霉素是一種弱酸性的多組分的物質(zhì)，庚烷基磺酸鈉是一種離子對(duì)試劑，它在水中可電解成庚烷磺酸鈉負(fù)離子，與胺類電離成的銨正離子結(jié)合而改變其保留性質(zhì)，因此，本試驗(yàn)中建立的檢測(cè)方法可使黃霉素5 種主要組分完全有效分離，而且無(wú)其他雜峰干擾，但具體運(yùn)用到實(shí)際樣品的檢測(cè)，仍需要建立前處理方法以滿足上機(jī)測(cè)定條件。

液相色譜法實(shí)驗(yàn)條件操控起來(lái)相對(duì)較容易，但它單純利用極性進(jìn)行分離測(cè)定，很難將黃霉素A 從相似的組分中有效分離出來(lái)且方法檢出限、定量限往往偏高，難以滿足檢測(cè)需要。黃霉素成分的復(fù)雜性、結(jié)構(gòu)的相似性讓超高效液相色譜-三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)成為黃霉素A檢測(cè)的首選方法。

2.2 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法研究進(jìn)展及存在問(wèn)題

2007年，Sandra[34]利用液相色譜-單四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)雞糞中黃霉素通過(guò)C4 SPE 小柱，50 ℃甲醇洗脫，C18 柱，0.3 %的甲酸水+乙腈作為流動(dòng)相，測(cè)定黃霉素A。確定黃霉素A 兩個(gè)母離子[M–H]-1 580.6 m/z 和[M–H]2-789.8 m/z，根據(jù)兩個(gè)母離子的峰面積繪制50-5 000μg/L范圍內(nèi)的曲線圖，研究表明必須通過(guò)基質(zhì)曲線定量，否則結(jié)果嚴(yán)重不準(zhǔn)確。該研究為后來(lái)學(xué)者利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定黃霉素A 提供了思路，但是由于液相色譜-單四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀不能利用二級(jí)質(zhì)譜定性，容易引起檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。

2010年，Gallo 等[1]建立了測(cè)定飼料中黃霉素A含量的方法。樣品中的黃霉素A 經(jīng)氨水甲醇提取，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干除去有機(jī)相后復(fù)溶，經(jīng)HLB 柱凈化，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，以Synergi MAX RP色譜柱為分析柱，乙腈+10 mmol/L 的乙酸銨為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（MRM）、負(fù)離子模式下檢測(cè)。以單荷電分子離子和雙荷電分子離子作為母離子（[M–H]-1 580.4 m/z 和[M–H]2-789.9 m/z），從中篩選出4 個(gè)主要子離子產(chǎn)物（詳見(jiàn)圖1），[M–H]2-中575.7 m/z(定量離子)、554 m/z 以及[M–H]-中1 152 m/z，1 109 m/z 定性離子，利用飼料基質(zhì)配制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對(duì)飼料中黃霉素A 進(jìn)行了分析。方法的檢出限為30 μg/kg，方法的定量限為100 μg/kg，平均回收率83.9%～94.2%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD＜23%。相比液相色譜法，該方法特異性強(qiáng)，但需要配置基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，增加了操作的復(fù)雜性。

圖1 負(fù)離子模式下黃霉素A可能存在離子碎片

2012年，李金強(qiáng)等[32]也對(duì)液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定飼料中黃霉素A 含量進(jìn)行了研究，試驗(yàn)選用Agilent Ecillps C18 色譜柱為分析柱，選擇［MH］2－789 m/z 為母離子，其子離子分別為575.7 m/z(定量離子)和553.8 m/z(定性離子)，經(jīng)液相色譜-串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜檢測(cè)。黃霉素A 的線性范圍為100～5 000 μg/L，相關(guān)系數(shù)(r)為0.999 725。方法的檢出限為30 μg/kg，方法的定量限為100 μg/kg，回收率在75%～95%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.7%～6.4%。該方法特異性強(qiáng)，且該方法不需要配置基質(zhì)校準(zhǔn)曲線，操作簡(jiǎn)便，利于推廣應(yīng)用。

2016年，吳家鑫等[40]利用超高效液相色譜-高分辨四級(jí)桿飛行時(shí)間串聯(lián)質(zhì)譜儀對(duì)預(yù)混劑中的黃霉素5種組分進(jìn)行鑒別分析。黃霉素預(yù)混劑樣品加入適量50%甲醇溶液，混勻，置超聲浴中超聲15 min，放冷至室溫，用50%甲醇溶液稀釋至適當(dāng)濃度，搖勻，過(guò)濾后上機(jī)。采用C18 色譜柱分離樣液中的5 種黃霉素組分，以乙腈-0.1%甲酸水溶液(含2 mmol/L 乙酸銨)為流動(dòng)相梯度洗脫，流速0.4 mL/min，柱溫40 ℃，質(zhì)譜條件為電噴霧離子源，檢測(cè)方式為負(fù)離子全掃描模式，通過(guò)保留時(shí)間、精確分子質(zhì)量和二級(jí)質(zhì)譜特征碎片完成對(duì)黃霉素的5種組分的鑒別。與高效液相色譜方法比較，本方法具有判斷準(zhǔn)確、鑒別快速的特點(diǎn)，但用于檢測(cè)時(shí)仍需要建立相應(yīng)的前處理方法。

3 展 望

飼料中黃霉素A 含量測(cè)定的研究有了一定的基礎(chǔ)，但其檢測(cè)技術(shù)和監(jiān)控體系仍相對(duì)滯后。由于黃霉素A 的純品難以獲得，試驗(yàn)方法多以黃霉素為標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定結(jié)果通過(guò)含量換算來(lái)計(jì)算黃霉素A 含量，加大了檢測(cè)誤差，多數(shù)前處理中提取液需要旋蒸近干復(fù)溶后才能進(jìn)行凈化，整個(gè)流程過(guò)于復(fù)雜，不利于大批量快速檢驗(yàn)檢測(cè)。因此，盡快制得黃霉素A 標(biāo)準(zhǔn)品，優(yōu)化前處理方法，建立準(zhǔn)確、高效的檢測(cè)黃霉素A含量的方法勢(shì)在必行。