血清外泌體miR-23b對STEMI患者行PCI后發(fā)生院內(nèi)主要不良心血管事件的預(yù)測價(jià)值

楊洋，李天發(fā)，黃珊，王軍，凌學(xué)斌

急性心肌梗死是發(fā)生于不穩(wěn)定冠狀動脈（冠脈）粥樣硬化斑塊形成后的冠脈疾病，是臨床最嚴(yán)重的醫(yī)療急癥之一[1]，主要治療方法是盡快恢復(fù)冠脈灌注，減少心肌梗死面積[2,3]。然而由于患者的易感因素，如心肌損傷、炎癥和血栓形成傾向等，有些患者在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）后易發(fā)生反復(fù)性心絞痛或冠脈再狹窄[4]。目前尚缺乏高度敏感和特異的方法來監(jiān)測臨床狀況和評估心肌梗死患者的預(yù)后。循環(huán)微小RNA（miRNAs）可主動或被動地作為細(xì)胞間通訊介質(zhì)釋放，有望成為評估疾病進(jìn)展的非侵入性生物標(biāo)志物[5]。研究證實(shí)，miR-23b是炎癥反應(yīng)中一種重要調(diào)節(jié)因子[6]。本研究中，我們旨在探索ST段抬高型心肌梗死（STEMI）完成PCI后血清外泌體miR-23b表達(dá)變化及與短期預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對象選取2019年5月至2020年5月于海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科治療的STEMI患者103例，男：女為1.86:1；年齡37～87歲，平均年齡（62.48±13.55）歲，均在癥狀出現(xiàn)后12 h內(nèi)入院。患者均為初次診斷并接受直接PCI。缺血性胸痛持續(xù)＞30 min，心臟生物標(biāo)志物升高[心肌肌鈣蛋白（cTnI）＞0.06 ng/ml和/或肌酸激酶同工酶MB（CK-MB）＞16 IU/L]，ECG顯示ST段抬高＞1 mm，至少有2條連續(xù)心電圖導(dǎo)聯(lián)，或新發(fā)左束支阻滯。根據(jù)是否發(fā)生院內(nèi)主要不良心血管事件（MACE）[7]將患者分為MACE組和非MACE組。排除標(biāo)準(zhǔn)：過去24 h內(nèi)應(yīng)用溶栓藥物；入院時已發(fā)生心源性休克、合并活動性感染或既往證實(shí)的全身炎癥病史，已知惡性腫瘤、肝臟疾病、腎衰竭者。另從我院健康體檢中心招募同時期48例健康志愿者，男：女為1.67:1；年齡為35～84歲，平均年齡（63.31±13.75）歲，排除其他確定性疾?。ㄈ绺哐獕?、高脂血癥或心腦血管疾?。?。所有參與者均簽署知情同意書，本研究經(jīng)我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 血清外泌體提取和鑒定在STEMI患者入院時（PCI術(shù)前）及術(shù)后1 d內(nèi)（≤24 h）、2～3 d（48～72 h）、4～7 d時采集血液樣本。還收集了對照組的空腹血液樣本3.5 ml。室溫下3500 r/min立即離心5 min，將血清儲存在 -80℃直至RNA 提取。抽取患者靜脈血在4℃條件下通過離心清除細(xì)胞碎片。加入Exo快速外顯體沉淀試劑（System Biosciences公司，美國）再次離心后，用0.22 μm濾膜過濾上清液，凍存1 h，在10 000 r/min超速離心得到外泌體顆粒。將外泌體顆粒重懸于PBS中，用透射電鏡觀察外泌體顆粒形態(tài)，納米粒徑跟蹤分析顆粒大小分布并通過蛋白免疫印跡法檢測標(biāo)志蛋白分子CD63、CD9、Calnexin表達(dá)。

1.3 采用實(shí)時熒光定量PCR法檢測miR-23b表達(dá)用miRNeasy Mini試劑盒（Qiagen公司，德國）從外泌體中提取miRNAs后，然后在每個樣品中加入5 μl 0.26 nmol/L cel-miR-39用作內(nèi)參。由AMV反轉(zhuǎn)錄試劑（Takara公司，日本）和TaqMan引物（Takara公司，日本）轉(zhuǎn)錄成cDNA，最后用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒（Takara公司，日本）進(jìn)行PCR。循環(huán)條件為：95℃ 30 s，95℃ 15 s，62℃ 30 s，共35個循環(huán)。用2-ΔΔCt法以U6為內(nèi)參計(jì)算miR-23b的相對表達(dá)量。miR-23b的正向引物為 5'-GAT GGT CGC ACA GCG TCT TC-3'，反向引物為 5'-CAA GTC AGG AGA CCG TCA GG-3'。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理統(tǒng)計(jì)分析使用SPSS 19.0軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和重復(fù)測量的方差分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用單變量和多變量Logistic回歸分析評估獨(dú)立的預(yù)后因素。應(yīng)用受試者-操作特征（ROC）曲線分析外泌體miR-23b預(yù)測MACE曲線下面積（AUC）。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清外泌體形態(tài)學(xué)和生化特征透射電鏡顯示回收的囊狀小泡為球形結(jié)構(gòu)，多數(shù)粒子直徑在50～150 nm間。通過western blot法檢測標(biāo)記分子，出現(xiàn)了CD63、CD9特異性條帶，另外calnexin呈陰性表達(dá)，說明這些囊泡是是外泌體（圖1）。

圖1 血清外泌體形態(tài)學(xué)和生化特征

2.2 STEMI患者血清外泌體miR-23b表達(dá)量變化與健康志愿者相比，STEMI患者PCI前血清外泌體miR-23b相對表達(dá)量升高（1.31±0.42）vs. （1.00±0.11），P＜0.05。對于STEMI患者，PCI后1 d內(nèi)（≤24 h）外泌體miR-23b相對表達(dá)量達(dá)到峰值，隨后在PCI術(shù)后2～3 d（48～72 h）、4～7 d時外泌體miR-23b相對表達(dá)量逐漸降低，直至逐漸接近健康志愿者的水平。

2.3 MACE組和非MACE組患者一般資料比較103例STEMI患者中，21例發(fā)生院內(nèi)MACE（死亡1例、嚴(yán)重心律失常3例、復(fù)發(fā)心絞痛11例、再發(fā)心肌梗死3例、急性心力衰竭2例、卒中1例）其余82例入非MACE組。所有患者PCI后都達(dá)到TIMI3級血流；MACE組吸煙史、高血壓、糖尿病史比例高于非MACE組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），比較兩組其他臨床因素和PCI特征，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表1。

表1 比較MACE組和非MACE組患者一般資料

2.4 比較MACE組和非MACE組患者血清外泌體miR-23b表達(dá)量變化采用重復(fù)測量設(shè)計(jì)的方差分析比較兩組患者各時間點(diǎn)外泌體miR-23b相對表達(dá)量，①不同時間點(diǎn)外泌體miR-23b相對表達(dá)量存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F時間=114.108，P＜0.05）。②兩組患者外泌體miR-23b相對表達(dá)量比較存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F組別=51.905，P＜0.05），各時間點(diǎn)MACE組患者外泌體miR-23b相對表達(dá)量均高于非MACE組（P＜0.05）。③兩組外泌體miR-23b相對表達(dá)量變化趨勢存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（F組別×?xí)r間=21.152，P＜0.05），表2。

表2 比較MACE組和非MACE組患者血清外泌體miR-186相對表達(dá)量變化

2.5 血清外泌體miR-23b對STEMI患者行PCI后短期發(fā)生MACE的預(yù)測價(jià)值經(jīng)ROC曲線分析發(fā)現(xiàn)，PCI后1 d內(nèi)血清外泌體miR-23b預(yù)測STEMI患者行PCI后短期發(fā)生MACE的AUC最高，與其他3個時間點(diǎn)相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），圖3及表3。

圖2 STEMI患者血清外泌體miR-23b表達(dá)變化趨勢（注：與健康志愿者相比，*P＜0.05；與STEMI患者PCI術(shù)前基線值相比，#P＜0.05）

圖3 血清外泌體miR-23b預(yù)測STEMI患者行PCI術(shù)后短期發(fā)生MACE的ROC曲線

表3 血清外泌體miR-23b對STEMI患者行PCI術(shù)后短期發(fā)生MACE的預(yù)測價(jià)值

2.6 多因素Logistic回歸分析影響STEMI患者PCI后發(fā)生院內(nèi)MACE的危險(xiǎn)因素以MACE作為因變量（賦值MACE=1，非MACE=0），將上述存在差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)變量納入Logistic回歸模型，經(jīng)多因素Logistic回歸分析，PCI后1 d內(nèi)（≤24 h）血清外泌體miR-23b表達(dá)量升高是STEMI患者PCI后發(fā)生MACE的獨(dú)立預(yù)測因素（P＜0.05），表4。

表4 多因素Logistic回歸分析影響STEMI患者PCI術(shù)后發(fā)生院內(nèi)MACE的臨床因素

3 討論

隨著人們生活方式改變和人口老齡化的影響，心血管疾病在我國的患病率不斷上升，約2.9億人受到心血管疾病的影響，包括STEMI在內(nèi)的心血管疾病呈上升趨勢，是我國死亡的主要原因[8]。STEMI是生理學(xué)基礎(chǔ)為冠脈不穩(wěn)定斑塊破裂、糜爛基礎(chǔ)上繼發(fā)血栓形成所導(dǎo)致的冠脈血管持續(xù)、完全閉塞的急性心肌缺血壞死，有較高的致死率[9]。目前，急診PCI是臨床上治療STEMI的主要血運(yùn)重建策略[10]，由于患者易感因素，如心肌損傷、炎癥性疾病和血栓形成傾向等，STEMI患者在PCI后二次心血管事件的殘留風(fēng)險(xiǎn)仍很高[11]。目前尚缺乏高度敏感和特異的方法來監(jiān)測臨床狀況和評估急性冠脈綜合征患者的預(yù)后。

循環(huán)的miRNAs被認(rèn)為是早期預(yù)測心血管事件的潛在生物標(biāo)志物。越來越多證據(jù)表明，特異性 miRNA表達(dá)可方便有效地提供反映再灌注后患者疾病進(jìn)展的信息[12]。如眾多心源性miRNAs（miR-1、miR-499、miR-208a等）被證實(shí)是急性心肌梗死的關(guān)鍵生物標(biāo)志物[13]。此外，微囊包裹在外泌體或微泡內(nèi)可能通過靶向不同類型的細(xì)胞，如內(nèi)皮細(xì)胞和心肌細(xì)胞，促進(jìn)心臟病理生理學(xué)變化[14]。本研究中發(fā)現(xiàn)STEMI患者入院時血清外泌體miR-23b相對表達(dá)量高于對照人群，說明STEMI患者在發(fā)病12 h內(nèi)血清外泌體miR-23b相對表達(dá)量即出現(xiàn)普遍升高。He等[15]研究發(fā)現(xiàn)miR-23b作為特異性miRNA可能參與斑塊破裂和內(nèi)皮侵蝕，導(dǎo)致從無癥狀性硬化或穩(wěn)定冠心病突然轉(zhuǎn)變?yōu)榧毙孕募」Ｋ?。He等發(fā)現(xiàn)蒙古族人群中血清miR-23b表達(dá)量升高是心血管疾病發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可能與miR-23b引起的ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族a1減少導(dǎo)致心血管疾病高危人群總膽固醇的大量積累有關(guān)。miR-23b過表達(dá)增強(qiáng)了氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）誘導(dǎo)的THP-1源性巨噬細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。miR-23b通過靶向A20調(diào)控核因子-kappa B（NF-κB）炎癥通路，增加了巨噬細(xì)胞促炎細(xì)胞因子的分泌，加速動脈粥樣硬化病變的進(jìn)展，導(dǎo)致急性心肌梗死的發(fā)生。我們認(rèn)為STEMI患者血清外泌體miR-23b水平升高可能是斑塊脆弱性加重的潛在指標(biāo)。

我們還關(guān)注了STEMI患者PCI后1周內(nèi)miR-23b的動態(tài)變化。PCI后1 d內(nèi)血清外泌體miR-23b水平驟然升高，隨后逐漸降低，尤其是非MACE組患者，PCI后4～7 d時血清外泌體miR-23b相對表達(dá)量逐漸恢復(fù)至對照志愿者的水平。PCI后1 d內(nèi)檢測血清外泌體miR-23b相對表達(dá)量對MACE的預(yù)測效能最高，經(jīng)多因素Logistic回歸分析，PCI后1 d內(nèi)（≤24 h）血清外泌體miR-23b表達(dá)量升高是STEMI患者PCI后發(fā)生MACE的獨(dú)立預(yù)測因素。及時的冠脈再通和心肌再灌注可有效限制壞死范圍和梗死面積。STEMI患者PCI前后血清外泌體miR-23b水平的變化表明，藥物干預(yù)能及時搶救心肌組織，保護(hù)心臟功能，改善臨床結(jié)果。因此，血清miR-23b可作為監(jiān)測STEMI患者臨床狀況和評估預(yù)后的可靠生物標(biāo)志物。巨噬細(xì)胞的活化和炎癥被廣泛發(fā)現(xiàn)是由miRNAs調(diào)節(jié)的，包括miR-125a-5p和miR-155等。miR-23b也被證明在參與動脈粥樣硬化進(jìn)程中有調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能障礙，加重炎癥反應(yīng)進(jìn)程有關(guān)。紅斑狼瘡或類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中，miR-23b被發(fā)現(xiàn)下調(diào)，且抑制了由腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的NF-κB信號通路的激活和炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。本研究中，miR-23b表達(dá)量升高能夠良好預(yù)測MACE的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)可能與炎癥因素相關(guān)。

總而言之，miR-23b對于STEMI患者PCI后發(fā)生院內(nèi)MACE具有較好的預(yù)測價(jià)值，檢測PCI后1 d內(nèi)血清外泌體miR-23b可用于識別預(yù)后較差的高?；颊?，據(jù)此調(diào)整治療方案，為STEMI患者的病情評估、治療及預(yù)后提供了新的視角。