雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷

方 舟，張軍兵，羅忠國，熊 勇,*，羅舜菁，劉成梅

1.南昌大學(xué) 食品學(xué)院 (南昌 330000)2.江西丹霞生物股份有限公司 (鷹潭 335000)

紫甘薯色素是從紫甘薯的塊根中提取精制而成的一種花色苷類色素，其中主要的花色苷配基為矢車菊色素和芍藥色素，且以單?；碗p?；幕ㄉ諡橹鱗1]。與其它花色苷類色素相比，紫甘薯色素具有酰化基團(tuán)，從而具有較好的耐熱性和耐光性[2]。同時(shí)，其對光、熱、酸和堿等的敏感度要比一般無酰基化的花色苷小，因而性質(zhì)更加穩(wěn)定[3]。花色苷具有極強(qiáng)的抗氧化活性，可以作為自由基清除劑[1]，除此之外，花色苷還具有抗癌[4]、抗炎[5]等多種功能。

影響紫甘薯花色苷純度的主要是淀粉及其他糖類雜質(zhì)，目前對花色苷進(jìn)行分離純化的方法有大孔樹脂法[6]、膜分離法[7-8]、色譜法[9]等，這些方法存在時(shí)間長、易污染或成本高等問題。雙水相技術(shù)作為一種新型的分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分離方法相比，具有條件溫和、產(chǎn)品活性損失小、步驟簡單及分離效果好等優(yōu)點(diǎn)[10]，國外已經(jīng)廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)的純化及抗生素的提取，近年來逐漸應(yīng)用于天然色素的分離純化研究。紫甘薯花色苷的高效分離純化是進(jìn)行其功能性研究和對其進(jìn)行應(yīng)用的基礎(chǔ)。本研究利用雙水相技術(shù)對紫甘薯花色苷進(jìn)行分離純化并對其工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，為紫甘薯色素的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫甘薯濃縮液(花色苷含量為2.229 3 mg/mL，糖含量為409.793 8 mg/mL)，由江西丹霞生物科技有限公司提供；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司；硫酸銨、磷酸二氫鈉、氯化鉀、乙酸鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、苯酚、硫酸、鹽酸，均為國產(chǎn)分析純；無水乙醇，分析純，西隴科學(xué)股份有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UV-1800型紫外-可見分光光度儀，北京普析通用公司；超純水機(jī)，青島富勒姆科技有限公司；旋渦攪拌器(mini G)，艾卡(廣州)儀器設(shè)備有限公司。

1.3 單因素實(shí)驗(yàn)

1.3.1不同鹽種類和濃度對紫甘薯花色苷分離純化的影響

分別向50 mL離心管中添加4.8 g、5.4 g、6.0 g、6.6 g和7.2 g的硫酸銨[(NH4)2SO4]和磷酸二氫鈉(NaH2PO4)，各管中加入無水乙醇7.5 g，紫甘薯濃縮液1 mL，以蒸餾水補(bǔ)足總質(zhì)量為30 g，此時(shí)各管中的鹽濃度分別為16%、18%、20%、22%、24%，研究不同鹽濃度對紫甘薯花色苷分離純化的影響。

1.3.2不同乙醇濃度對紫甘薯花色苷分離純化的影響

分別向50 mL離心管中添加7.5 g、9.0 g、10.5 g、12 g和13.5 g的無水乙醇，各管中加入鹽6.0 g，紫甘薯濃縮液1 mL，以蒸餾水補(bǔ)足總質(zhì)量為30 g，此時(shí)各管中的乙醇濃度分別為25%、30%、35%、40%、45%，研究不同乙醇濃度對紫甘薯花色苷分離純化的影響。

1.3.3不同濃縮液添加量對紫甘薯花色苷分離純化的影響

分別向50 mL離心管中添加0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.0 mL、和1.2 mL 的紫甘薯濃縮液，各管中加入鹽6.0 g，無水乙醇7.5 g，以蒸餾水補(bǔ)足總質(zhì)量為30 g，研究不同濃縮液添加量對紫甘薯花色苷分離純化的影響

1.4 正交實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，選擇鹽濃度、乙醇濃度和濃縮液添加量為考察因素，以花色苷回收率和糖殘留率作為考察指標(biāo)，設(shè)計(jì)L9(33)正交實(shí)驗(yàn)。花色苷回收率表明在經(jīng)過雙水相體系處理后花色苷能夠保留的比例；由于在紫甘薯濃縮液中的主要雜質(zhì)為糖類，糖殘留率則表明雙水相體系對于紫甘薯花色苷的純化能力。

表1 L9(33)正交因素實(shí)驗(yàn)表

1.5 測定方法

1.5.1花色苷的測定

根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)GB 1886.244—2016的方法對花色苷進(jìn)行測定，以矢車菊-3-葡萄糖苷計(jì)?；ㄉ盏暮坑?jì)算如下：

式中：A為(A520 nm-A700 nm)pH 1.0-(A520 nm-A700 nm)pH 4.5；M為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾質(zhì)量(M=449.2 g/mol),g/mol；f為樣品的稀釋倍數(shù)；k為矢車菊-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)(ε=26 900)，L/(mol·cm)；l為光路長,cm；V為樣品體積，mL。

花色苷回收率計(jì)算如下：

式中：W花為花色苷回收率；A上花為雙水相體系中上相的花色苷總量；A總花為加入雙水相體系中的花色苷總量。

1.5.2糖類的測定

準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖25 mg于250 mL容量瓶中，定容，分別吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL葡萄糖溶液以蒸餾水補(bǔ)至10.0 mL，配制成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 mg/mL的葡萄糖溶液，各取1.0 mL置于比色管中，分別加入6%苯酚1.0 mL及濃硫酸5.0 mL搖勻，室溫反應(yīng)30 min以后于490 nm測吸光度，以1.0 mL水按同樣顯色操作為空白，橫坐標(biāo)為吸光度，縱坐標(biāo)為多糖毫克數(shù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得標(biāo)曲為y=0.132 5x，R2=0.998 7。

對樣品進(jìn)行適當(dāng)稀釋后以上述方法進(jìn)行顯色操作后以標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多糖含量。

糖殘留率的計(jì)算如下：

式中：W糖為糖殘留率；A上糖為雙水相體系中上相的糖類總量；A總糖為加入雙水相體系中的紫甘薯濃縮液所含的糖類總量。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1不同鹽種類和濃度對紫甘薯花色苷分離純化的影響

如圖1所示，隨著鹽濃度的上升，花色苷的回收率呈上升趨勢，而糖殘留率則呈下降趨勢，因此鹽濃度的增加對于雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷是有著顯著作用的?？梢钥吹皆诮档吞菤埩袈史矫?，硫酸銨的效果更顯著，但是對于花色苷的回收來說，磷酸二氫鈉的效果更好。因此在接下來的實(shí)驗(yàn)中，選擇磷酸二氫鈉作為成相鹽。

圖1 鹽的種類及濃度對花色苷回收率的影響

雖然鹽的濃度增加，有利紫甘薯色素的分離純化，但是在一定條件下鹽的飽和濃度為其濃度極限，鹽濃度增加，鹽在上相的殘留率同時(shí)增加，因此鹽的濃度并非越高越好。當(dāng)鹽的濃度達(dá)到22%時(shí)，對于花色苷的回收率及糖殘留率的變化較小，因此選擇鹽濃度為22%。

2.1.2不同乙醇濃度對紫甘薯花色苷分離純化的影響

如圖2所示，隨著乙醇濃度的增加，花色苷的回收率增加，但糖殘留率也同時(shí)增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到40%時(shí)，鹽溶液達(dá)到飽和，開始有鹽析出，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到45%時(shí)，鹽進(jìn)一步析出，導(dǎo)致無法成相。由于過高或過低的乙醇濃度會(huì)影響雙水相體系的形成，且對糖殘留率也有明顯影響。因此選擇乙醇濃度為25%。

圖2 鹽的種類及濃度對糖去除率的影響

2.1.3不同濃縮液添加量對紫甘薯花色苷分離純化的影響

如圖3所示，可以看到隨著濃縮液添加量的增加，花色苷的回收率由接近100%下降至75.97%，糖殘留率也同樣隨著濃縮液的變化而逐漸減少。濃縮液的添加量對于花色苷的回收率和糖殘留率有著較大的影響，綜合考慮花色苷回收率及糖殘留率，選擇濃縮液的添加量為0.8 mL。

圖3 乙醇濃度對花色苷回收率的影響

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

如表2所示，分別以花色苷回收率和糖殘留率為考察指標(biāo)，由極差r可以看出對花色苷回收率來說三個(gè)因素的影響大小依次為濃縮液添加量、磷酸二氫鈉濃度、乙醇濃度，最優(yōu)工藝為A1B1C1，即磷酸二氫鈉濃度為20%，乙醇濃度為25%，濃縮液添加量為0.6 mL，此時(shí)花色苷回收率為99.63%，糖殘留率為55.78%；而由極差R則可以看出對糖殘留率來說三個(gè)因素的影響大小依次為磷酸二氫鈉濃度，乙醇濃度，濃縮液添加量，最優(yōu)工藝為A2B2C1，即磷酸二氫鈉濃度為22%，乙醇濃度為30%，濃縮液添加量為0.6 mL，此時(shí)花色苷回收率為99.31%，糖殘留率為42.51%。

表2 雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷的正交因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖4 乙醇濃度對糖殘留率的影響

圖5 濃縮液添加量對花色苷回收率的影響

圖6 濃縮液添加量對糖回收率的影響

兩組工藝的花色苷回收率分別為99.63%和99.31%，相差不大，但糖殘留率則分別為55.78%和42.51%，有明顯差別?？紤]到對紫甘薯花色苷進(jìn)行分離純化的目的，因此綜合考慮選取的最佳工藝為為A2B2C1，即磷酸二氫鈉濃度為22%，乙醇濃度為30%，濃縮液添加量為0.6 mL，此時(shí)花色苷回收率為99.31%，糖殘留率為42.51%。

3 結(jié)論

采用磷酸二氫鈉/乙醇雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷。經(jīng)正交實(shí)驗(yàn)并綜合考慮糖殘留率和花色苷回收率，選取的最佳工藝為為磷酸二氫鈉濃度為22%，乙醇濃度為30%，濃縮液添加量為0.6 mL，此時(shí)花色苷回收率為99.31%。顯然，磷酸二氫鈉/乙醇雙水相體系對紫甘薯花色苷有良好的選擇性并能有效去除糖類雜質(zhì)。通過對雙水相體系分離純化紫甘薯花色苷的研究，優(yōu)化了其工藝，為紫甘薯花色苷的產(chǎn)業(yè)化及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。