環(huán)境脅迫及脅迫解除對不同來源雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響

劉維暐， 趙麗偉， 黃 華， 明升平， 范中玉，李 金， 陳小靈， 和曉芬， 許 琨

(1.中國科學院昆明植物研究所麗江高山植物園， 云南 麗江 674100；2.麗江市玉龍納西族自治縣科學技術局， 云南 麗江 674100；3.麗江市玉龍納西族自治縣種子管理站， 云南 麗江 674100)

雪上一枝蒿(Aconitumbrachypodum)為毛茛科(Ranunculaceae)烏頭屬(Aconitum)多年生草本植物，別名一支蒿、鐵棒錘、鐵牛七、三轉半等[1-2]。主要分布在云南東北部和西北部的東川、會澤、宣威、昭通、巧家、寧蒗、永勝、大理、麗江、香格里拉等地[3]，野生于海拔3 100～4 300 m的高山草地、多石礫山坡或疏林下。雪上一枝蒿是云南、四川民間廣為流傳和使用的跌打、療傷的止痛藥[4]，被用于治療風寒濕痹所致的筋骨和關節(jié)疼痛、跌打損傷所致的瘀血疼痛及蟲蛇咬傷等癥[5]。

雪上一枝蒿中的化學成分主要為二萜生物堿類[6-8]，以其為原料開發(fā)了雪上一支蒿總堿片劑、注射劑、骨痛靈酊以及搽劑、氣霧劑等制劑[9]。由于應用廣泛且野生資源相對匱乏，在云南麗江、曲靖，甘肅甘南等地，已開展了雪上一枝蒿的規(guī)?；N植工作[10-11]。盡管通過組織培養(yǎng)、根狀莖切塊也可以對雪上一枝蒿進行繁育[12]，但因雪上一枝蒿種子獲取較易，采收量較大，栽培種植基地主要采取種子撒播的方式對其進行繁育。

目前，雪上一枝蒿種植區(qū)域相對較廣，在我國多個省份均有人工栽培，但由于各地采收種子質量良莠不齊，成熟度不一致[13]，播種管理粗放，栽培基地土壤基質各異，導致雪上一枝蒿在實際生產過程中成苗量較低[14]。本實驗以不同來源地雪上一枝蒿種子為研究對象，研究不同環(huán)境條件對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響，并探索脅迫條件下其種子的萌發(fā)特性及脅迫條件解除后種子恢復萌發(fā)的特征，以指導實際播種種植，從而緩解其野生資源不斷減少與市場需求不斷增加的矛盾。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

于2019年9—10月，采集甘肅省甘南藏族自治州舟曲縣、云南省麗江市玉龍納西族自治縣野生雪上一枝蒿種子作為實驗材料。

1.2 實驗方法

1.2.1種子活力檢測

選取成熟飽滿，無病蟲害的雪上一枝蒿種子，按不同來源分組，每組選擇20粒，重復3次，沿種胚縱切后，分別置于蒸餾水(對照)及2%的氯化三苯四氮唑(TTC)染液中進行避光染色，20 min后將種子取出鏡檢，觀察染色情況并統計種子活力。

1.2.2環(huán)境脅迫對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響

將采集的雪上一枝蒿種子，每150粒為一組，每組3個重復，每個重復50粒，置于鋪設有滅菌濾紙，并用蒸餾水充分浸潤的培養(yǎng)皿中。培養(yǎng)皿外側用塑料保鮮膜包裹，防止內部溶液揮發(fā)帶來濃度及pH值變化的影響。經不同脅迫條件處理后，于光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待萌發(fā)終止后統計萌發(fā)時間及萌發(fā)率。

具體脅迫條件包括：

1)溫度脅迫。設置10 ℃、15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃溫度梯度，觀察溫度對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響；

2)酸堿度脅迫。設置pH值范圍為5.0～8.5，每0.5設置一個梯度，共8個pH梯度值溶液，在20 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，觀察環(huán)境pH值對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響；

3)鹽分脅迫。配置NaCl水溶液，按質量分數0.1%、0.5%、1%、5%設置濃度梯度，以蒸餾水作為對照，在20 ℃恒溫條件下培養(yǎng)，觀察鹽分脅迫對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響。

1.2.3解除環(huán)境脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發(fā)情況

1)解除溫度脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發(fā)情況。

將低溫(10 ℃)及高溫(30 ℃)條件下20 d后，取出未萌發(fā)的種子，置于鋪有滅菌濾紙，并用蒸餾水充分浸潤的培養(yǎng)皿中，于光照培養(yǎng)箱中20 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察記錄雪上一枝蒿種子恢復萌發(fā)的情況。

2)解除鹽分脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發(fā)情況。

將不同NaCl濃度梯度下15 d后未萌發(fā)的種子取出，用蒸餾水沖洗干凈后，置于鋪有滅菌濾紙，并用蒸餾水充分浸潤的培養(yǎng)皿中，于光照培養(yǎng)箱中20 ℃恒溫培養(yǎng)，觀察記錄雪上一枝蒿種子恢復萌發(fā)的情況。

3)未萌發(fā)雪上一枝蒿種子活力檢測。

30 d后將未萌發(fā)的雪上一枝蒿種子取出，沿種胚縱切后，分別置于蒸餾水(對照)及2%的TTC染液中進行避光染色，20 min后將種子取出鏡檢，觀察染色情況并統計種子活力。

1.3 數據分析

實驗數據采用Microsoft excel 2016軟件進行處理，采用SPSS 24.0軟件進行統計分析及作圖。

2 實驗結果

2.1 雪上一枝蒿種子活力統計

由表1可以看出，不同來源地成熟的雪上一枝蒿種子生活力有顯著差異，在后續(xù)實驗結果分析過程中，以生活力測定值對萌發(fā)數據進行加權處理。

表1 不同來源雪上一枝蒿環(huán)境特征及種子活力檢測結果

2.2 環(huán)境脅迫對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響

2.2.1溫度對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響

由表2可以看出，20 ℃條件下雪上一枝蒿萌發(fā)率最高，不同來源雪上一枝蒿種子萌發(fā)率對溫度的響應不同。隨著溫度升高，雪上一枝蒿種子初始萌發(fā)時間提前(圖1)。低海拔地區(qū)(甘肅甘南舟曲)來源的種子在較低溫度(10 ℃)無法萌發(fā)(表2，圖1)；隨著溫度升高，雪上一枝蒿種子萌發(fā)能力先增強后減弱并受到抑制(圖1)，而高海拔地區(qū)(云南麗江玉龍)來源的種子受影響更為強烈(表2)，且在高溫(30 ℃)環(huán)境下無法萌發(fā)。

表2 雪上一枝蒿種子萌發(fā)率對溫度的響應

2.2.2酸堿度對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響

pH值為5.0條件下，麗江玉龍雪山地區(qū)來源的種子萌發(fā)率降低，pH值8.5條件下，甘肅舟曲地區(qū)來源的種子萌發(fā)率顯著降低。除此以外，不同pH值環(huán)境下，雪上一枝蒿各組間種子萌發(fā)率沒有顯著差異。

由萌發(fā)進程(圖2)可以看出，不同pH值條件對不同來源雪上一枝蒿種子初始萌動時間及總體萌發(fā)時長影響不大。麗江玉龍雪山地區(qū)來源的種子萌發(fā)呈雙峰曲線，甘肅舟曲地區(qū)來源的種子呈單峰曲線。

2.2.3鹽分脅迫對雪上一枝蒿種子萌發(fā)的影響

由表3可以看出，在較低NaCl濃度(0.1%)下，雪上一枝蒿種子萌發(fā)率顯著降低，高海拔地區(qū)(云南麗江玉龍)來源的種子在0.5%NaCl濃度下仍可萌發(fā)。當環(huán)境NaCl濃度超過1%，種子無法萌發(fā)。

表3 不同pH值條件下雪上一枝蒿種子萌發(fā)率

表4 雪上一枝蒿種子萌發(fā)率對鹽分脅迫的響應

在NaCl脅迫條件下，雪上一枝蒿種子萌發(fā)進程縮短，萌發(fā)數量減少(圖3)。高海拔地區(qū)(云南麗江玉龍)來源的種子在0.5%NaCl濃度下萌發(fā)推遲。

2.3 解除環(huán)境脅迫后雪上一枝蒿的種子萌發(fā)特征

2.3.1解除溫度及鹽脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發(fā)受試樣本描述

（4）供求關系嚴重失衡，人員素質不高。建筑市場供求關系嚴重失衡，生產能力明顯過剩，過度競爭導致了無序競爭甚至是惡性競爭。

在溫度脅迫解除的實驗中，低溫組(云南玉龍)有部分種子萌發(fā)，取未萌發(fā)的種子；高溫組(甘肅舟曲)有部分種子萌發(fā)，取未萌發(fā)的種子。低溫脅迫組選擇10 ℃組，高溫脅迫組選擇30 ℃組，其中，受試樣本量描述如下：

1)云南麗江玉龍區(qū)域。低溫組(10 ℃)包括：第1組46粒、第2組45粒、第3組46粒；高溫組(30 ℃)每組50粒，3組。

2)Ⅱ甘肅甘南舟曲區(qū)域。低溫組(10 ℃)包括：每組50粒，3組；高溫組(30 ℃)包括：第1組34粒，第2組35粒、第3組36粒。

在鹽分脅迫解除的實驗中，取每個鹽分脅迫條件下未萌發(fā)的種子，以保持受試種子為同一批并減少干擾，解除脅迫后受試樣本量描述如下：

1)云南麗江玉龍區(qū)域。0.1%濃度包括：第1組46粒，第2組45粒，第3組47粒；0.5%濃度包括：每組46粒，3組；1%濃度包括：每組50粒，3組；5%濃度包括：每組50粒，3組。

2)甘肅甘南舟曲區(qū)域。0.1%濃度包括：第1組32粒，第2組31粒，第3組33粒；0.5%濃度包括：每組50粒，3組；1%濃度包括：每組50粒，3組；5%濃度包括：每組50粒，3組。

2.3.2解除溫度脅迫后雪上一枝蒿種子萌發(fā)特征

表5 解除溫度脅迫后雪上一枝蒿種子萌發(fā)率特征

解除環(huán)境溫度脅迫后，雪上一枝蒿種子萌發(fā)時間均大大提前(1～2 d內即開始萌發(fā))，萌發(fā)進程縮短(由6～9 d縮短至3～7 d)(圖4)。

2.3.3解除鹽分脅迫后雪上一枝蒿種子萌發(fā)特征

麗江玉龍雪山地區(qū)來源的種子經過鹽分脅迫后，沒有萌發(fā)的種子已經死亡(表6)；甘肅舟曲地區(qū)來源的種子在0.5%NaCl濃度下即沒有萌發(fā)，一旦環(huán)境脅迫解除，仍保持較高萌發(fā)率。當環(huán)境NaCl濃度超過1%后，所有種子均無萌發(fā)。

表6 解除鹽分脅迫后雪上一枝蒿種子萌發(fā)率特征

3 分析與討論

3.1 不同來源雪上一枝蒿種子萌發(fā)對環(huán)境因子的響應

不同來源地雪上一枝蒿種子對萌發(fā)環(huán)境溫度體現了一定的選擇和適應性，這是植物在野外生存過程中長期自然選擇的結果。趙迪等[15]研究指出，在同樣的溫度條件下，不同海拔下露蕊烏頭(Aconitumgymnandrum)高海拔來源種子萌發(fā)率高于低海拔來源，但整體萌發(fā)率較低，休眠現象明顯。本研究結果與之不一致，可能由于物種差異，種子休眠程度不同導致。此外，20 ℃條件為雪上一枝蒿最適萌發(fā)溫度，這與船盔烏頭(Aconitumnaviculare)[16]及工布烏頭(Aconitumkongboense)[17]萌發(fā)特性相一致。

土壤酸堿度常會干擾植物種子萌發(fā)和植株生長[18]，雪上一枝蒿種子萌發(fā)受萌發(fā)環(huán)境酸堿度影響較小，pH值在5.5～8.0范圍均可有效萌發(fā)。即使來源不同的種子，其萌發(fā)受酸堿度影響也較小。在雪上一枝蒿實際播種過程中，對播種基質酸堿度沒有明顯要求，但土壤酸堿度對植物生長過程的影響，還需進一步研究。在鹽脅迫下，除了部分沿海灘涂以及鹽堿地生長的植物外[19-20]，許多植物種子萌發(fā)和幼苗生長會受到明顯抑制，抑制程度與鹽濃度和植物自身耐鹽能力有關[21-23]。麗江玉龍雪山來源的雪上一枝蒿種子呈現一定的耐鹽性，這與其生長環(huán)境多為林緣荒地及流石灘下緣有關。盡管雪上一枝蒿種子具有一定耐鹽性，但其對鹽脅迫響應仍非常敏感，即使在0.1%NaCl濃度下，其萌發(fā)率也會顯著降低，在播種前期，應提前分析種植地的土壤含鹽量及鹽分組成并采取相應措施，以緩解鹽脅迫對種子萌發(fā)帶來的危害。

3.2 解除環(huán)境脅迫后雪上一枝蒿種子恢復萌發(fā)

過低和過高的溫度會使膜的透性、膜結合的活性和酶變性而影響種子萌發(fā)[24]。溫度脅迫解除后，甘肅舟曲來源的雪上一枝蒿種子萌發(fā)可恢復到較高水平。麗江玉龍雪山來源的種子恢復萌發(fā)的能力顯著低于前者，且高溫脅迫下的種子恢復萌發(fā)的能力顯著低于低溫脅迫。研究結果一方面體現了環(huán)境條件改變后植物適應能力的強弱，同時也暗示麗江玉龍雪山地區(qū)來源的雪上一枝蒿在引種繁育過程中難度較大。盡管高海拔惡劣的環(huán)境條件(晝夜溫差、強紫外線)能刺激藥用植物次級代謝產物的積累[25]，藥效更佳，但考慮其繁育的難度及成本，在種植栽培管理過程中應綜合考慮種源來源對藥材生產的影響。

鹽脅迫對植物種子萌發(fā)的影響主要表現在降低種子發(fā)芽率，延長種子萌發(fā)進程，或者使種子失去活力[26-27]。結合鹽脅迫實驗以及脅迫解除實驗結果來看，不同來源雪上一枝蒿種子在應對環(huán)境鹽脅迫時策略不同。由于生長環(huán)境影響，麗江玉龍雪山來源的種子仍能在高鹽濃度下萌發(fā)生長，而不能萌發(fā)生長的種子則失活死亡；甘肅舟曲來源的種子則選擇抑制萌發(fā)，等待萌發(fā)環(huán)境適宜后再萌發(fā)生長。環(huán)境過濾對于不同區(qū)域相同物種種子萌發(fā)產生的影響不同，麗江玉龍雪山區(qū)域生長的植物種子活力較低、環(huán)境選擇壓力較大，部分強壯的種子在惡劣環(huán)境下也可以萌發(fā)生長；甘肅舟曲區(qū)域植物種子活力較強，環(huán)境選擇壓力較小，只會在適宜條件下萌發(fā)生長。