不同倍性云南山茶種子表型及萌發(fā)特性研究

李紫倩， 左 杰， 王兵益， 屈 燕

(1.西南林業(yè)大學園林園藝學院，國家林業(yè)和草原局西南風景園林工程技術(shù)研究中心，云南省功能性花卉資源及產(chǎn)業(yè)化技術(shù)工程研究中心， 昆明 650224；2.中國林業(yè)科學研究院資源昆蟲研究所， 云南 昆明 650224)

云南山茶(CamelliareticulataLind1.f.SimplexSealy)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)植物，又名騰沖紅花油茶、南山茶、油茶果等，是中國特有種，屬國家二級重點保護植物，花色豐富艷麗、油脂含量較高，為觀賞兼食用植物，開發(fā)前景廣闊[1-2]。云南山茶主要分布于云南、四川西南部和貴州西部，生長在海拔1 000～3 200 m之間，野生居群具有三個倍性[3-4]，即二倍、四倍和六倍體。

由于生態(tài)環(huán)境惡化，云南山茶野生居群日漸萎縮。目前主要繁殖方法為嫁接繁殖[5]，但嫁接技術(shù)尚不成熟且受季節(jié)影響。對云南山茶萌發(fā)速率[6]、耐旱[7]、耐寒[8]及雜交起源[9]、細胞多樣性[10]等研究較多，但有關(guān)云南山茶種子萌發(fā)，僅有王兵益等[6]對云南山茶種子進行了低溫沙藏促進萌發(fā)的研究，而對三個倍性云南山茶種子具體表型及萌發(fā)特性未有進一步研究分析。萌發(fā)特性是引種馴化工作前期重要的基礎(chǔ)工作，因此，本研究以不同倍性云南山茶種子為材料，觀測了不同倍性表型及低溫沙藏對云南山茶播種后其種子發(fā)芽勢和發(fā)芽率等萌發(fā)指標的影響，以及不同濃度梯度的GA3對高海拔居群種子各項萌發(fā)指標的影響，擬解決各倍性表型及萌發(fā)特性問題，為云南山茶種質(zhì)資源保護和栽培應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的3個云南山茶自然居群分別位于四川省鹽邊縣格薩拉園藝場(材料編號YY，下同)，四川省會東縣馬龍鄉(xiāng)(ML)，云南富民縣東村鎮(zhèn)(FM)，各倍性的地理位置及主要信息見表1。每個倍性居群選擇20株樣株，株間距50 m以上；在每個樣株樹冠中上部南向位置采集5～8個蒴果，于2020年9—10月完成采樣。蒴果在通風干燥處晾干后將種子取出，放入4 ℃冷藏待用。

表1 不同倍性云南山茶采集地信息

1.2 試驗方法

1.2.1種實表型性狀測定

測定指標包括蒴果長度、寬度、厚度和質(zhì)量以及種子的長度、寬度、厚度和百粒重。從每個倍性隨機選擇100個蒴果，用游標卡尺分別測定蒴果的最長、最寬及最厚處，測定精度0.1 cm，8次重復(fù)并求均值。在每個倍性的每一樣株上隨機選擇100粒種子，用游標卡尺測量其最長、最寬及最厚處，8次重復(fù)并計算平均值。

1.2.2種子百粒重測定

參考GB 2772—1999《林木種子檢驗規(guī)程》[12]，從測定樣品種子中取出100粒，8個重復(fù)，各重復(fù)分別用千分之一電子秤稱重(g)，計算均值。

1.2.3種子吸水率測定

參照《1996國際種子檢驗規(guī)程》[13]的方法。將每個倍性測定樣品分為3組，每組3個重復(fù)，求各組平均值。

1.2.4種子含水量測定

每個倍性隨機取出30粒種子，稱取質(zhì)量(m1)后放入80 ℃的烘箱中24 h，取出后冷卻至室溫再稱取各倍性質(zhì)量(m2)，每個倍性3次重復(fù)，取均值。

含水量(%)=[(m1-m2)/m1]×100%

1.2.5種子生活力測定

參考《1996國際種子檢驗規(guī)程》[12]方法，采用TTC(2,3,5-氯化三苯基四氮唑)染色后用固定波長分光光度計測定云南山茶種子生活力，每個倍性3次重復(fù)，求其平均值。

1.3 種子萌發(fā)實驗

將3個倍性種子先用0.5%的高錳酸鉀消毒1 h，然后用蒸餾水漂洗數(shù)遍直至種皮無紫色，之后與細砂及水混勻后分別放在不同塑封袋中，4 ℃沙藏50 d，每7 d檢測一次水分狀況，干燥時立即灑水即可，達到握土成團，一觸即散的狀態(tài)最佳。對照組在室溫條件下貯藏。50 d后將沙藏種子取出與對照組種子放在鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)盒中，在溫度25 ℃，濕度85%，光照強度12.5 μmol·(m2·s)-1的三洋培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)實驗。每個處理重復(fù)3次，每次重復(fù)均隨機選取30粒種子。每天定時觀察統(tǒng)計，并將萌發(fā)完成的種子移出培養(yǎng)盒。

另對YY(二倍體)云南山茶種子進行0、200、400、600 mg·L-1的GA3浸種處理，0即為清水浸種作為ck。消毒方法同上，浸種時長24 h，萌發(fā)條件同上。

1.3.1萌發(fā)指標測定

參考李先民等[14]的統(tǒng)計方法，以根長5 mm為萌發(fā)標準。分別計算下列萌發(fā)指標。

發(fā)芽率為種子萌發(fā)結(jié)束時所有已發(fā)芽種子數(shù)占供試種子總數(shù)的百分比。

發(fā)芽率(%)=(已發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù))×100%。

發(fā)芽勢為種子發(fā)芽達到峰值時統(tǒng)計已發(fā)芽種子數(shù)與供試種子總數(shù)的百分比。

發(fā)芽指數(shù)=∑Gt/Dt，式中，Gt為在時間t(d)的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)。

平均發(fā)芽時間=∑(D×n)/∑n，式中，D為從種子置入培養(yǎng)箱起算的天數(shù)；n為相應(yīng)各天的發(fā)芽種子數(shù)。

1.3.2數(shù)據(jù)分析

用Excel軟件統(tǒng)計不同倍性的各項測定結(jié)果并使用OriginPro 9.0軟件進行繪圖分析，運用SPSS 25軟件進行顯著性方差分析。

2 試驗結(jié)果

2.1 不同倍性云南山茶種子表型差異分析

由表2可知，云南山茶蒴果的長寬比均在0.74～1.02范圍內(nèi)，百粒重和蒴果質(zhì)量均為YY>ML>FM。Pearson相關(guān)性分析表明，海拔與蒴果長寬比呈正相關(guān)(r=0.573)，與蒴果質(zhì)量也呈正相關(guān)(r=0.647)，這與王桔紅等[16]的研究結(jié)果一致。ANOVA單因素方差分析表明，種子長寬比居群間差異顯著(p<0.05)，緯度與各倍性種子長度呈負相關(guān)(r=-0.992)，與蒴果長寬比也為負相關(guān)(r=-0.580)。種子含水量為YY>ML>FM，經(jīng)過LSD多重比較顯示，種子含水量間均有顯著差異(p<0.05)，Pearson相關(guān)性分析表明，海拔與云南山茶種子含水量呈顯著性正相關(guān)(r=-0.763)，即隨海拔升高種子含水量降低，這與屈燕等[15]的研究結(jié)果相同。另外百粒重為YY>ML>FM，組間差異顯著(p<0.05)；單因素方差分析表明，居群間差異顯著(F=6.74,p<0.05)。

表2 不同倍性云南山茶表型比較

2.2 低溫層積處理對不同倍性云南山茶種子萌發(fā)的影響

由圖1 A可知，對照組整體萌發(fā)指標均低于低溫處理組，其中3個倍性的平均萌發(fā)率為22%，ML的種子發(fā)芽勢雖不是最高，但發(fā)芽率卻最高，Pearson相關(guān)性分析可知，對照組平均萌發(fā)時間與海拔呈正相關(guān)(r=0.847)。另外，隨著染色體倍性的增加，其發(fā)芽勢也隨之變強，即倍性與發(fā)芽勢呈正相關(guān)(r=0.541)，這與趙寧等[18]的研究結(jié)果一致。發(fā)芽指數(shù)呈先高后低的趨勢，且與海拔無顯著性相關(guān)(p>0.05)。YY種子平均發(fā)芽時間顯著高于另外兩個倍性，說明作為云南山茶的原始倍性休眠狀態(tài)較難打破，且與其他倍性種子差異顯著(p<0.05)。ANOVA單因素分析顯示，倍性間差異顯著(F=6.53,p<0.05)。

由圖1 B可見，種子的發(fā)芽率為ML>FM>YY，即經(jīng)過相同時間低溫層積處理的種子發(fā)芽率全部高于對照組，說明低溫層積可以打破云南山茶種子休眠狀態(tài)。且處理組與對照組發(fā)芽率差異顯著(p<0.05)，其中低溫沙藏處理后的ML種子萌發(fā)率遠高于另外兩個倍性，即呈“低—高—低”萌發(fā)趨勢，這與張夢穎等[17]的研究結(jié)果一致。隨著染色體加倍，種子的萌發(fā)速度明顯加快，這與趙寧等[18]的研究結(jié)果一致。隨著海拔升高，種子的平均萌發(fā)時間逐漸縮短，即與倍性呈顯著負相關(guān)(r=-0.84)，這與屈燕等[15]的研究結(jié)果相同。對照組種子發(fā)芽勢為ML>FM>YY，與海拔無顯著相關(guān)性(p>0.05)，而3個倍性云南山茶經(jīng)過低溫層積處理50 d后，發(fā)芽勢均大于低溫層積前的發(fā)芽勢，說明低溫層積可以顯著提高不同倍性云南山茶種子萌發(fā)勢。

2.3 不同濃度GA3對二倍體種子萌發(fā)特性的影響

GA3可以有效打破種子休眠，破壞阻礙萌發(fā)過程中的各種活性物質(zhì)來提高萌發(fā)率、萌發(fā)勢以及種子生活力等。由圖2可見，在培養(yǎng)箱中恒溫恒濕播種條件下，200 mg·L-1GA3處理后各項指標均高于其他濃度處理，這與邱鵬飛等[19]的研究結(jié)果一致。不同濃度GA3對二倍體種子發(fā)芽勢的影響有顯著性差異(p<0.05)，這與李先民等[14]的研究結(jié)果一致。經(jīng)過GA3處理的種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢顯著高于對照組，0～400 mg·L-1范圍內(nèi)，隨著GA3濃度的增加，二倍體云南山茶種子的發(fā)芽率與發(fā)芽勢呈先升后降的趨勢，這與張存虎[22]的研究結(jié)果一致。GA3在不同程度上顯著提升了除發(fā)芽啟動時間之外的各項指標。因此，GA3明顯打破了云南山茶種子休眠。

2.4 海拔高度與低溫層積對云南山茶種子萌發(fā)特性的雙因素方差分析

如表3所示，低溫層積對云南山茶不同倍性種子的萌發(fā)率以及發(fā)芽勢的影響顯著，但在平均萌發(fā)時間上無影響；另外海拔高度對種子萌發(fā)平均時間影響極顯著，而對其他萌發(fā)指標無影響；雙因素交互作用顯示對所有萌發(fā)指標均有顯著性影響。

表3 海拔高度因子與低溫層積的雙因素方差分析

3 結(jié)論與討論

3.1 倍性對云南山茶萌發(fā)特性的影響

楊繼[20]認為，多倍體進化的結(jié)果一方面在很大程度上改善了不同基因組組分之間以及核基因組與細胞質(zhì)基因組之間的相互協(xié)調(diào)關(guān)系，并提高了各倍性間相容性；另一方面也使得多倍體植物的適應(yīng)進化、相同物種不同多倍體譜系的分化更加豐富多元。本研究結(jié)果表明，不同倍性云南山茶萌發(fā)特性及表型差異顯著，云南山茶在多倍化進程中，并不是隨著倍性增加其生物學特性增強，這與黃金艷等[21]的研究結(jié)果相同。這充分證明Stebbins[30]所指出的“每個物種都有一個最適的倍性，但絕大多數(shù)并非最高倍性”，也驗證了顧志建[4]指出的“四倍體云南山茶分布范圍、適應(yīng)性較二倍體更廣”的結(jié)論。因此推測四倍體植物內(nèi)源激素更為復(fù)雜活躍。

種子表型性狀是進行樹木分類和遺傳多樣性研究的重要指標[22]。通過表型性狀差異研究植物的遺傳多樣性報道較多，如對白皮松[24]、云杉[25]、蒙古櫟[26]等的群體遺傳多樣性研究。本研究表明，處于不同居群的云南山茶各項表型性狀及萌發(fā)指標間影響顯著，隨著染色體加倍，種子的含水量也隨之增加，說明在長期演化過程中，為了適應(yīng)惡劣的生存環(huán)境，云南山茶染色體發(fā)生變異加倍且表觀形態(tài)也隨之變化，形成多倍體云南山茶遍布我國西南地區(qū)乃至東南亞部分地區(qū)的局面。因此推測多倍化致使云南山茶抗逆能力較變異前增強。

3.2 不同前處理對云南山茶萌發(fā)特性的影響

魚小軍等[27]研究表明，低溫層積可以很大程度上有效打破種子休眠機制，促進草本以及木本植物的種子萌發(fā)[27]，但低溫層積是否對同一物種的不同倍性產(chǎn)生不同影響，則因物種不同而有差異。羅弦等[28]研究發(fā)現(xiàn)，低溫層積可顯著提高4種苔草發(fā)芽率、發(fā)芽勢等萌發(fā)指標，低溫層積120 d可以有效打破苔草種子綜合性休眠狀態(tài)，從而達到萌發(fā)高峰期。李欣勇等[29]研究發(fā)現(xiàn)，低溫層積兩個月可顯著提高球穗扁莎種子的各項萌發(fā)指標。本研究發(fā)現(xiàn)，低溫層積50 d，對不同倍性云南山茶種子各項萌發(fā)指標均有明顯提高，但對于各倍性的發(fā)芽啟動時間均無顯著影響。層積是否對不同倍性的發(fā)芽啟動時間具有影響，有待進一步實驗研究。

GA3能打破種子休眠，提高發(fā)芽率與發(fā)芽勢，但對于激素處理的最適濃度、處理后種子平均發(fā)芽時間等問題，則因物種不同而存在差異。馬艷華等[31]研究發(fā)現(xiàn)，白臘種子經(jīng)30 ℃溫水浸種12 h后再用80 mg·L-1GA3溶液浸種12 h，發(fā)芽率可達到68.3%。10～500 mg·L-1GA3可顯著提前水青岡種子的萌發(fā)時間，其中100 mg·L-1溶液處理效果最好，發(fā)芽率為72.2%[32]。而經(jīng)過10 mg·L-1GA3處理仙客來后的種子萌發(fā)指標與對照組萌發(fā)指標均存在顯著差異(p<0.05)[33]。本研究結(jié)果表明，200 mg·L-1GA3浸種24 h可以使二倍體云南山茶種子的發(fā)芽率達到70%，且顯著提高了發(fā)芽勢并縮短了發(fā)芽時間，但隨著濃度增加，種子的發(fā)芽啟動時間越長，這可能是二倍體作為云南山茶的基礎(chǔ)倍性，其內(nèi)源激素復(fù)雜，GA3的介入打亂了種子正常萌發(fā)進程，具體原因有待進一步研究。

3.3 結(jié) 論

植物長期適應(yīng)環(huán)境主要表現(xiàn)在表型及萌發(fā)特性差異形成多倍化現(xiàn)象，位于不同海拔生境居群已然形成不同倍性，不同倍性的云南山茶居群因長期存在于不同的生境，其所承受的生境壓力也差異顯著，最終會使各居群呈現(xiàn)出較顯著的遺傳多樣性。導(dǎo)致群體間的遺傳變異譜系化。但不同倍性云南山茶遺傳多樣性研究及各倍性種子的內(nèi)源激素差異還需進一步研究。