馬錢子總生物堿修復(fù)膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷的效果觀察及作用機(jī)制研究

王明喜，張麗霞，王長(zhǎng)平

(安陽(yáng)市中醫(yī)院，河南 安陽(yáng) 455000)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是一種以膝關(guān)節(jié)軟骨退變和損傷為主要病理特征的慢性退行性疾病，臨床主要表現(xiàn)為膝關(guān)節(jié)疼痛、腫脹、功能障礙等[1-2]。該病好發(fā)于老年人，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量[3]。修復(fù)受損的軟骨是治療KOA的主要方法[4]，臨床采用膝關(guān)節(jié)腔注射透明質(zhì)酸等藥物治療KOA，在一定程度上能夠緩解膝部疼痛、改善膝關(guān)節(jié)活動(dòng)度，然而對(duì)于軟骨損傷修復(fù)效果甚微[5-9]。中藥在修復(fù)軟骨損傷方面表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢(shì)，馬錢子常用于治療骨關(guān)節(jié)炎，能夠促進(jìn)軟骨損傷修復(fù)，臨床療效顯著[10-12]。馬錢子的主要有效成分是馬錢子總生物堿，其修復(fù)軟骨損傷的作用機(jī)制尚不明確。為了探討馬錢子總生物堿修復(fù)KOA軟骨損傷的效果及作用機(jī)制，我們建立了大鼠KOA模型，并進(jìn)行了相關(guān)實(shí)驗(yàn)研究，現(xiàn)總結(jié)報(bào)告如下。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物12周齡SPF級(jí)雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220±10)g，購(gòu)自廣東省科學(xué)院健康醫(yī)學(xué)研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SYXK(粵)2018-0183。實(shí)驗(yàn)方案通過(guò)醫(yī)學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑木瓜蛋白酶(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)，蘇木精伊紅(hematoxylin and eosin，HE)染色試劑盒、放射免疫沉淀法(radioimmunoprecipitation assay，RIPA)緩沖液、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、牛血清蛋白(bovine serum albumin，BSA)和二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白濃度測(cè)試試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，馬錢子總生物堿(麗珠集團(tuán)利民制藥公司)，塞來(lái)昔布膠囊(美國(guó)輝瑞公司)，戊巴比妥鈉(上海信裕生物科技有限公司)，福爾馬林(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司)，Trizol試劑、PrimeScript TM RT試劑盒(日本Takara公司)，SYBR-Green定量PCR預(yù)混試劑(北京康潤(rùn)誠(chéng)業(yè)生物科技有限公司)，引物由生工生物工程股份有限公司合成，兔抗鼠基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)-9、MMP-13、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、糖原合成酶激酶(glycogen synthase kinase，GSK)-3β、β-聯(lián)蛋白(β-catenin)和甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)一抗(美國(guó)Abcam公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G二抗(上海賽信通生物試劑有限公司)，UltraSignal超敏化學(xué)發(fā)光底物(北京四正柏生物科技有限公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)儀器7300實(shí)時(shí)定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)儀(美國(guó)ABI)，Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)(美國(guó)Bio-rad)，DM4000B光學(xué)顯微鏡(LEICA公司)。

2 方 法

2.1 造模及模型鑒定方法采用隨機(jī)數(shù)字表將60只大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型組、塞來(lái)昔布組和馬錢子總生物堿低、中、高劑量組，每組10只。模型組、塞來(lái)昔布組和馬錢子總生物堿低、中、高劑量組，均于大鼠雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)腔注射4%木瓜蛋白酶溶液0.2 mL，每隔2 d注射1次，共注射3次[6]。第3次注射后，每天驅(qū)使大鼠活動(dòng)2 h。于溫度(22±2)℃、濕度50%～60%條件下繼續(xù)正常飼養(yǎng)1周后，從各組中隨機(jī)選取1只大鼠，處死后取膝關(guān)節(jié)軟骨，制備石蠟切片，HE染色后，于直視和顯微鏡下觀察，判斷造模是否成功。

2.2 干預(yù)方法造模成功后，開始進(jìn)行藥物干預(yù)。馬錢子總生物堿低、中、高劑量組大鼠分別以馬錢子總生物堿混懸液進(jìn)行灌胃，每日劑量分別為50 mg·kg-1、100 mg·kg-1和150 mg·kg-1；塞來(lái)昔布組大鼠以塞來(lái)昔布溶液進(jìn)行灌胃(塞來(lái)昔布膠囊粉劑溶于去離子水中)，每日劑量為24 mg·kg-1；正常對(duì)照組和模型組大鼠以生理鹽水進(jìn)行灌胃，每日1 mL。所有大鼠均于溫度(22±2)℃、濕度50%～60%條件下正常飼養(yǎng)。

2.3 膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度評(píng)價(jià)方法藥物干預(yù)6周后，于大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉進(jìn)行麻醉，采用頸椎脫臼法處死大鼠。每只大鼠取雙側(cè)后肢膝關(guān)節(jié)(股骨遠(yuǎn)端1/4至脛骨近端1/4)，左側(cè)膝關(guān)節(jié)于-80 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?，右?cè)膝關(guān)節(jié)用于軟骨損傷程度評(píng)價(jià)。將右側(cè)膝關(guān)節(jié)于10%中性福爾馬林固定液中固定；1周后，取出膝關(guān)節(jié)，用PBS沖洗，放入乙二胺四乙酸粉末中脫鈣。4周后，使用乙醇進(jìn)行梯度脫水，采用石蠟包埋，沿矢狀面切片，厚度5 μm。PBS沖洗后，加入HE染色，封片，于顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)檢查。采用Mankin’s評(píng)分法[13]評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度。

2.4 膝關(guān)節(jié)軟骨損傷及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA表達(dá)分析方法根據(jù)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷程度評(píng)價(jià)結(jié)果，選取馬錢子總生物堿低、中、高劑量組中軟骨修復(fù)效果最佳的1組以及正常對(duì)照組、模型組和塞來(lái)昔布組進(jìn)行膝關(guān)節(jié)軟骨損傷相關(guān)基因mRNA和蛋白的表達(dá)分析。從上述4組中分別取5只大鼠的單側(cè)膝關(guān)節(jié)，收集軟骨組織，采用Trizol法分別提取總RNA。采用PrimeScript TM RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。采用SYBR-Green定量PCR預(yù)混試劑進(jìn)行RT-qPCR，PCR擴(kuò)增引物見表1，擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火45 s，72 ℃ 延伸30 s，40個(gè)循環(huán)。以GAPDH作為內(nèi)參基因，并采用2-ΔΔCT計(jì)算膝關(guān)節(jié)軟骨損傷相關(guān)基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

2.5 膝關(guān)節(jié)軟骨損傷及Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因蛋白表達(dá)分析方法從正常對(duì)照組、模型組、塞來(lái)昔布組及馬錢子總生物堿中劑量組中分別取5只大鼠的單側(cè)膝關(guān)節(jié)，收集軟骨組織。分別研磨后，采用裂解混懸液(RIPA緩沖液∶PMSF=1∶100)提取總蛋白。采用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定總蛋白濃度。調(diào)整樣品蛋白濃度一致后，采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后，將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)至聚偏二氟乙烯膜，加入3%的BSA溶液于室溫下封閉2 h。采用TBST洗膜3次，每次10 min。加入兔抗鼠MMP-9、MMP-13、IL-1β、β-catenin、GSK-3β和GAPDH一抗，于4 ℃過(guò)夜孵育，抗體使用比例均為1∶1000。再用TBST洗滌3次，每次10 min。加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔Ig G二抗于室溫下孵育2 h，抗體使用比例為1∶4000。用TBST洗膜3次，每次10 min，加入U(xiǎn)ltraSignal超敏化學(xué)發(fā)光底物覆蓋膜，室溫孵育1 min，將膜放入凝膠成像儀顯影并拍照。采用Image J圖像處理軟件處理圖片，并提取蛋白條帶的灰度值，并分別以GAPDH蛋白為基準(zhǔn)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，計(jì)算蛋白條帶的相對(duì)灰度值，分析蛋白表達(dá)水平。

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS24.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。各組大鼠Mankin’s評(píng)分和MMP-9、MMP-13、IL-1β、β-catenin、GSK-3β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的組間比較均采用單因素方差分析，組間兩兩比較均采用LSD-t檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié) 果

3.1 模型鑒定結(jié)果造模完成1周后，直視下觀察，正常大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨呈膠凍樣，表面光滑；KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨色澤暗淡，表面粗糙。膝關(guān)節(jié)軟骨組織切片顯示，正常大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)完整、潮線清晰，軟骨細(xì)胞均勻分布；KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)模糊，潮線不完整或丟失，軟骨細(xì)胞聚集，排列紊亂,提示造模成功。見圖1。

圖1 造模完成1周后大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色圖片(×200)

3.2 膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)檢查結(jié)果藥物干預(yù)6周后，正常對(duì)照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)完整、潮線清晰，軟骨細(xì)胞均勻分布；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)破壞嚴(yán)重，潮線模糊，軟骨細(xì)胞聚集；馬錢子總生物堿低、中、高劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)可辨識(shí)，軟骨細(xì)胞聚集現(xiàn)象較模型組減少，且馬錢子總生物堿中劑量組的大鼠軟骨改善效果最明顯；塞來(lái)昔布組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織結(jié)構(gòu)較完整、清晰，軟骨細(xì)胞聚集現(xiàn)象不明顯。見圖2。

圖2 干預(yù)6周后6組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織HE染色圖片(×200)

3.3 膝關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin’s評(píng)分結(jié)果6組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin’s評(píng)分的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(0.28±0.20)分，(8.97±0.46)分，(7.12±0.23)分，(3.23±0.18)分，(6.21±0.25)分，(0.77±0.17)分，F(xiàn)=8.025，P=0.000]。正常對(duì)照組和馬錢子總生物堿低、中、高劑量組及塞來(lái)昔布組的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin’s評(píng)分均低于模型組(LSD-t=54.785，P=0.000；LSD-t=11.316；P=0.000；LSD-t=36.747，P=0.000；LSD-t=16.671，P=0.000；LSD-t=21.626，P=0.000)；馬錢子總生物堿低、中和高劑量組的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin’s評(píng)分均高于塞來(lái)昔布組(LSD-t=70.210，P=0.000；LSD-t=31.420，P=0.000；LSD-t=56.902，P=0.000)；馬錢子總生物堿中劑量組的大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷Mankin’s評(píng)分低于馬錢子總生物堿低、高劑量組(LSD-t=42.119；P=0.000；LSD-t=30.590；P=0.000)。

3.4 軟骨損傷相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)分析結(jié)果正常對(duì)照組、模型組、塞來(lái)昔布組及馬錢子總生物堿中劑量組4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組(mRNA相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=18.189，P=0.000；LSD-t=16.741，P=0.000；LSD-t=16.887P=0.000；蛋白相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=12.731，P=0.000；LSD-t=25.484，P=0.000；LSD-t=16.887，P=0.000)。馬錢子總生物堿中劑量組和塞來(lái)昔布組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于模型組(mRNA相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=16.215，P=0.000；LSD-t=13.825，P=0.000；LSD-t=12.146，P=0.000；LSD-t=10.743，P=0.000；LSD-t=15.539，P=0.000；LSD-t=29.503，P=0.000；蛋白相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=17.607，P=0.000；LSD-t=15.215，P=0.000；LSD-t=13.552，P=0.000；LSD-t=10.896，P=0.000；LSD-t=35.078，P=0.000；LSD-t=30.727，P=0.000)。馬錢子總生物堿中劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量與塞來(lái)昔布組比較，組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(mRNA相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=1.107，P=0.323；LSD-t=1.357，P=0.192；LSD-t=1.614，P=0.124；蛋白相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=1.698，P=0.107；LSD-t=0.947，P=0.356；LSD-t=1.175，P=0.255)。見表2和圖3。

表2 4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中軟骨損傷相關(guān)基因mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量

(1)正常對(duì)照組；(2)模型組；(3)塞來(lái)昔布組；(4)馬錢子總生物堿中劑量組；MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶；IL：白細(xì)胞介素；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

3.5 Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA和蛋白表達(dá)分析結(jié)果正常對(duì)照組、模型組、塞來(lái)昔布組及馬錢子總生物堿中劑量組4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GSK-3β、β-catenin的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量的組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中β-catenin的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均高于正常對(duì)照組(LSD-t=17.657，P=0.000；LSD-t=29.000，P=0.000)；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GSK-3β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于正常對(duì)照組(LSD-t=21.535，P=0.000；LSD-t=15.707，P=0.000)；馬錢子總生物堿中劑量組和塞來(lái)昔布組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中β-catenin的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于模型組(mRNA相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=13.117，P=0.000；LSD-t=35.420，P=0.000；蛋白相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=14.906，P=0.000；LSD-t=34.192，P=0.000)；馬錢子總生物堿中劑量組和塞來(lái)昔布組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中GSK-3β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量高于模型組(mRNA相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=10.941，P=0.000；LSD-t=13.446，P=0.000；蛋白相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=11.461，P=0.000；LSD-t=16.578，P=0.000)；馬錢子總生物堿中劑量組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織中β-catenin和GSK-3β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量與塞來(lái)昔布組比較，組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(mRNA相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=0.591，P=0.562；LSD-t=0.797，P=0.436；蛋白相對(duì)表達(dá)量：LSD-t=0.243，P=0.811；LSD-t=1.762，P=0.094)。見表3和圖4。

表3 4組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織Wnt/β-catenin信號(hào)通路相關(guān)基因mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量

(1)正常對(duì)照組；(2)模型組；(3)塞來(lái)昔布組；(4)馬錢子總生物堿中劑量組；GSK-3β：糖原合成酶激酶；β-catenin：β-聯(lián)蛋白；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。

4 討 論

研究表明，KOA膝關(guān)節(jié)軟骨損傷與炎癥反應(yīng)密切相關(guān)[14]。炎癥因子IL-1β過(guò)量表達(dá)會(huì)加劇KOA的炎癥反應(yīng)和軟骨退化[15]。MMP-9和MMP-13能夠降解細(xì)胞外基質(zhì)，加劇膝骨關(guān)節(jié)軟骨的破壞，促進(jìn)KOA的發(fā)生和發(fā)展[16-18]。本研究結(jié)果顯示，模型組MMP-9、MMP-13和IL-1β的mRNA和蛋白表達(dá)量均高于正常對(duì)照組，而以劑量100 mg·kg-1的馬錢子總生物堿進(jìn)行灌胃治療后，這些基因的表達(dá)量均低于模型組，且和塞來(lái)昔布組相關(guān)基因的mRNA和蛋白表達(dá)量相當(dāng)；提示馬錢子總生物堿能夠通過(guò)抑制MMP-9、MMP-13和IL-1β的表達(dá)修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷，治療KOA。

Wnt/β-catenin信號(hào)通路是Wnt信號(hào)通路中的經(jīng)典信號(hào)通路，主要參與調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及軟骨基質(zhì)的分解代謝[19-20]。β-catenin是Wnt/β-catenin信號(hào)通路中重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子，GSK-3β能夠使β-catenin磷酸化，導(dǎo)致β-catenin失去活性，使Wnt/β-catenin信號(hào)通路被抑制；當(dāng)Wnt/β-catenin信號(hào)通路被激活時(shí)，Wnt蛋白與跨膜受體Lrp5/6結(jié)合，抑制GSK-3β活性，導(dǎo)致β-catenin在細(xì)胞核內(nèi)聚集，與T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子或淋巴增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，激活軟骨細(xì)胞中MMP-9、MMP-13和IL-1β等基因的表達(dá)[21-25]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，模型組β-catenin的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，而GSK-3β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路被激活；與模型組比較，塞來(lái)昔布組和馬錢子總生物堿中劑量組中β-catenin的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量降低，而GSK-3β的mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量升高，提示W(wǎng)nt/β-catenin信號(hào)通路被抑制。因此，馬錢子總生物堿治療大鼠KOA可能是通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，進(jìn)而抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)KOA大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的修復(fù)。

本研究的結(jié)果表明，馬錢子總生物堿能夠有效修復(fù)KOA大鼠軟骨損傷，其修復(fù)效果與劑量有關(guān)；馬錢子總生物堿能夠抑制大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織MMP-9、MMP-13、IL-1β及β-catenin的mRNA和蛋白表達(dá)，促進(jìn)GSK-3β的mRNA和蛋白表達(dá)，且與塞來(lái)昔布的效果相當(dāng)；馬錢子總生物堿抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路可能是其修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨損傷的作用機(jī)制之一。