基于分子動(dòng)力學(xué)模擬的Vmo Lac非特異性底物催化活性的理論研究

李聰聰，劉明皓，韓佳睿，朱鏡璇，韓葳葳，李婉南

（吉林大學(xué)分子酶學(xué)工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,生命科學(xué)學(xué)院,長(zhǎng)春 130012）

有機(jī)磷農(nóng)藥在我國(guó)的生產(chǎn)和使用廣泛，但其使用后會(huì)不同程度地殘留在農(nóng)作物中，造成嚴(yán)重的土壤和水污染，破壞生態(tài)平衡，并且對(duì)生物體產(chǎn)生直接或間接的毒性，極大地威脅人類健康［1］.現(xiàn)有的去除有機(jī)磷類殘留物方法產(chǎn)生的負(fù)面效果較多，如成本高，反應(yīng)劇烈，存在安全隱患等，因而難以得到廣泛應(yīng)用.細(xì)菌磷酸三酯酶（PTEs）是目前存在的能有效降解有機(jī)磷農(nóng)藥殘留的一類酶［2～4］.常溫下，磷酸三酯酶穩(wěn)定性較差，而嗜熱磷酸三酯酶樣內(nèi)酯酶（PLLs）是具有嗜熱性的一類天然內(nèi)酯酶，在高溫下具有高反應(yīng)活性，因此PLLs可作為殘留有機(jī)磷農(nóng)藥降解的靶標(biāo)蛋白［5，6］.PLLs按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)和催化活性可分為PLLs-A（天然的?；呓z氨酸內(nèi)酯酶）家族和PLLs-B（氧合內(nèi)酯酶）家族［7，8］.

VmoLac是來自極端嗜性古細(xì)菌V.Moutnovskia（YP_004245953）的PLLs-A家族成員［9］，其可在60～98℃下穩(wěn)定存在［10，11］，并在80℃時(shí)活性最高［12］，比其超耐熱同家族SsoPox的高出20℃以上.VmoLac與其它熱穩(wěn)定酶［13］具有許多共同的結(jié)構(gòu)決定因素，如結(jié)構(gòu)表面存在大量的鹽橋以及較大的疏水性同源二聚體界面.VmoLac的活性位點(diǎn)Loop8呈剛性并且形成了α螺旋結(jié)構(gòu)，與最接近的PLL（50%序列同一性）仍有很大不同，這種差異會(huì)對(duì)VmoLac結(jié)合口袋產(chǎn)生重要影響.2015年，Hiblot等［9］提出水解內(nèi)酯酶的機(jī)理：VmoLac與其底物3-oxo-C10-AHL結(jié)合的結(jié)構(gòu)能證明酶與結(jié)合的內(nèi)酯具有特異性相互作用，VmoLac對(duì)內(nèi)酯的水解機(jī)理與之前提出的SsoPox水解內(nèi)酯的機(jī)理相似.內(nèi)酯環(huán)結(jié)合到雙金屬中心上可使內(nèi)酯中sp2雜化的碳原子更親電，并釋放出活化的橋接水分子.后者隨后可通過由β-金屬穩(wěn)定的帶負(fù)電荷的四面體中間體攻擊內(nèi)酯中sp2雜化的碳原子.同時(shí)內(nèi)酯環(huán)上的羰基氧和Y98相互作用，含氧陰離子上的電子對(duì)折回，使酯鍵斷裂，形成羧酸和醇化物.該醇化物可能需要酸性輔助，D257使剩下的醇化物質(zhì)子化.因此，D257與極化水分子可以通過氫鍵連接起來，然后通過雙金屬中心與底物中內(nèi)酯環(huán)的羰基碳原子、對(duì)氧磷的磷原子發(fā)生親核反應(yīng)而激活催化反應(yīng).

基于此，本文對(duì)VmoLac的非特異性底物催化活性進(jìn)行了理論研究.采用分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬基于PLLs的催化水解機(jī)理，從蛋白質(zhì)構(gòu)象變化的角度探究了VmoLac非特異性底物的催化活性，并通過研究4種底物分別與VmoLac結(jié)合的能力和模式，比較了其催化水解長(zhǎng)鏈內(nèi)酯（3-oxo-C10-AHL）、短鏈內(nèi)酯（3-oxo-C6-AHL）、壬內(nèi)酯（γ-nonalacton）以及對(duì)氧磷（ethyl-paraoxon）的能力.為VmoLac非特異性底物催化活性的研究提供了重要的理論依據(jù).

1 模擬方法

1.1 底物優(yōu)化及分子對(duì)接

模擬所需的初始蛋白質(zhì)晶體結(jié)構(gòu)（PDB code：4RDY）［9］取自PDB數(shù)據(jù)庫(kù)，4種底物3-oxo-C10-AHL，3-oxo-C6-AHL，γ-nonalacton和ethyl-paraoxon來自于Chemspider數(shù)據(jù)庫(kù).在B3LYP/6-31G*水平上優(yōu)化4個(gè)底物的結(jié)構(gòu)得到最優(yōu)構(gòu)象，并進(jìn)行了密度泛函理論（DFT）計(jì)算以得到最高占據(jù)分子軌道-最底未占據(jù)分子軌道（HUMO-LUMO）帶隙能量，計(jì)算均采用Gaussian 09［14］程序并用Multiwfn程序［15］對(duì)得到的分子軌道進(jìn)行可視化分析.采用Autodock4.2［16，17］軟件將小分子配體3-oxo-C10-AHL，3-oxo-C6-AHL，γ-nonalacton和ethyl-paraoxon使用半柔性對(duì)接方式對(duì)接到VmoLac的活性口袋中.根據(jù)已經(jīng)確定VmoLac晶體結(jié)構(gòu)的底物結(jié)合位置［9］，將對(duì)接盒子的大小設(shè)為x=40，y=35，z=30，盒子的中心設(shè)為x=2.251，y=14.204，z=20.115，每個(gè)格點(diǎn)長(zhǎng)度為0.0375 nm.采用拉馬克遺傳算法進(jìn)行分子對(duì)接計(jì)算，從對(duì)接結(jié)果聚類最多的一類中選取能量最低的結(jié)構(gòu)用做分子動(dòng)力學(xué)模擬的初始結(jié)構(gòu).

1.2 分子動(dòng)力學(xué)模擬

分別對(duì)VmoLac/3-oxo-C10-AHL，VmoLac/3-oxo-C6-AHL，VmoLac/γ-nonalacton和VmoLac/ethyl-paraoxon 4個(gè)復(fù)合物進(jìn)行100 ns的分子動(dòng)力學(xué)模擬，并對(duì)每個(gè)體系做3次平行模擬.所有分子動(dòng)力學(xué)模擬均采用GROMACS程序［18，19］運(yùn)行，使用AMBERff99SB力場(chǎng)［20］構(gòu)建蛋白質(zhì)的參數(shù)文件，小分子配體用GAFF力場(chǎng)［21］處理，其拓?fù)湮募ㄟ^執(zhí)行ACPYPE程序［22］生成.每個(gè)體系的蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物都使用TIP3P水模型［23］在尺寸為1 nm×1 nm×1 nm的周期性立方體盒子下進(jìn)行MD模擬，為了使復(fù)合物保持電中性并確保離子濃度為150 mmol/L，向每個(gè)體系隨機(jī)加入了適量的抗衡離子.每個(gè)體系的水分子和Na+數(shù)量如表1所示.

Table 1 Number of water and Na+for four simulation systems

采用最陡下降法使體系能量最小化.隨后進(jìn)行體系兩個(gè)階段的預(yù)平衡模擬，即100 ps的NVT模擬（Berendsen溫度耦合恒定的顆粒數(shù)、體積和溫度）和100 ps的NPT模擬（Parrinello Rahman壓力耦合恒定的顆粒數(shù)、壓力和溫度）.溫度和壓力的耦合常數(shù)分別設(shè)為0.1和2.0 ps，NPT模擬之后，盒子中的體系密度已達(dá)到最優(yōu)狀態(tài)，此時(shí)盒子的尺寸為0.85 nm×0.85 nm×0.85 nm.所有的鍵長(zhǎng)和鍵角均采用P-LINCS［24］進(jìn)行約束，并使用PME方法［24］處理長(zhǎng)程靜電相互作用.范德華相互作用的截?cái)嘀禐?.4 nm.待所有熱力學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定后，對(duì)4個(gè)體系分別進(jìn)行步長(zhǎng)為2 fs，每隔2 ps保存一次坐標(biāo)文件，以便分析使用.

1.3 協(xié)方差分析

使用Bio3D［25，26］進(jìn)行協(xié)方差分析，通過檢測(cè)所有成對(duì)交叉相關(guān)系數(shù)的大小來評(píng)估系統(tǒng)的原子波動(dòng)/位移與其它系統(tǒng)之間的相關(guān)程度［27］.Bio3D的作用是生成一個(gè)由所有原子相互關(guān)系組成的矩陣，其元素可以用圖形的形式顯示出來，通常稱為動(dòng)態(tài)相互關(guān)系映射（Dynamic cross-correlation map，DCCM）.在協(xié)方差圖中，坐標(biāo)軸比例尺對(duì)應(yīng)于原子序數(shù).紅色區(qū)域顏色越深表示矩陣元素值越正，兩種原子運(yùn)動(dòng)模式之間的相關(guān)性越正，與矩陣元素值一致的白色區(qū)域?yàn)?.藍(lán)色區(qū)域越多，表示矩陣元素值越負(fù)，說明對(duì)應(yīng)的兩種原子運(yùn)動(dòng)模式趨于負(fù)相關(guān).矩陣的對(duì)角線是方差，必須大于零，所以其呈白色或紅色.

2 結(jié)果與討論

2.1 底物結(jié)構(gòu)優(yōu)化及其反應(yīng)位點(diǎn)預(yù)測(cè)

模擬3-oxo-C10-AHL，3-oxo-C6-AHL，γ-nonalacton和ethyl-paraoxon的三維（3D）結(jié)構(gòu)如圖1所示.

Fig.1 3D structures of 3-oxo-C10-AHL,3-oxo-C6-AHL,γ-nonalacton and ethyl-paraoxon

通過DFT計(jì)算后用Multiwfn程序分析得到4種底物的LUMO和HUMO軌道的能量值以及能量差如圖2所示.圖中給出了化合物由HOMO軌道躍遷至LUMO軌道的電子分布變化以及躍遷的能量差（Egap，表示電子躍遷所需能量的大小，即化合物發(fā)生反應(yīng)趨勢(shì)的大?。?對(duì)比圖2（A）和（B）可知，3-oxo-C10-AHL躍遷的能量差值（Egap）小于3-oxo-C6-AHL，說明前者更易發(fā)生電子轉(zhuǎn)移，且兩個(gè)化合物電子在軌道間躍遷的轉(zhuǎn)移主要發(fā)生在碳鏈處，由此可推測(cè)內(nèi)酯鏈的長(zhǎng)短對(duì)反應(yīng)的發(fā)生具有重要影響.由圖2（C）和（D）可知，γ-nonalacton的LUMO軌道的電子集中分布在內(nèi)酯環(huán)上，所以該環(huán)易發(fā)生親核反應(yīng)，而ethyl-paraoxon不存在內(nèi)酯環(huán)，其親核反應(yīng)只能發(fā)生在磷原子上，且磷原子沒有電子的分布，所以發(fā)生反應(yīng)的趨勢(shì)較弱.通過以上兩個(gè)底物的比較可知，前者的Egap值小于后者，即壬內(nèi)酯比對(duì)氧磷更易發(fā)生電子躍遷.綜上，3-oxo-C10-AHL和γ-nonalacton更易參與親核反應(yīng)及與酶結(jié)合發(fā)生催化反應(yīng).

Fig.2 Electron orbital and orbital energy difference between HOMO and LUMO orbital for 3-oxo-C10-AHL(A),3-oxo-C6-AHL(B),γ-nonalacton(C)and ethyl-paraoxon(D)

2.2 分子對(duì)接及底物與Vmo Lac的相互作用

圖3 （A）為VmoLac與3-oxo-C10-AHL復(fù)合物的3D結(jié)構(gòu)圖，圖3（B）為VmoLac單體結(jié)構(gòu)的表面靜電勢(shì)分布圖，帶負(fù)電荷的區(qū)域用藍(lán)色表示，帶正電荷的區(qū)域用紅色表示，不帶電荷的區(qū)域用綠色表示.活性位點(diǎn)口袋即底物結(jié)合部位用黃色矩形突出標(biāo)記.結(jié)果表明，底物相對(duì)于晶體結(jié)構(gòu)配體的位置偏移小于2 nm（圖S1，見本文支持信息）.4個(gè)復(fù)合物的結(jié)合自由能分別為-59，-46，-75和-54 kJ/mol.

Fig.3 Overview of Vmo Lac/3-oxo-C10-AHL(PDBcode:4RDY)(A)and the surface electrostatic potential of Vmo Lac(B)

將對(duì)接得到的復(fù)合物VmoLac/3-oxo-C10-AHL，VmoLac/3-oxo-C6-AHL，VmoLac/γ-nonalacton和VmoLac/ethyl-paraoxon通過PLIP服務(wù)器進(jìn)行配體與VmoLac之間的相互作用分析［28］.4種底物與蛋白的相互作用結(jié)果如圖4所示，Loop8（Y356—T280）是位于VmoLac的活性中心附近且對(duì)酶發(fā)生催化反應(yīng)具有重要影響的區(qū)域，由圖4（A）可知，Loop8區(qū)域中可以與3-oxo-C10-AHL的碳鏈部分發(fā)生疏水相互作用的殘基包括Y265，V269，T273，V274和W277，而與3-oxo-C6-AHL產(chǎn)生疏水作用的殘基僅包括Y265，V274和W277，可見，長(zhǎng)鏈內(nèi)酯更易與酶的Loop8區(qū)域發(fā)生疏水作用，進(jìn)而保證長(zhǎng)鏈可以有足夠的空間進(jìn)入活性中心，短鏈內(nèi)酯卻相反.由圖4（C）和（D）可見，γ-nonalacton和ethyl-paraoxon與酶的相互作用差異較大，與對(duì)氧磷作用的殘基有L28，W224，I229，Y230，I262，W264，Y265和W277.其中Y265與其產(chǎn)生共軛相互作用.對(duì)氧磷底物與內(nèi)酯底物不同的是對(duì)氧磷中不含內(nèi)酯環(huán)，因此不存在Y98與對(duì)氧磷的相互作用.Y98是影響VmoLac特異性催化底物的重要?dú)埢?，并影響VmoLac催化Paraoxon的活性.

Fig.4 Interaction diagram between 3-oxo-C10-AHL(A),3-oxo-C6-AHL(B),γ-nonalacton(C),ethyl-paraoxon(D)and Vmo Lac generated with PLIP

2.3 分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性

分析了4個(gè)體系在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中不同配體結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性影響的差異.蛋白質(zhì)Cα原子骨架的均方根偏差（RMSD）可用于表征蛋白質(zhì)構(gòu)象差異程度，回轉(zhuǎn)半徑（Rg）可以反映蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)緊密程度.4個(gè)復(fù)合物動(dòng)力學(xué)模擬的RMSD結(jié)果及標(biāo)準(zhǔn)差如圖5所示，可見，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的誤差值在合理范圍內(nèi)，模擬體系達(dá)到平衡，可以保證結(jié)論的可靠性.

根據(jù)每個(gè)體系中蛋白質(zhì)的RMSD和Rg值的概率密度分布繪制的自由能分布如圖6所示，自由能值越低分布概率越大.由圖6（A）可見，VmoLac/3-oxo-C10-AHL體系的主能量盆位于RMSD值（～0.175nm）和Rg值（～1.915 nm）之間，而對(duì)于VmoLac/3-oxo-C6-AHL復(fù)合物，主能量盆在RMSD值（～0.275 nm）和Rg值（～1.835 nm）之間［圖6（B）］，

Fig.5 Root-mean-square deviation(RMSD)and standard deviation plot of the repeated simulations for Vmo Lac/3-oxo-C10-AHL(A),Vmo Lac/3-oxo-C6-AHL(B),Vmo Lac/γ-nonalacton(C)and Vmo Lac/ethyl-paraoxon(D)

Fig.6 Free energy landscape for R g and RMSD of Vmo Lac/3-oxo-C10-AHL(A),Vmo Lac/3-oxo-C6-AHL(B),Vmo Lac/γ-nonalacton(C)and Vmo Lac/ethyl-paraoxon(D)

可以看出后者的RMSD值明顯高于前者，而Rg值低于前者.兩者RSMD值的差異說明3-oxo-C10-AHL結(jié)合會(huì)使VmoLac更穩(wěn)定，Rg結(jié)果的差異表明當(dāng)?shù)孜锸?-oxo-C10-AHL時(shí)，VmoLac的蓬松程度更大，更有利于底物進(jìn)入酶的活性口袋與之結(jié)合.圖6（C）和（D）分別為VmoLac/γ-nonalacton和VmoLac/ethyl-paraoxon的自由能分布圖，分析原理與前兩個(gè)體系相同.結(jié)果表明，γ-nonalacton比paraoxon與VmoLac結(jié)合更穩(wěn)定，VmoLac/γ-nonalacton體系的蛋白在運(yùn)動(dòng)過程中更蓬松，更易于底物與酶的結(jié)合并發(fā)生催化作用．

均方根波動(dòng)（RMSF）可用于計(jì)算單個(gè)殘基的波動(dòng)幅度，并用于衡量在動(dòng)力學(xué)模擬過程中原子運(yùn)動(dòng)的自由程度，從而可以反映蛋白質(zhì)區(qū)域運(yùn)動(dòng)的靈活性.4個(gè)體系在平衡狀態(tài)下計(jì)算RMSF得到的結(jié)果如圖7所示，Loop8（Y265—T280）區(qū)域的RMSF值在不同體系中表現(xiàn)出明顯的差異性.

由圖7（A）可見，VmoLac/3-oxo-C10-AHL比VmoLac/3-oxo-C6-AHL復(fù)合物中Loop8結(jié)構(gòu)域中殘基的運(yùn)動(dòng)自由度高，由圖7（B）可見，與VmoLac/ethyl-paraoxon體系相比，VmoLac/γ-nonalacton體系的Loop8區(qū)域的RMSF值明顯大得多，說明該區(qū)域的殘基運(yùn)動(dòng)自由度高.Loop8區(qū)域位于VmoLac酶的活性區(qū)域附近，對(duì)酶的催化活性有重要影響，所以Loop8區(qū)域的運(yùn)動(dòng)自由度高會(huì)使3-oxo-C10-AHL和γ-nonalacton更易進(jìn)入酶的活性口袋區(qū)域，并且更好地結(jié)合在疏水通道上，促進(jìn)VmoLac對(duì)長(zhǎng)鏈內(nèi)酯和壬內(nèi)酯的催化水解作用.

Fig.7 Comparison of the RMSF plots of proteins in Vmo Lac/3-oxo-C10-AHL and Vmo Lac/3-oxo-C6-AHL(A)Vmo Lac/γ-nonalacton and Vmo Lac/ethyl-paraoxon(B)complexs

2.4 配體結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)運(yùn)動(dòng)的影響

為了從構(gòu)象變化的角度解釋蛋白質(zhì)與配體之間的相互作用以及蛋白質(zhì)殘基之間的運(yùn)動(dòng)相互聯(lián)系，對(duì)分子間的運(yùn)動(dòng)相關(guān)性進(jìn)行了分析，即協(xié)方差分析.圖8給出了蛋白質(zhì)區(qū)域強(qiáng)烈的相關(guān)性構(gòu)象變化.通常，代表正值的紅色區(qū)域表示殘基的強(qiáng)烈相關(guān)運(yùn)動(dòng)，代表負(fù)值的藍(lán)色區(qū)域可能與負(fù)相關(guān)運(yùn)動(dòng)有關(guān).對(duì)角線區(qū)域顯示出最強(qiáng)烈的正相關(guān)運(yùn)動(dòng)，因?yàn)槠涫菤埢c自身的相關(guān)運(yùn)動(dòng).由圖8（A）和（B）可見，通過對(duì)比VmoLac/3-oxo-C10-AHL體系和VmoLac/3-oxo-C6-AHL體系中Loop8區(qū)域的殘基運(yùn)動(dòng)相關(guān)性可知，前者明顯比后者在Loop8區(qū)域的正相關(guān)性強(qiáng)并且在動(dòng)力學(xué)模擬過程中波動(dòng)幅度較大，由于Loop8區(qū)域位于VmoLac的活性中心附近，Loop8的運(yùn)動(dòng)有利于幫助3-oxo-C10-AHL的長(zhǎng)鏈進(jìn)入活性口袋發(fā)生催化反應(yīng).而與3-oxo-C6-AHL結(jié)合的Loop8區(qū)域因運(yùn)動(dòng)幅度較小而不利于短鏈內(nèi)酯進(jìn)入活性口袋，因此長(zhǎng)鏈內(nèi)酯比短鏈內(nèi)酯更易結(jié)合于VmoLac的活性口袋區(qū)域而發(fā)生催化反應(yīng).

VmoLac/γ-nonalacton和VmoLac/ethyl-paraoxon復(fù)合物中底物結(jié)合對(duì)蛋白質(zhì)殘基之間相互影響的分析如圖8（C）和（D）所示.與前者相比，后者的Loop8區(qū)域在互相關(guān)系矩陣圖中表現(xiàn)為正相關(guān)性較低，在動(dòng)力學(xué)模擬過程中Loop8區(qū)域運(yùn)動(dòng)不明顯.分析原理與上兩個(gè)復(fù)合物相同，表明壬內(nèi)酯比對(duì)氧磷更易與VmoLac的活性口袋區(qū)域結(jié)合而促進(jìn)催化反應(yīng)發(fā)生.與結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性分析的結(jié)果一致.

Fig.8 Dynamical cross-correlation map for the 100 ns MD simulation trajectories of the Vmo Lac/3-oxo-C10-AHL(A),Vmo Lac/3-oxo-C6-AHL(B),Vmo Lac/γ-nonalacton(C)and Vmo Lac/ethyl-paraoxon(D)complexes

2.5 Vmo Lac對(duì)非特異性底物催化活性的理論分析

VmoLac中的W264是底物結(jié)合口袋附近的重要?dú)埢?，?dāng)活性中心的金屬離子使溶劑的水分子去質(zhì)子化時(shí)，會(huì)生成氫氧根離子，這時(shí)W264能與生成的氫氧根離子以及β金屬離子發(fā)生橋連而產(chǎn)生相互作用，有利于氫氧根離子的親核進(jìn)攻.Y230是影響底物與VmoLac結(jié)合的重要?dú)埢?W264和Y230都位于酶的活性口袋中心的入口附近，可認(rèn)為是底物進(jìn)入酶的活性口袋的門控殘基，因此在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中這兩個(gè)重要?dú)埢臉?gòu)象重構(gòu)或者位置重排都將會(huì)引起它們之間的距離變化，此變化會(huì)改變酶的活性中心口袋的入口處的大小，從而使底物進(jìn)出活性中心口袋受到影響，最終影響非特異性底物的催化活性.因此，對(duì)4個(gè)模擬體系VmoLac/3-oxo-C10-AHL，VmoLac/3-oxo-C6-AHL，VmoLac/γ-nonalacton和VmoLac/ethyl-paraoxon的軌跡計(jì)算了W264和Y230中Cα原子之間的距離隨模擬時(shí)間的變化.圖9（A）展示了W264和Y230以及底物位置的相對(duì)位置示意圖，兩個(gè)殘基中的Cα原子在動(dòng)力學(xué)模擬過程中的距離變化情況如圖9（B）和（C）所示，為了保證結(jié)果的可靠性，對(duì)4個(gè)體系3次平行模擬的W264與Y230之間的距離進(jìn)行重復(fù)計(jì)算，結(jié)果如圖S2（本文支持信息）所示.在VmoLac/3-oxo-C10-AHL中，W264和Y230的Cα原子距離保持在2.1 nm左右，而對(duì)于VmoLac/3-oxo-C6-AHL，此距離明顯小于2.1 nm；VmoLac/γ-nonalacton體系的Cα原子距離明顯大于VmoLac/ethyl-paraoxon體系.兩個(gè)殘基之間的距離小會(huì)對(duì)擬進(jìn)入活性中心口袋的底物產(chǎn)生空間位阻，不利于底物進(jìn)入活性中心口袋，進(jìn)而影響酶的催化活性.所以VmoLac對(duì)長(zhǎng)鏈內(nèi)酯（3-oxo-C10-AHL）催化活性強(qiáng)于短鏈內(nèi)酯（3-oxo-C6-AHL）.同理，γ-nonalacton比ethyl-paraoxon更容易進(jìn)入VmoLac活性中心口袋發(fā)生催化作用.

PLLs水解內(nèi)酯以及對(duì)氧磷的機(jī)理表明，在內(nèi)酯酶中，Y98可與底物內(nèi)酯中的羰基碳或者對(duì)氧磷中的磷原子形成較強(qiáng)的氫鍵相互作用，從而使碳原子表現(xiàn)出更強(qiáng)的親電性質(zhì).所以，Y98與內(nèi)酯環(huán)中的羰基碳或?qū)ρ趿字械牧自又g的距離被定義為底物的進(jìn)攻距離.為了研究VmoLac與4種不同底物結(jié)合時(shí)進(jìn)攻距離在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中的變化，分析了4個(gè)體系在100 ns模擬時(shí)長(zhǎng)內(nèi)Y98與內(nèi)酯環(huán)中的羰基碳（C=O）或者對(duì)氧磷中磷原子中心（P=O）之間距離的變化.圖10（A）和（B）分別給出了Y98與底物親電中心原子中間的3D結(jié)構(gòu)及相對(duì)位置，二者在不同體系中的進(jìn)攻距離變化如圖10（C）和（D）所示，Y98與長(zhǎng)鏈內(nèi)酯3-oxo-C10-AHL的羰基碳之間的距離穩(wěn)定在0.25 nm附近，而與短鏈內(nèi)酯3-oxo-C6-AHL之間的距離約在0.28 nm，明顯大于前者，表明在與VmoLac發(fā)生催化作用時(shí)3-oxo-C10-AHL的進(jìn)攻距離比3-oxo-C6-AHL的小，催化反應(yīng)更易發(fā)生.在VmoLac/γ-nonalacton和VmoLac/ethyl-paraoxon體系中，通過比較兩個(gè)體系Y98與底物親電中心原子（內(nèi)酯環(huán)的羰基碳或?qū)ρ趿字械牧自樱┲g距離可知，VmoLac/ethyl-paraoxon復(fù)合物的進(jìn)攻距離較大，所以VmoLac催化對(duì)氧磷的活性較弱，而內(nèi)酯的進(jìn)攻距離較小.綜上，內(nèi)酯比對(duì)氧磷更適合作為VmoLac的底物，同時(shí)長(zhǎng)鏈內(nèi)酯比短鏈內(nèi)酯更適合與VmoLac發(fā)生催化反應(yīng).

Fig.9 3D structure of residues W264 and Y230(A)and distance between the Cαof W264 and Y230 for Vmo Lac/3-oxo-C10-AHL and Vmo Lac/3-oxo-C6-AHL(B),Vmo Lac/γ-nonalacton and Vmo Lac/ethyl-paraoxon(C)during 100 ns MD simulations

Fig.10 3D structures of Y98 and 3-oxo-C10-AHL,3-oxo-C6-AHL(A),the position of Y98 andγ-nonalacton,ethyl-paraoxon(B),the distance between the Y98 and electrophilic central atom of the substrate for Vmo Lac/3-oxo-C10-AHL and Vmo Lac/3-oxo-C6-AHL(C),Vmo Lac/γ-nonalacton and Vmo Lac/ethyl-paraoxon(D)during 100 ns MD simulations

VmoLac中的殘基D257可與極化的水分子形成氫鍵，通過雙金屬離子的橋連作用對(duì)內(nèi)酯環(huán)中的羰基碳和對(duì)氧磷中的磷原子發(fā)生親核進(jìn)攻反應(yīng)，從而促進(jìn)催化反應(yīng)的激活.為了研究4個(gè)復(fù)合物在分子動(dòng)力學(xué)模擬過程中底物與VmoLac之間結(jié)合能力的差異，用VMD1.9.1的氫鍵分析插件計(jì)算了在100 ns時(shí)長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)模擬期間D257與極化水分子以及不同底物之間氫鍵的形成幾率.VmoLac/3-oxo-C10-AHL和VmoLac/3-oxo-C6-AHL體系中氫鍵形成幾率列于表2，可以看到，在VmoLac/3-oxo-C10-AHL體系中，D257與極化水之間形成的氫鍵幾率大于VmoLac/3-oxo-C6-AHL體系.其中，前者D257中的O原子與水分子中的O原子形成氫鍵的幾率為83.21%，后者則僅為69.25%.說明相對(duì)于VmoLac/3-oxo-C6-AHL，在VmoLac/3-oxo-C10-AHL復(fù)合物中，D257可以與水分子形成了更強(qiáng)的氫鍵，即對(duì)3-oxo-C10-AHL的羰基碳具有更強(qiáng)的親核進(jìn)攻作用，所以VmoLac水解3-oxo-C10-AHL的能力更強(qiáng).通過比較兩種復(fù)合物中D257與底物形成氫鍵的幾率，可以看出D257與3-oxo-C10-AHL之間氫鍵形成幾率約為30%～50%，然而與3-oxo-C6-AHL之間形成氫鍵的幾率不到20%.由此可見，長(zhǎng)鏈內(nèi)酯比短鏈內(nèi)酯底物與VmoLac之間的結(jié)合能力更強(qiáng).

Table 2 Hydrogen bond probability between Asp257 and polarized water molecules/3-oxo-C10-AHL/3-oxo-C6-AHL

表3比較了VmoLac/γ-nonalacton和VmoLac/ethyl-paraoxon體系中氫鍵形成幾率的差異.其分析原理同表2，對(duì)于VmoLac/γ-nonalacton復(fù)合物，D257可以與水分子形成更強(qiáng)的氫鍵作用，即對(duì)γ-nonalacton的羰基碳具有更強(qiáng)的親核進(jìn)攻作用，而對(duì)于VmoLac/ethyl-paraoxon體系，paraoxon的磷原子親核進(jìn)攻作用較弱.所以VmoLac水解γ-nonalacton的能力更強(qiáng).通過比較兩種復(fù)合物中D257與底物之間形成氫鍵幾率的分析，可以看出壬內(nèi)酯比對(duì)氧磷底物與VmoLac之間的結(jié)合能力更強(qiáng)，內(nèi)酯比對(duì)氧磷更適合作為VmoLac的底物.

Table 3 Hydrogen bond probability between Asp257 and polarized water molecules/γ-nonalacton/ethyl-paraoxon

3 結(jié) 論

通過對(duì)4種蛋白質(zhì)復(fù)合物VmoLac/3-oxo-C10-AHL，VmoLac/3-oxo-C6-AHL，VmoLac/γ-nonalacton，VmoLac/ethyl-paraoxon進(jìn)行分子動(dòng)力學(xué)模擬，比較了VmoLac催化水解長(zhǎng)鏈內(nèi)酯、短鏈內(nèi)酯、壬內(nèi)酯以及對(duì)氧磷的能力.結(jié)果表明，在VmoLac/3-oxo-C10-AHL和VmoLac/γ-nonalacton體系中，活性口袋附近的Loop8結(jié)構(gòu)域運(yùn)動(dòng)明顯，更加柔性的構(gòu)象使底物更加容易靠近Loop8疏水通道外側(cè).Y98與長(zhǎng)鏈內(nèi)酯的羰基碳之間形成的進(jìn)攻距離小于短鏈內(nèi)酯與其形成的距離，并且與壬內(nèi)酯的羰基碳之間的距離小于與對(duì)氧磷的磷原子之間形成的距離，短的距離更有利于發(fā)生親核進(jìn)攻反應(yīng).D257是引發(fā)VmoLac催化反應(yīng)的關(guān)鍵殘基，其可與VmoLac/3-oxo-C10-AHL和VmoLac/γ-nonalacton體系的極化水以及底物形成更多的氫鍵，使底物與酶更容易結(jié)合.從理論角度解釋了VmoLac催化長(zhǎng)鏈內(nèi)酯比短鏈內(nèi)酯的能力強(qiáng)，催化內(nèi)酯比對(duì)氧磷能力強(qiáng)的原因.所得結(jié)果為研究VmoLac與其4種非特異性底物的相互作用提供了新的思路．

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210136.