紙質(zhì)空心金納米籠SERS傳感器的制備及對非小細(xì)胞肺癌患者痰液中miRNAs的快速高靈敏檢測

薛 謹(jǐn)，曹小衛(wèi)，劉依帆，王 敏

（1.揚州大學(xué)廣陵學(xué)院,揚州 225001；2.揚州大學(xué)醫(yī)學(xué)院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心,揚州 225001；3.大連醫(yī)科大學(xué)第一臨床學(xué)院,大連 116000）

微小RNA（miRNAs）是近年來發(fā)現(xiàn)的一類長約19～22個核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，通過特異性降解miRNAs或抑制蛋白翻譯來調(diào)控靶基因表達(dá)，在腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和凋亡中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，可以作為惡性腫瘤的診斷標(biāo)志物及靶向治療基因［1～3］.非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）患者的遠(yuǎn)期生存時間短，臨床結(jié)局較差［4，5］.miRNAs的發(fā)現(xiàn)和研究是近年來NSCLC研究中的熱點，具有重要的臨床價值.2004年，Takamizawa等［6］首次揭示了miRNAs表達(dá)與肺癌的相關(guān)性.Guerriero等［7］發(fā)現(xiàn)miR-196a通過調(diào)控CDKN1B和HOXA9基因，激活PI3K/Akt通路，從而介導(dǎo)細(xì)胞增殖、遷移和致瘤性的活動.Zhang等［8］發(fā)現(xiàn)miR-125a-3p可通過下調(diào)MTA1基因抑制肺癌細(xì)胞的增殖、遷移和入侵.Wang等［9］通過qRT-RCR方法檢測NSCLC患者與健康對照組血液中miR-125a-5p，miR-145和miR-146a的表達(dá)，診斷NSCLC的敏感性和特異性分別為73.53%，55.71%；92.75%，61.43%和84.06%，58.57%.Razzak等［10］收集了21例早期、22例晚期NSCLC患者和10例健康對照的痰液，評估痰液中miR-21，miR-210和miR-372對NSCLC的診斷效果，結(jié)果表明這3種miRNAs聯(lián)合診斷NSCLC的靈敏度達(dá)67%，特異度達(dá)90%.

研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs在血液、痰液和尿液樣本中穩(wěn)定存在，可作為潛在的非侵入性生物標(biāo)志物［11］.相對于肺癌組織中的miRNAs，檢測外周全血、血清及痰液中的miRNAs更簡便且創(chuàng)傷小甚至無創(chuàng)，可能用于NSCLC的早期診斷.鑒于miRNAs在NSCLC早期患者外周血和痰液中表達(dá)量極少且具有同源性的特點，因此篩選技術(shù)需具備很高的靈敏度和特異性.Northern雜交、原位雜交、實時定量PCR和微陣列技術(shù)等傳統(tǒng)檢測方法復(fù)雜、耗時、靈敏度低，難以滿足生物樣品檢測的需要.因此，急需研發(fā)一種操作簡單、靈敏度高、重復(fù)性好和特異性強的miRNAs檢測技術(shù).

表面增強拉曼散射（SERS）技術(shù)是研究化合物分子受光照射后所產(chǎn)生散射光與入射光的能量差與化合物振動、轉(zhuǎn)動頻率間關(guān)系的分析方法.SERS能夠從分子水平反映組織生化的細(xì)微變化，具有微創(chuàng)、快速和精細(xì)如“指紋”的分辨能力［12，13］.SERS還具有光譜線窄、不易猝滅、不受背景熒光干擾等特點［14～16］.物質(zhì)的拉曼光譜不僅可以提供化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和物理狀態(tài)等信息，而且能用于定量或半定量分析.基于貴金屬納米基底的精巧設(shè)計和制備，SERS日益成為一種重要的檢測工具.空心金納米籠（HGNCs）是一種中空、多孔的新型納米材料，具有優(yōu)異的光學(xué)性能［17］.通過對空心金納米籠尺寸和開孔率的精確制備，可實現(xiàn)其表面等離子體激元共振（LSPR）峰位置從可見光區(qū)到近紅外區(qū)的調(diào)變.在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，空心金納米籠的LSPR峰對周圍環(huán)境（包括溶劑、吸附物質(zhì)和顆粒之間的距離）介電性質(zhì)變化的敏感度明顯高于金納米顆粒［18～20］.HGNCs的8個頂點可以作為“熱點”，表面的孔狀結(jié)構(gòu)也顯著增加了其作為表面增強拉曼散射及基底的“熱點”，加之其內(nèi)外表面疊加的等離子激元共振所導(dǎo)致的電磁場增強作用，使HGNCs具有優(yōu)異的SERS性能，有望實現(xiàn)單分子檢測［21］.

相對于傳統(tǒng)的硅片、導(dǎo)電玻璃、銅網(wǎng)等傳統(tǒng)基底，紙質(zhì)基底具有可再生、廉價、生物相容性高、無毒及可降解等優(yōu)點，并且易吸附待測液體，通過毛細(xì)作用使液體矢量流動，而不需要提供額外動力.濾紙可塑造性強，容易加工，可被切割、折疊和堆疊等，將金屬納米材料均勻吸附到普通濾紙上，即有足夠的“熱點”實現(xiàn)腫瘤標(biāo)記物的快速拉曼檢測［21］.因此，柔性紙質(zhì)SERS基底在痕量分析領(lǐng)域?qū)⒕哂懈蟮膽?yīng)用潛力.

痰液是肺泡、支氣管和氣管的分泌物，痰液中異常表達(dá)的miRNAs檢測對肺癌早期診斷具有重要參考價值.本研究以NSCLC患者痰液中相關(guān)標(biāo)志物miR-196a和miR-21為研究對象，將柔性紙質(zhì)SERS基底和發(fā)卡結(jié)構(gòu)檢測模型相結(jié)合，通過簡單的一步配對雜化反應(yīng)，實現(xiàn)了快速、高靈敏和同步檢測2種miRNAs.如圖1所示，首先合成了空心金納米籠；然后利用界面自組裝方法在油水兩相界面形成單層納米膜，將其轉(zhuǎn)移至濾紙表面制備紙質(zhì)基底；最后將與目標(biāo)miRNAs互補且拉曼信號分子標(biāo)記的發(fā)夾結(jié)構(gòu)DNA序列（hpDNA）修飾到紙質(zhì)基底表面，構(gòu)建了一種新型SERS傳感器.初始狀態(tài)下，拉曼信號分子Cy5和5-FAM距離基底表面非常近，在激光照射下二者可以被增強而檢測到非常強的SERS信號.當(dāng)目標(biāo)與hpDNA結(jié)合時，hpDNA莖干區(qū)解離，環(huán)狀區(qū)結(jié)構(gòu)打開，導(dǎo)致拉曼信號分子遠(yuǎn)離基底表面，SERS信號減弱.根據(jù)Cy5和5-FAM特征峰強度的減弱程度即可同時對NSCLC患者痰液中miR-196a和miR-21進(jìn)行定量檢測.

Fig.1 Preparation process of filte

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

氯金酸（HAuCl4·4H2O）、硝酸銀（AgNO3）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP，k30）、抗壞血酸（AA）、二硫代蘇糖醇（DTT）、乙醇（CH3CH2OH）、聚乙二醇［HO（CH2CH2O）nH］、Cy5、5-羧基熒光素（5-FAM）、十六烷基丁二酸酐（HDSA）和過濾紙均購于國藥集團化學(xué)試劑有限公司.miR-21和miR-196a及其hpDNA鏈、單堿基錯配（MT1）和三堿基錯配（MT3）購自上海生物工程有限公司，序列列于表1.實時定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)（qRT-PCR）試劑盒購自新海基因生物科技有限公司.實驗用水均為超純水，所用試劑均為分析純.

Table 1 Sequences of oligonucleotides used in the experiment

UV-3000PC型紫外-可見光分光光度計（上海美譜達(dá)公司）；S-4800Ⅱ型場發(fā)射掃描電子顯微鏡（日本日立公司）；CM100型透射電子顯微鏡（荷蘭Philips公司）；Tecnai G2 F30S-TWIN型場發(fā)射透射電子顯微鏡（美國FEI公司）；MFP-3D-Origin型原子力顯微鏡（英國Oxford儀器公司）；Renishaw inVia型激光共焦拉曼光譜儀（英國Renishaw公司）；DXRxi型顯微拉曼成像光譜儀（美國Thermofisher公司）.

1.2 實驗方法

1.2.1 痰液標(biāo)本的采集與處理 實驗中使用的痰液樣本由揚州大學(xué)臨床醫(yī)院提供，樣本提供者均簽署知情同意書.采集NSCLC患者（男性20人，女性10人，平均年齡36歲）痰液樣本30份，均于入院后治療前收集清晨漱口后所咳深部痰液（分次采集），共10 mL；采集健康體檢者（男性17人，女性13人，平均年齡31歲）痰液樣本30份，每份10 mL，均于門診留取.采用改良Saccomanno法［22］收集痰液，在集痰管內(nèi)事先放入痰固定液10 mL（主要含有50%乙醇和2%聚乙二醇）.痰留至足量后加入等體積的0.1%DTT溶液，反復(fù)顛倒混合均勻至痰液稀釋、痰栓消失；將樣本用200目銅網(wǎng)過濾后，以1000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，小心并徹底吸去上層清液，將沉淀物保存于4℃冰箱中待測.

1.2.2 空心金納米籠的合成 將90μL氯金酸溶液（25 mmol/L）加入至20 mL超純水中，以750 r/min轉(zhuǎn)速攪拌5 min后，加入340μL AgNO3（6 mmol/L），形成乳白色溶液；繼續(xù)攪拌5 min后，向反應(yīng)溶液中加入80μL AA（0.1 mol/L），攪拌至溶液變成藍(lán)色表明反應(yīng)完全，即得到空心金納米籠.

1.2.3 柔性紙質(zhì)SERS基底的組裝 將10 mL新合成的空心金納米籠溶液加入至40 mL PVP溶液（0.01 mg/mL）中，攪拌15 min后，以7000 r/min轉(zhuǎn)速離心2次；將沉淀加入至10 mL去離子水中，超聲混合均勻.在小燒杯中加入4 mL環(huán)己烷和2 mL空心金納米籠溶液，隨后逐滴加入2 mL乙醇，靜置15 min，在油-水兩相界面處自組裝形成有金屬光澤的納米薄膜.使用移液槍取1 mL金納米膜，緩慢滴加到濾紙上，形成致密的單層納米膜，于室溫下干燥，備用.

1.2.4 SERS傳感器的制備 將hpDNA鏈置于95°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 min后，在冰水中連續(xù)反應(yīng)20 min，活化發(fā)夾結(jié)構(gòu)hpDNA序列.取活化后的hpDNA滴加到柔性紙質(zhì)基底表面，置于溫度25℃、濕度80%的恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 h后，用PBS溶液清洗2次.最后，將SERS基底浸入1%BSA溶液中以消除非特異性吸附作用，制得hpDNA修飾的SERS傳感器.

1.3 測試與表征

1.3.1 場發(fā)射掃描電子顯微鏡（SEM）測試 將空心金納米籠滴加在硅片上，晾干后負(fù)載到粘有導(dǎo)電膠的樣品臺上，利用掃描電子顯微鏡（SEM）對樣品的尺寸和形貌分布進(jìn)行表征，加速電壓為15 kV.

1.3.2 透射電子顯微鏡（TEM）測試 將新制備的空心金納米籠滴加在銅網(wǎng)上，晾干后采用TEM與高分辨透射電子顯微鏡（HRTEM）觀察空心金納米籠的形貌，加速電壓為200 kV.

1.3.3 原子力顯微鏡（AFM）測試 將通過油水界面自組裝法形成的單層納米膜轉(zhuǎn)移至硅片上，晾干后用AFM表征樣品的表面形貌.AFM使用長臂探針將待測表面的高低起伏轉(zhuǎn)換成探針的振動，再通過處理激光照射探針?biāo)瓷湫盘柕淖兓瘉硎占砻娓叨葦?shù)據(jù).

1.3.4 SERS測試 向上述SERS傳感器表面滴加含有目標(biāo)miRNA的樣本溶液，于37°C、濕度80%條件下共孵育2 h，確保hpDNA與目標(biāo)miRNA充分雜交；然后用超純水洗滌2次，置于拉曼顯微鏡下測試.SERS測試參數(shù)：激光激發(fā)波長785 nm，掃描范圍400～1800 cm-1，物鏡放大倍數(shù)50×，激光功率60 mW，聚焦光斑直徑1 mm，曝光時間10 s.

1.3.5 時域有限差分（FDTD）模擬 電磁場模擬采用FDTD 8.11軟件進(jìn)行，模擬過程主要包括創(chuàng)建模型、定義仿真區(qū)域、設(shè)置光源和監(jiān)視器等步驟，最后得到納米粒子周圍的電磁場分布情況.

2 結(jié)果與討論

2.1 HGNCs的表征

通過TEM和SEM表征了HGNCs的形貌和結(jié)構(gòu).如圖2（A）所示，HGNCs由空心立方體組成，其邊長約為60 nm，壁厚為12.5 nm.圖2（B）表明制備了大量且粒徑均勻的側(cè)壁多孔HGNCs.通過HRTEM和SAED圖像能夠觀察到HGNCs的晶體結(jié)構(gòu).由圖2（C）可見，晶格間距分別為0.234 nm和0.212 nm的2個晶格條紋分別對應(yīng)于（111）和（200）平面.單個HGNC的SAED圖像表明，HGNCs具有多晶性質(zhì).圖2（D）中的衍射環(huán)分別代表HGNCs晶體的（111），（200），（220）和（311）平面［23］.圖2（E）和（F）中EDS成像示出了HGNCs元素分布情況，發(fā)現(xiàn)HGNCs主要由金元素組成，并含有少量的銀元素，金元素和銀元素都均勻地分布在HGNCs結(jié)構(gòu)中.與HGNCs內(nèi)部相比，金元素和銀元素在外壁上的信號明顯增加，表明HGNCs具有中空結(jié)構(gòu).圖2（G）為HGNCs的UV-Vis-NIR吸收光譜，可見，HGNCs在675 nm處具有很強的吸收峰［24］.圖2（H）為Cy5和5-FAM及標(biāo)記HGNCs的拉曼光譜.1174和1597 cm-1處的特征峰分別歸屬為5-FAM和Cy5.與拉曼信號分子微弱的信號相比，拉曼信號分子標(biāo)記HGNCs的SERS信號明顯增強.通過以下公式計算HGNCs的增強因子（AEF）：AEF=（ISERS/cSERS）/（IRS/cRS）［25］［式中：ISERS為HGNCs在一定濃度（cSERS）下獲得的SERS信號強度；IRS是在非SERS條件及一定濃度（cRS）下獲得的拉曼信號強度］.在實驗過程中，向相同體積的HGNCs溶液中加入相同體積的5-FAM（2×10-6mol/L）和Cy5（2×10-6mol/L）溶液，以獲得最終濃度為10-6mol/L的混合溶液.經(jīng)過計算，5-FAM的AEF值為6.82×105，Cy5的AEF值為5.35×105.此外，進(jìn)一步計算了單層HGNCs陣列的AEF值，得出5-FAM的AEF值為2.86×106，Cy5的AEF值為2.19×106.單層HGNCs陣列的AEF值比HGNCs溶液的增加了1個數(shù)量級，說明HGNCs陣列具備良好的SERS增強效應(yīng).

Fig.2 Characterization of HGNCs(A)TEM image;(B)SEM image;(C)high resolution TEM image;(D)SAED pattern;EDS images of Au(E)and Ag(F)element;(G)UV-Vis-NIR absorption spectrum of HGNCs;(H)Raman spectra of Raman reporters and Raman reporters labeled HGNCs.

2.2 單層HGNCs陣列的FDTD模擬

為了研究HGNCs陣列的SERS增強效果，利用FDTD軟件模擬了其空間電磁場分布.電磁場強度分布模擬是在X-Y平面上使用785 nm入射光進(jìn)行的，SERS強度大致等于電磁場強度的4次方［EF=（E/E0）4］.圖3（A）為單層HGNCs陣列的SEM照片，圖3（C）為單層HGNCs陣列的SEM截面圖.可見，HGNCs均勻平鋪在濾紙表面，HGNCs之間間隙約為0.34 nm.由于單層HGNCs陣列的周期性，選取了5×5的HGNCs作為仿真模型.圖3（B）和（D）示出了HGNCs的局部模擬電磁場分布.在單層HGNCs陣列上，電磁場強度分布不均勻，最強的區(qū)域位于納米粒子的銜接點和連接處.這些間隙的電場強度遠(yuǎn)高于單個HGNC周圍的電磁場強度，這是由于大量的自由電子聚集在HGNCs之間，導(dǎo)致HGNCs間隙處的增強電磁場遠(yuǎn)高于其它區(qū)域.單層HGNCs陣列不僅提高了熱點的強度，也提升了熱點的密度，在SERS效應(yīng)中起到積極作用.

Fig.3 FDTD simulation of HGNCs(A)SEM image of monolayer HGNCs array;(B)FDTD simulation of monolayer HGNCs array(plane);(C)cross section SEM image of monolayer HGNCs array;(D)FDTD simulation of monolayer HGNCs array(cross section).

2.3 HGNCs基底的表征

HGNCs基底的均一性、靈敏度和穩(wěn)定性是SERS檢測的關(guān)鍵.圖4（A）為HGNCs基底的AFM形貌照片及SEM照片，可見，HGNCs分布均勻，平均高度為62.3 nm.為了探究HGNCs基底的均一性，將5-FAM和Cy5混合溶液（10-6mol/L）吸附在HGNCs基底表面，然后隨機選取1個面積為50μm×50μm的區(qū)域，以1597 cm-1處的特征峰強度進(jìn)行SERS成像.如圖4（B）所示，從藍(lán)色（最小強度）到綠色、黃色、橙色和紅色（最大強度）的配色方案顯示了每個點上1597 cm-1處特征峰的信號強度，可見整個圖像呈現(xiàn)較為均一的綠色，僅有少量聚集物，表明HGNCs基底具有良好的均一性.

在優(yōu)化的實驗條件下，評估了HGNCs基底的靈敏度.如圖4（C）所示，隨著5-FAM和Cy5混合溶液的濃度從10-4mol/L降低到10-10mol/L，SERS信號強度明顯降低.當(dāng)5-FAM和Cy5混合溶液的濃度降低至10-10mol/L時，仍能在SERS光譜上觀察到較明顯的特征峰.圖4（D）示出了1597 cm-1處的特征峰強度與Cy5濃度對數(shù)之間的線性關(guān)系.在Cy5濃度為10-4～10-10mol/L范圍內(nèi)，特征峰的強度與Cy5濃度的對數(shù)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=2252.402x+23414.023，相關(guān)系數(shù)R2=0.993.這表明HGNCs基底具有良好的SERS靈敏度，對Cy5的檢出限（LOD）達(dá)到4.623×10-11mol/L.

為了研究HGNCs基底的穩(wěn)定性，將該基底在4℃環(huán)境中放置1 d，7 d和14 d，并進(jìn)行SERS檢測.如圖4（E）所示，SERS光譜的波形和強度均無明顯差異.由圖4（F）可見，以Cy5在1597 cm-1處特征峰的信號強度為例，存儲了14 d的HGNCs基底SERS信號強度與存儲1 d相比僅下降至92.138%，說明HGNCs基底具有良好的穩(wěn)定性.

Fig.4 Characterization of HGNCs array substrates(A)SEM and AFM images of HGNCs substrate;(B)SERS mapping of Cy5 at 1597 cm-1;(C)SERS spectra of substrate at different concentrations of 5-FAM and Cy5(10-4—10-10 mol/L);(D)relationship between SERS intensity and logarithm of Cy5 concentration at 1597 cm-1;(E)SERS spectra of HGNCs substrate after 1,7 and 14 d;(F)broken line of SERS signal intensity at 1597 cm-1.

2.4 實驗條件優(yōu)化

hpDNA組裝時間決定了其在HGNCs表面的組裝量.圖5（A）將1174 cm-1處的特征峰強度設(shè)為時間的函數(shù)，當(dāng)時間小于90 min時，1174 cm-1處的特征峰強度幾乎隨時間線性增加.隨后，上升速度逐漸減慢，在195 min時達(dá)到飽和，表明hpDNA在基底表面的組裝數(shù)量達(dá)到最大值，因此，最佳組裝時間為195 min.同樣的，1597 cm-1處的特征峰強度也在195 min時幾乎達(dá)到飽和［圖5（B）］.SERS傳感器與目標(biāo)miRNA的雜交時間對于后續(xù)SERS分析至關(guān)重要.將待測miRNA溶液點樣到制得的SERS傳感器上，置于37℃恒溫箱中進(jìn)行雜交反應(yīng)；每隔15 min取出傳感器進(jìn)行SERS測試，篩選最佳雜交時間.在測試區(qū)域隨機選擇10個位置進(jìn)行SERS檢測，并獲得平均的SERS光譜.如圖5（C）所示，1174 cm-1處的特征峰強度隨時間增加而降低，最終在120 min時趨于穩(wěn)定.因此，miR-196a與hpDNA的最佳雜交時間為120 min.同樣，在雜交時間為120 min時，固定在基底上的hpDNA與miR-21有良好的雜交活性，并且獲得最小且穩(wěn)定的SERS信號.

2.5 特異性和重現(xiàn)性分析

以隨機序列、單堿基錯配（MT1）序列和三堿基錯配（MT3）序列為干擾物組，研究了SERS傳感器的特異性［圖6（A）］.將等體積的目標(biāo)miRNAs（10 pmol/L）和干擾物（10 pmol/L）混合后進(jìn)行SERS檢測.與干擾物組和空白對照組相比，miR-196a［圖6（B）］和miR-21［圖6（C）］在1174和1597 cm-1處的特征峰強度明顯較低.因此，SERS傳感器能有效區(qū)分特異性生物標(biāo)志物和干擾物，表現(xiàn)出良好的特異性.為了驗證SERS傳感器的重現(xiàn)性，在不同時間制備5個批次SERS傳感器，用于檢測miR-196a和miR-21的混合溶液.圖6（D）顯示這些SERS光譜無明顯差異.圖6（E）和（F）分別示出了1174處和1597 cm-1處的特征峰強度，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）分別為7.553%和6.396%，表明SERS傳感器具有良好的分析重現(xiàn)性.

Fig.6 Characterization of selectivity and reproducibility(A)SERS spectra of specific detection;peak statistics of corresponding characteristic peaks of 1174 cm-1(B)and 1597 cm-1(C);(D)SERS spectra of reproducibility detection;peak statistics of corresponding characteristic peaks of 1174 cm-1(E)and 1597 cm-1(F).(B)a.MT1,b.MT3,c.random,d.blank,e.miR-196a-5p;(C)a.MT1,b.MT3,c.random,d.blank,e.miR-125a-5p.

2.6 痰液樣本中miR-196a和miR-21的檢測

將miR-196a和miR-21分散到痰液中，配制濃度分別為1 fmol/L，10 fmol/L，100 fmol/L，1 pmol/L，10 pmol/L和100 pmol/L的miRNAs混合溶液.將SERS傳感器與不同濃度的miRNAs溶液在37℃恒溫箱中雜交反應(yīng)120 min，取出傳感器用PBS緩沖液沖洗，進(jìn)行SERS測試.根據(jù)Cy5和5-FAM在1174和1597 cm-1處的特征信號繪制miR-196a和miR-21與SERS信號強度變化量的工作曲線.如圖7（A）所示，隨著miR-196a和miR-21濃度的降低，SERS光譜強度逐漸增強.以miR-196a濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，以1174 cm-1處的特征峰信號強度為縱坐標(biāo)，得到對數(shù)坐標(biāo)下的濃度-強度曲線［圖7（B）］.在濃度為100.00 amol/L～100.00 pmol/L范圍內(nèi)，SERS信號強度與miR-196a濃度對數(shù)呈線性關(guān)系.線性回歸方程為y=-1854.949x-17045.055（R2=0.988）.同樣，miR-21濃度的對數(shù)與SERS信號強度之間的變化趨勢遵循線性回歸方程y=-1601.411x-13679.324（R2=0.984）［圖7（C）］.通過計算得出SERS傳感器對痰液樣本中miR-196a和miR-21的檢出限分別為10.00 amol/L和36.15 amol/L.如表2所示，紙質(zhì)空心金納米籠SERS傳感器的靈敏度明顯優(yōu)于其它miRNA檢測方法；同時，檢測時間也短于多數(shù)檢測方法.上述結(jié)果表明，SERS傳感器可以定量分析痰液中痕量miR-196a和miR-21，滿足臨床診斷的實際需要，實現(xiàn)快速和高靈敏檢測.

Fig.7 Quantitative determinations of miR-196a and miR-21(A)SERS spectra miR-196a and miR-21 with different concentrations in sputum samples;(B)calibration curve between characteristic peak intensity at 1174 cm-1 and logarithm of miR-196a concentration;(C)calibration curve between characteristic peak intensity at 1334 cm-1 and logarithm of miR-21 concentration.

Table 2 Comparisons of the paper HGNCs SERS sensor with the previously reported methods

2.7 SERS傳感器的準(zhǔn)確性評價

為探究SERS傳感器的準(zhǔn)確性和臨床應(yīng)用價值，利用其檢測了健康人和NSCLC患者痰液中2種miRNAs的水平.圖8（A）為30例健康人和30例NSCLC患者痰液中miR-196a和miR-21的平均SERS光譜，可以看出肺癌患者痰液樣本的SERS信號強度明顯低于健康人.將1174和1597 cm-1處的特征峰強度［圖7（B）和（C）］分別代入線性回歸方程，計算得到miR-196a和miR-21的濃度［圖8（B）和（C）］.為評估SERS檢測結(jié)果，利用SPSS 21.0軟件，采用配對t檢驗對SERS和qRT-PCR檢測結(jié)果進(jìn)行了比較，結(jié)果間無統(tǒng)計學(xué)差異，加之兩者RSD值均＜10%，表明2種檢測方法的檢測結(jié)果一致，SERS檢測方法具有可靠性（詳見表3）.因此，SERS和qRT-PCR方法對各組臨床痰液的檢測結(jié)果具有一致性，表明SERS傳感器對NSCLC臨床診斷具有良好的準(zhǔn)確性和廣闊的應(yīng)用前景.

Fig.8 Practical samples analysis SERS(A)Spectra of miR-196a and miR-21 in sputum of NSCLC patients and healthy people;expression levels of miR-196a(B)and miR-21(C)in sputum of healthy people and NSCLC patients detected by SERS and qRT-PCR,respectively.

Table 3 Comparisons of miR-196a and miR-21 expression levels in sputum samples detected by SERS and qRT-PCR

3 結(jié) 論

構(gòu)建了一種快速、準(zhǔn)確、靈敏的紙質(zhì)空心金納米籠SERS傳感器，用于檢測NSCLC患者痰液中2種miRNAs標(biāo)志物.通過油水界面自組裝法將粒徑均一的HGNCs組裝到濾紙表面，構(gòu)建單層HGNCs陣列.HGNCs間隙形成大量熱點，使HGNCs陣列基底具有優(yōu)異的SERS增強效應(yīng).基于HGNCs的SERS傳感器具有靈敏度高、特異性好、均一性好和重現(xiàn)性好等優(yōu)點，對miR-196a和miR-21的檢出限分別達(dá)到10.00和36.15 amol/L.利用該SERS傳感器檢測了NSCLC患者和健康人痰液中miR-196a和miR-21，結(jié)果表明，NSCLC患者痰液中miR-196a和miR-21的表達(dá)水平顯著性高于健康人，與qRT-PCR方法檢測結(jié)果一致.因此，紙質(zhì)空心金納米籠SERS傳感器可作為監(jiān)測臨床樣本中miRNAs生物標(biāo)志物的有力工具，在NSCLC的診斷和治療中具有潛在應(yīng)用價值.