N-草酰基-D-苯丙氨酸對(duì)小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用

唐海 康 孟媛媛 孟鑫 龍偉 周曉靚 徐文清

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津市放射醫(yī)學(xué)與分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 300192

造血系統(tǒng)包括造血細(xì)胞、造血微環(huán)境（又稱為造血干細(xì)胞龕）和造血刺激因子，其對(duì)電離輻射非常敏感。電離輻射主要破壞或抑制造血細(xì)胞的增殖能力，而骨髓抑制是造血系統(tǒng)輻射損傷的主要表現(xiàn)。造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）具有自我更新、增殖和分化生成全血細(xì)胞的功能，其受損傷后將引起骨髓持久性抑制，甚至造成個(gè)體死亡[1]。大量研究結(jié)果表明，HSC 儲(chǔ)存在造血干細(xì)胞龕中[2]。哺乳動(dòng)物HSC 在骨髓乏氧區(qū)骨內(nèi)膜龕中保持靜止?fàn)顟B(tài)[3]。正常HSC 能夠保持細(xì)胞內(nèi)低氧濃度并穩(wěn)定表達(dá)低氧誘導(dǎo)因子（hypoxia-inducible factor，HIF）。在缺少HIF-1α 的小鼠中，HSC 退出細(xì)胞循環(huán)的靜止期，在骨髓移植、骨髓抑制等情況下HSC數(shù)量明顯降低[4-5]。提高HIF-1α 的表達(dá)水平，可以提高HSC 的歸巢和移植再生能力[6-7]。

HIF 是一種在低氧濃度下被激活的轉(zhuǎn)錄因子，由α 亞基和β 亞基構(gòu)成。HIF-1α 的轉(zhuǎn)錄活性受環(huán)境氧濃度的調(diào)節(jié)。低氧誘導(dǎo)因子抑制因子（factor inhibiting hypoxia-inducible factor，F(xiàn)IH）又名天冬酰胺酰羥化酶，是體內(nèi)調(diào)節(jié)HIF-1α 轉(zhuǎn)錄活性的主要因子。在正常氧濃度下，F(xiàn)IH 通過(guò)使HIF-1α 的C 末端反式激活結(jié)構(gòu)域內(nèi)第803 位的天冬氨酸殘基羥基化，阻止HIF-1α 與轉(zhuǎn)錄輔助激活因子CBP/P300 結(jié)合，從而抑制HIF-1α 的轉(zhuǎn)錄激活；在低氧濃度下，F(xiàn)IH的活性降低，激活HIF-1α 的轉(zhuǎn)錄活性，啟動(dòng)低氧應(yīng)激調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[4-6]。研究結(jié)果表明，提高HIF-1α 蛋白的穩(wěn)定性，可以緩解輻射引起的造血系統(tǒng)損傷和胃腸功能障礙，減輕放射性胃腸損傷[5,8-9]。

N-草?；?D-苯丙氨酸（N-oxalyl-D-phenylalanine，NOFD）是FIH 的特異性抑制劑[10]，能提高HIF-1α的轉(zhuǎn)錄活性。我們的前期研究結(jié)果表明，NOFD能夠降低輻射后人結(jié)腸癌細(xì)胞（HCT116）和倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO-K1）的細(xì)胞內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平，減輕輻射引起的DNA 損傷和細(xì)胞凋亡；NOFD 能夠促進(jìn)HCT116 細(xì)胞中HIF-1α調(diào)控的下游基因的表達(dá)，包括促紅細(xì)胞生成素（EPO）、血紅素氧合酶1（HO-1）、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白1（Glut-1）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）、Notch2 和Notch1；體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以5 mg/kg 的劑量腹腔給予NOFD，可以明顯提高輻射損傷小鼠的存活率[11]。本研究旨在系統(tǒng)評(píng)價(jià)NOFD 對(duì)小鼠造血系統(tǒng)輻射損傷的防護(hù)作用，以期為FIH 抑制劑作為新型輻射防護(hù)藥的研發(fā)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

抗小鼠Sca-1-PE、CD117（c-kit）APC、CD3-APC 抗體購(gòu)自美國(guó)eBioscience 公司；Streptavidin-PerCP 抗 體，抗 小 鼠 CD11b-PerCP、Gr1-PerCP、B220-PE、Ter119 抗體，抗小鼠B220、Gr1、CD11b、CD4、CD8、CD11b 抗體均購(gòu)自美國(guó)Biolegend 公司；熒光染料MitoSOX（10 μmol/L）購(gòu)自美國(guó)Life Technologies 公 司；FACSTM裂 解 溶 液、anti-γ-H2AX 抗體（γ-H2AX 為磷酸化組蛋白H2AX）購(gòu)自美國(guó)BD 公司；乙二胺四乙酸二鉀（EDTA）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司。NOFD 由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所輻射防護(hù)與藥物室合成。

Gammacell?40 Exactor137Cs γ 射線照射源購(gòu)自加拿大Best Theratronics 公司，劑量率為0.99 Gy/min；MEK-7222K 全自動(dòng)血液分析儀購(gòu)自日本光電工業(yè)株式會(huì)社；Accuri C6 流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及處理方法

18 只C57BL/6 雄性小鼠，體重20～22 g，6～8周齡，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)為SCXK（京）2016-0011]，飼養(yǎng)在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物中心，在標(biāo)準(zhǔn)條件[溫度（22±2）℃，12 h 光明、12 h 黑暗交替，濕度（50±10）%]下自由飲用無(wú)菌水和進(jìn)食無(wú)特定病原體級(jí)鼠繁殖飼料。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)開展前獲得了中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)：IRM-DWLL-2017109）。所有小鼠飼養(yǎng)1 周適應(yīng)環(huán)境后，按照區(qū)組隨機(jī)法分為3 組：對(duì)照組、4 Gy γ 射線全身照射組（簡(jiǎn)稱照射組）和4 Gy γ 射線全身照射+ 5 mg/kg NOFD 組（簡(jiǎn)稱照射給藥組），每組6 只。照射給藥組于照射前2、16 h 及照射后3 d 分別腹腔給予5 mg/kg NOFD，對(duì)照組和照射組給予等量生理鹽水，給藥時(shí)間和次數(shù)與照射給藥組相同。

1.3 外周血血細(xì)胞和骨髓有核細(xì)胞（bone marrow nucleated cell，BMNC）的計(jì)數(shù)

照射后第9 天脫頸處死小鼠，采集外周血和雙側(cè)股骨。股骨用PBS 沖洗并收集骨髓細(xì)胞，分別置于事先加入乙二胺四乙酸二鉀溶液作抗凝處理的1.5 mL 離心管中，經(jīng)全自動(dòng)血液分析儀測(cè)定并計(jì)數(shù)小鼠外周血血細(xì)胞和BMNC。

1.4 外周血中的B 細(xì)胞、T 細(xì)胞和髓系細(xì)胞的百分比分析

取0.5 mL 外周血加入乙二胺四乙酸二鉀抗凝劑后，在室溫下用B220、CD3-APC、Gr1、CD11b的混合液孵育30 min。用FACSTM裂解溶液除去紅細(xì)胞。用流式細(xì)胞儀檢測(cè)并計(jì)數(shù)B 細(xì)胞、T 細(xì)胞和髓系細(xì)胞，并應(yīng)用Accuri C6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

1.5 造 血 祖 細(xì) 胞（hematopoietic progenitor cell，HPC）（Lineage- Sca1- c-kit+）和HSC（Lineage-Sca1+ c-kit+）的分析及測(cè)定

用PBS 將小鼠骨髓中的骨髓細(xì)胞沖出，過(guò)濾并計(jì)數(shù)后將5×106個(gè)骨髓細(xì)胞與CD11b-PerCP、Gr1-PerCP、B220-PE、Ter119、CD4、CD8 抗體的混合液孵育30 min，用PBS 清洗1 次后棄上清，加入Sca-1-PE、CD117（c-kit）APC、Streptavidin-PerCP與PBS 的混合液4 μL，室溫避光染色20 min，加入1 mL 含2%胎牛血清的PBS，1000 r/min 離心（離心半徑35 cm）5 min 后棄上清，加入300 μL PBS 重懸細(xì)胞，用流式細(xì)胞儀計(jì)數(shù)HPC 和HSC，并應(yīng)用美國(guó)BD 公司Accuri C6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

1.6 骨髓細(xì)胞線粒體ROS 水平的分析

將骨髓細(xì)胞與0.5 μmol/L MitoSOX 在37℃水浴中孵育10 min 后，用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞內(nèi)線粒體ROS 自由基（MitoSOX）的平均熒光強(qiáng)度（median fluorescence intensity，MFI）, 并應(yīng)用Accuri C6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

1.7 骨髓細(xì)胞DNA 損傷程度的分析

在室溫下用anti-γ-H2AX 抗體對(duì)骨髓細(xì)胞進(jìn)行染色孵育1 h，用流式細(xì)胞儀分析各組細(xì)胞的γ-H2AX MFI, 并應(yīng)用Accuri C6 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和分析。

1.8 粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位（colonyforming units-granulocyte-macrophage， CFUGM）實(shí)驗(yàn)

分離小鼠骨髓細(xì)胞，取對(duì)照組1×104個(gè)細(xì)胞，照射組、照射給藥組5×104個(gè)細(xì)胞于M3534 培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d 后進(jìn)行集落形成單位分析，以細(xì)胞數(shù)≥30 個(gè)為陽(yáng)性集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.9 脾集落形成單位（colony-forming units-spleen，CFU-S）實(shí)驗(yàn)

照射后第9 天脫頸處死小鼠并取脾臟，用Bouin 液（飽和苦味酸溶液15 mL、甲醛5 mL、冰醋酸1 mL，混勻即得）固定24 h 后，取肉眼可見的集落進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用GraphPad prism 8 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)以±s表示；在方差齊的條件下，組間兩兩比較采用Studentt檢驗(yàn)。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NOFD 對(duì)輻射損傷小鼠外周血各項(xiàng)指標(biāo)的影響

由圖1 可見，與對(duì)照組相比，照射組小鼠外周血中WBC、血小板和RBC 數(shù)量均明顯減少，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與照射組相比，照射給藥組小鼠外周血中血小板[（234.7±15.81）×106個(gè)/mL 對(duì)（315.5±32.57）×106個(gè)/mL]和RBC 數(shù)量 [（9.05±0.16）×109個(gè)/mL 對(duì)（9.57±0.15）×109個(gè)/mL] 明顯增加，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與對(duì)照組相比，照射組小鼠淋巴細(xì)胞、T 細(xì)胞和B 細(xì)胞的百分比均明顯下降，中性粒細(xì)胞和髓系細(xì)胞的百分比均明顯上升，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與照射組相比，照射給藥組小鼠T 細(xì)胞的百分比[（11.54±0.20）%對(duì)（15.31±1.88）%]明顯升高，髓系細(xì)胞的百分比[（32.67±2.87）%對(duì)（24.90±2.19）%]明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明，NOFD改善了小鼠輻射所致的髓系-淋巴系分化失衡，并使外周血細(xì)胞的數(shù)量得到部分恢復(fù)。

2.2 NOFD 對(duì)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞的影響

由圖2 可見，與對(duì)照組相比，照射組小鼠的BMNC 數(shù)量、HPC 數(shù)量及百分比、HSC 數(shù)量及百分比均明顯降低，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與照射組相比，照射給藥組小鼠的HSC 數(shù)量 及 百 分 比[（2.24±0.54）×103個(gè)/股 骨 對(duì)（6.77±1.67）×103個(gè)/股骨；（0.09±0.02）%對(duì)（0.59±0.13）%]、HPC 百分比[（0.62±0.14）%對(duì)（1.82±0.43）%]均明顯升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明，NOFD 能夠緩解電離輻射對(duì)小鼠骨髓中HSC 和HPC 的損傷，提高HSC 的數(shù)量，使HSC和HPC 在骨髓細(xì)胞中的百分比得到恢復(fù)，維持照射后造血系統(tǒng)的平衡。

2.3 NOFD 對(duì)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞中線粒體ROS水平的影響

由圖3 可見，與對(duì)照組相比，照射組小鼠的BMNC、HPC 中線粒體ROS 自由基（MitoSOX）的MFI 明顯升高，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；與照射組相比，照射給藥組小鼠的BMNC 和HPC 中線粒體ROS 自由基（MitoSOX）的MFI 明顯降低[（6.66±0.56）×103對(duì)（3.19±0.25）×103；（2.51±0.46）×103對(duì)（1.20±0.35）×103]，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明，NOFD能清除骨髓細(xì)胞中線粒體的ROS，減輕輻射所致的損傷。

圖 2 N-草酰基-D-苯丙氨酸對(duì)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞的影響 a 表示與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.503～8.770，均P＜0.05）；b 表示與照射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 2.683、2.581、3.633，均P＜0.05）。對(duì)照組為未照射且不給藥；照射組為4 Gy γ 射線全身照射；照射給藥組為4 Gy γ 射線全身照射+ 5 mg/kg N-草?；?D-苯丙氨酸。BMNC 為骨髓有核細(xì)胞；HSC 為造血干細(xì)胞；HPC 為造血祖細(xì)胞Figure 2 Effects of N-oxalyl-D-phenylalanine on bone marrow cells in irradiated mice

2.4 NOFD 對(duì)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞中DNA 損傷的影響

由圖4 可見，與對(duì)照組相比，照射組小鼠的BMNC、HPC 和HSC 中γ-H2AX 的MFI 明顯增加，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），這表明4 Gy的電離輻射對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞DNA 的損傷較為嚴(yán)重；與照射組相比，照射給藥組小鼠的BMNC、HPC 和HSC 中γ-H2AX 的MFI 明顯降低[（10.25±0.77）×103對(duì)（7.22±0.15）×103；（18.37±2.52）×103對(duì)（12.44±0.34）×103；（26.05±2.64）×103對(duì)（17.16±1.20）×103]，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。以上結(jié)果表明，NOFD 可以減輕輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞中DNA 的雙鏈斷裂。

圖 3 N-草酰基-D-苯丙氨酸對(duì)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞中線粒體活性氧水平的影響 a 表示與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.538、2.331，均 P＜0.05）；b 表示與照射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=6.350、2.282，均 P＜0.05）。對(duì)照組為未照射且不給藥；照射組為4 Gy γ 射線全身照射；照射給藥組為4 Gy γ 射線全身照射+ 5 mg/kg N-草?；?D-苯丙氨酸。BMNC 為骨髓有核細(xì)胞；MitoSOX 為一種熒光染料；MFI 為平均熒光強(qiáng)度；HPC 為造血祖細(xì)胞；HSC 為造血干細(xì)胞Figure 3 Effects of N-oxalyl-D-phenylalanine on the level of mitochondrial reactive oxygen species in bone marrow cells of irradiated mice

圖 4 N-草?；?D-苯丙氨酸對(duì)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞DNA 損傷的影響 a 表示與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=5.964、4.029、3.465，均 P＜0.05）；b 表示與照射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.356、2.577、3.070，均 P＜0.05）。對(duì)照組為未照射且不給藥；照射組為4 Gy γ 射線全身照射；照射給藥組為4 Gy γ 射線全身照射+ 5 mg/kg N-草?；?D-苯丙氨酸。BMNC 為骨髓有核細(xì)胞；γ-H2AX 為磷酸化組蛋白H2AX；MFI：平均熒光強(qiáng)度；HPC 為造血祖細(xì)胞；HSC 為造血干細(xì)胞Figure 4 Effects of N-oxalyl-D-phenylalanine on DNA damage of bone marrow cells in irradiated mice

2.5 NOFD 對(duì)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞增殖能力的影響

由圖5 可見，與對(duì)照組相比，照射組小鼠的骨髓細(xì)胞的CFU-GM 明顯減少，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），這表明4 Gy 照射能明顯降低骨髓細(xì)胞的增殖能力；與照射組相比，照射給藥組小鼠骨髓細(xì)胞的CFU-GM 明顯增多（12.33±1.48 對(duì)24.00±3.92），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。與對(duì)照組相比，照射組小鼠的骨髓細(xì)胞的CFU-S 增加，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與照射組相比，照射給藥組小鼠CFU-S 明顯增加（6.00±1.07 對(duì)10.83±1.01），且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。以上結(jié)果表明，NOFD 可增強(qiáng)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞的增殖能力。

圖 5 N-草?；?D-苯丙氨酸對(duì)輻射損傷小鼠骨髓細(xì)胞的CFU-GM 和CFU-S 的影響 a 表示與對(duì)照組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.193、2.350，均 P＜0.05）；b 表示與照射組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=2.788、3.288，均 P＜0.05）。對(duì)照組為未照射且不給藥；照射組為4 Gy γ 射線全身照射；照射給藥組為4 Gy γ 射線全身照射+ 5 mg/kg N-草酰基-D-苯丙氨酸。CFU-GM 為粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落形成單位；CFU-S 為脾集落形成單位Figure 5 Effects of N-oxalyl-D-phenylalanine on colonyforming units-granulocyte-macrophage and colony-forming unitsspleen in irradiated mice

3 討論

隨著我國(guó)核能應(yīng)用的不斷發(fā)展，放射性同位素和射線檢測(cè)技術(shù)的廣泛應(yīng)用，以及核恐怖威脅的持續(xù)存在，人們暴露在輻射下的風(fēng)險(xiǎn)不斷升高。中高劑量照射引起的骨髓抑制成為輻射致死的主要原因。在腫瘤的臨床治療中，放療的不良反應(yīng)之一即為引起骨髓抑制，進(jìn)而影響患者的治療效果和生活質(zhì)量。因此，臨床上迫切需要使用輻射防護(hù)劑，特別是輻射損傷后的治療藥物，以提高患者輻射損傷的治療效果，滿足輻射損傷人群救治的需要。

HIF 是由Semenza[12]發(fā)現(xiàn)的一類氧敏感性異二聚體蛋白，其對(duì)機(jī)體在低氧濃度下發(fā)生的一系列生理學(xué)改變起著關(guān)鍵性的調(diào)控作用。研究結(jié)果顯示，在組織貧（缺）血和炎癥疾病中，HIF 蛋白的穩(wěn)定表達(dá)對(duì)緩解病情具有重要作用[13]。對(duì)輻射損傷的研究結(jié)果顯示，通過(guò)穩(wěn)定HIF-1α 可以改善輻射造成的造血系統(tǒng)損傷[2]和胃腸功能障礙[8]。

研究結(jié)果顯示，電離輻射可導(dǎo)致造血系統(tǒng)損傷[14-15]，HSC 和HPC 的再生和分化能力受到影響，引起造血細(xì)胞數(shù)量減少及其在骨髓細(xì)胞中的百分比降低，導(dǎo)致外周血中髓系-淋巴系分化的失衡[16]，表現(xiàn)為外周血細(xì)胞及淋巴細(xì)胞減少，髓系細(xì)胞增多。電離輻射還能夠直接導(dǎo)致DNA 損傷或介導(dǎo)ROS 間接損傷DNA，γ-H2AX 是評(píng)估DNA 雙鏈斷裂損傷的一種重要標(biāo)志物。細(xì)胞在受到照射后，ROS 水平會(huì)顯著升高[17]。受到輻射損傷的線粒體的通透性會(huì)發(fā)生改變，并將這一損傷通過(guò)Ca2+傳遞給鄰近的線粒體，導(dǎo)致線粒體內(nèi)ROS 水平升高[18]，因此，線粒體內(nèi)ROS 自由基的清除能力是評(píng)價(jià)輻射防護(hù)效果的重要指標(biāo)。

在本研究中，我們探討了調(diào)控HIF-1α 轉(zhuǎn)錄活性的FIH 抑制劑NOFD 在小鼠輻射損傷中的作用，評(píng)價(jià)其對(duì)輻射誘導(dǎo)的造血系統(tǒng)損傷的防護(hù)效果。結(jié)果顯示，NOFD 能緩解輻射損傷小鼠的骨髓抑制，保護(hù)HSC 和HPC，刺激HSC 增殖，通過(guò)降低骨髓細(xì)胞線粒體中ROS 水平來(lái)減輕DNA 損傷。

然而，目前關(guān)于NOFD 的生物活性及作用機(jī)制的研究報(bào)道并不多見。我們的研究團(tuán)隊(duì)首次發(fā)現(xiàn)了NOFD 具有較好的輻射防護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與其促進(jìn)HIF-1α 的轉(zhuǎn)錄活性和HIF 下游基因，如促紅細(xì)胞生成素（EPO）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）等的表達(dá)有關(guān)[19]。因?yàn)橹亟M促紅細(xì)胞生成素（EPO）被報(bào)道具有明顯的輻射防護(hù)作用[20-22]，而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）可以促進(jìn)缺氧環(huán)境下的血管生成[23]。

FIH 在蛋白-蛋白相互作用過(guò)程中能識(shí)別多個(gè)蛋白底物，F(xiàn)IH 除了調(diào)控HIF-1 通路轉(zhuǎn)錄活性外，F(xiàn)IH 蛋白底物還可富集至核因子κB、Notch 等信號(hào)通路中。FIH 對(duì)Notch 有很高的親和力，可以羥化Notch 的天冬酰胺殘基，影響Notch 途徑的下游靶基因。HIF-1α 和Notch 信號(hào)通路在FIH 處相互聯(lián)系，敲除FIH 可激活Notch 信號(hào)通路。Notch 作為一條高度保守的信號(hào)通路，在細(xì)胞增殖、分化和凋亡過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[24]。研究結(jié)果表明，Notch受體和配體在哺乳動(dòng)物造血系統(tǒng)中廣泛表達(dá)[25]。其中，Notch1 和Notch2 在HSC 中高表達(dá)，Notch 配體在造血微環(huán)境中高表達(dá)。Notch 信號(hào)通路能夠促進(jìn)HSC 的“干性”維持，其靶基因發(fā)狀分裂相關(guān)增強(qiáng)子在HSC 中高表達(dá)[26]。在造血微環(huán)境中高表達(dá)的Notch 配體與HSC 上的Notch 受體直接接觸，激活Notch 信號(hào)通路，平衡HSC 的自我更新和分化，避免HSC 耗竭，促進(jìn)造血重建[27]。我們之前的研究結(jié)果也證實(shí)了NOFD 能夠顯著促進(jìn)Notch mRNA 的表達(dá)[11]。因此，NOFD 發(fā)揮輻射防護(hù)作用的機(jī)制可能與其抑制FIH 激活Notch 信號(hào)通路有關(guān)。

近些年，HIF-1α 與HSC 的輻射損傷、修復(fù)之間的關(guān)系逐漸引起了研究者的廣泛興趣。研究結(jié)果表明，輻射可以導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，異常增多的ROS 可抑制HSC 的自我更新，誘導(dǎo)HSC衰老，同時(shí)又可影響HIF-1α 的轉(zhuǎn)錄活性[28-29]；而上調(diào)HIF-1α 可以降低細(xì)胞中的ROS 水平[30]。由此可見，ROS 與HIF-1α 之間可以相互影響。清除照射產(chǎn)生的ROS 一直是輻射損傷防護(hù)的重要策略。本研究結(jié)果表明，NOFD 能夠降低BMNC 和HPC中線粒體ROS 水平，減輕HSC 的DNA 損傷，增強(qiáng)HSC 的增殖能力，調(diào)節(jié)髓系-淋巴系分化失衡。

綜上，本研究結(jié)果證實(shí)，NOFD 促進(jìn)了輻射損傷小鼠造血系統(tǒng)的恢復(fù)，改善了細(xì)胞內(nèi)的氧化應(yīng)激，發(fā)揮了輻射防護(hù)作用。然而，關(guān)于NOFD 的作用機(jī)制仍有待深入地研究。

利益沖突本研究由署名作者按以下貢獻(xiàn)聲明獨(dú)立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明唐海康負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)、圖表的制作、論文的撰寫與修改；孟媛媛、孟鑫負(fù)責(zé)現(xiàn)場(chǎng)的實(shí)驗(yàn)；龍偉、周曉靚負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析；徐文清負(fù)責(zé)論文的審閱與修改。