血液相容性材料表面表征手段

張暢(國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專利局專利審查協(xié)作廣東中心，廣東 廣州 510000)

1 概述

高分子材料的血液相容性問(wèn)題主要是指材料與血液接觸后是否引發(fā)血小板聚集、凝血以及血栓形成和溶血等現(xiàn)象的問(wèn)題。通常從抗凝血性能和保持血液成分完整性兩方面對(duì)材料的血液相容性進(jìn)行評(píng)價(jià)。由于血栓的形成及凝血的發(fā)生對(duì)血液接觸性材料的使用效率和處理效果造成嚴(yán)重的影響，因此血液接觸材料必須具備良好的血液相容性。

血液相容性的評(píng)價(jià)、具有血液相容性材料的制備和研發(fā)以及材料與血液相互作用機(jī)制是血液與材料相互作用的三個(gè)基本問(wèn)題。血液相容性材料無(wú)論是新材料的制備還是新的測(cè)試方法的研發(fā)或新理論的應(yīng)用，基本上都是圍繞這三個(gè)問(wèn)題來(lái)展開。隨著高分子科學(xué)的發(fā)展，高分子材料由于其獨(dú)特的性能和低廉的價(jià)格被廣泛應(yīng)用于醫(yī)用高分子領(lǐng)域。目前，全世界每年消耗的醫(yī)用高分子材料約為180萬(wàn)噸，其中以聚氯乙烯(PVC)塑料應(yīng)用最多，超過(guò)50萬(wàn)噸。PVC添加增塑劑后變得柔軟、有光澤和彈性、透明而且價(jià)格低廉實(shí)用，因此應(yīng)用廣泛。醫(yī)療輸注器械所用PVC軟塑料中最常見(jiàn)的增塑劑是鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(di(2-ethylhexyl) phthalate, DEHP)，它在PVC塑料里添加的含量可達(dá)40%～60%。PVC中可能殘留的氯乙烯單體以及塑化劑都會(huì)對(duì)與其接觸的血液或藥物造成污染，因此尋找取代PVC的高分子材料勢(shì)在必行。

材料與血液相接觸時(shí)凝血產(chǎn)生的途徑主要有兩個(gè)：第一個(gè)是由血漿蛋白粘附引起的凝血；第二個(gè)是由凝血因子引起的凝血。

1995年，Matyjaszewski教授課題組報(bào)道了一種新型的活性聚合方法—原子轉(zhuǎn)移自由基聚合(atom transfer radical polymerization, ATRP)。

原子轉(zhuǎn)移自由基聚合機(jī)理如圖1所示。

圖1 原子轉(zhuǎn)移自由基聚合機(jī)理

在材料表面接枝的第一步就是要在其表面引入合適的引發(fā)基團(tuán)。梅里菲爾德樹脂[1]、聚(4-乙烯基芐氯)可以直接進(jìn)行SI-ATRP，此外，聚偏氟乙烯(PVDF)也可以直接用于很多單體的SI-ATRP的接枝[2-3]，但是合成材料中很少有自身存在可以用于ATRP引發(fā)的基團(tuán)。因此進(jìn)行表面引發(fā)ATRP之前要先在材料表面引入引發(fā)劑。Fristrup等[4]總結(jié)了在聚合物表面引入引發(fā)基團(tuán)的常用方法，如圖2所示。

圖2 有機(jī)/聚合物基底上ATRP引發(fā)基團(tuán)的制備

2 常用表征手段

2.1 X-射線表面光電子能譜(XPS)

電子能譜是通過(guò)X射線、紫外光和電子束等照射樣品表面。使樣品中原子或分子的電子受到激發(fā)釋放出來(lái)，根據(jù)釋放電子的能量分布，從中獲得所需的能量信息。

2.2 掃描電子顯微鏡(SEM)

SEM是利用樣品表面做光柵掃描的精確聚焦電子束轟擊樣品表面產(chǎn)生各種信號(hào)的二次電子、背散射電子、俄歇電子特征射線及不同能量的光子等，利用電磁透鏡系統(tǒng)成像，對(duì)固體材料表面進(jìn)行分析的儀器。SEM主要用于觀測(cè)微米及納米范圍內(nèi)的物質(zhì)形貌結(jié)構(gòu)，由于分辨率高，成像清晰視野大、可以從幾十倍到幾萬(wàn)倍連續(xù)放大觀察，因此廣泛地應(yīng)用于材料表面形貌研究，特別是材料與生物分子間作用的研究。

Yang[5]利用SEM對(duì)接枝了直鏈葡萄糖的聚丙烯微孔膜的形貌進(jìn)行觀測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著接枝率的變化微孔膜的表面形貌發(fā)生明顯的變化，孔徑逐漸變小，孔隙率逐漸變低。因此可以通過(guò)SEM觀測(cè)結(jié)果對(duì)材料接枝率進(jìn)行直觀地認(rèn)識(shí)。

Lin等[6]通過(guò)SEM對(duì)聚乙烯及磺酸基團(tuán)改性材料表面血小板形貌進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)隨著血小板與材料之間的粘附、激活程度不同血小板可以呈現(xiàn)出五種不同的形態(tài)，分別是圓盤形、部分偽足化、完全偽足化、部分鋪展和完全鋪展態(tài)。

2.3 原子力探針顯微鏡(AFM)

原子力顯微鏡(AFM)是利用一個(gè)微小探針檢測(cè)樣品表面和微型力敏感元件(原子力針)之間微弱的原子間相互作用力，研究材料表面結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的測(cè)試儀器。自20世紀(jì)80年代第一臺(tái)原子力顯微鏡出現(xiàn)至今，其檢測(cè)精度、靈敏性有了大幅度地提高，目前已經(jīng)廣泛應(yīng)用到生物材料界面相關(guān)領(lǐng)域。如Feng等[7]將MPC用表面引發(fā)ATRP和引發(fā)劑自組裝的方法接枝到硅片的表面，制備了接枝密度為0.06～0.39 chains/nm2和鏈長(zhǎng)為5～200個(gè)單體單元的接枝樣品。并用AFM觀測(cè)到接枝密度和接枝鏈長(zhǎng)不同對(duì)材料表面形態(tài)的影響，以及這種表面形態(tài)不同對(duì)其血液相容性的影響，其研究發(fā)現(xiàn)，在pH為7.4的TBS緩沖溶液中測(cè)定其纖維蛋白原的吸附量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著接枝密度和接枝鏈長(zhǎng)的增加，當(dāng)接枝密度≥0.29 chains/cm2和鏈長(zhǎng)≥100 units時(shí)蛋白質(zhì)吸附量可以降低到10 ng/cm2以下，而未經(jīng)改性的硅片的吸附量為570 ng/cm2。同時(shí)他們還發(fā)現(xiàn)纖維蛋白原的吸附對(duì)接枝密度的依賴性比接枝鏈長(zhǎng)大，接枝密度增大使材料接枝后表面形態(tài)由蘑菇狀變?yōu)樗⒆訝睢?/p>

2.4 表面等離子體共振儀(SPR)

表面等離子體共振儀是一種基于物理光學(xué)原理的新型生化分析系統(tǒng)，SPR 技術(shù)作為一種表面反應(yīng)的生物傳感技術(shù)，具有很重要的生化分析能力，可用于無(wú)標(biāo)記實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)許多種類生物分子之間的反應(yīng)。SPR 生化分析技術(shù)已成為直接實(shí)時(shí)觀測(cè)生物分子間相互作用的主導(dǎo)技術(shù)。

Cho等[8]將3-(甲基丙烯酰胺基)丙基-二甲基(3-磺酸)氫氧化銨(MPDSAH)用ATRP引發(fā)接枝到金的表面，用SPR測(cè)定了接枝后樣品和未接枝樣品蛋白質(zhì)(溶菌酶、纖維蛋白原、牛血清白蛋白和核糖核酸酶A)吸附情況的不同。綜合四種模型蛋白的SPR數(shù)據(jù)，他們發(fā)現(xiàn)接枝了P(MPDSAH)的表面對(duì)非特異性蛋白質(zhì)吸附的抑制可以與接枝了PEO表面相媲美，比接枝兩性離子—磷酰膽堿類的膜表面更能抗蛋白質(zhì)吸附。

2.5 雙偏極化振干涉儀(DPI)

利用DPI技術(shù)可以實(shí)時(shí)在線監(jiān)測(cè)蛋白質(zhì)在界面上吸附過(guò)程中的細(xì)節(jié)，并得到吸附在表面的蛋白質(zhì)密度、厚度和干質(zhì)量隨時(shí)間的變化信息，從而獲得更精準(zhǔn)的信息以揭示界面分子結(jié)構(gòu)、功能以及相互作用過(guò)程中分子構(gòu)象變化。DPI對(duì)于固/液界面上能夠引起界面層厚度、密度變化的相互作用和生物分子結(jié)構(gòu)功能的研究有著傳統(tǒng)結(jié)構(gòu)和表面分析技術(shù)無(wú)法比擬的動(dòng)態(tài)、精確測(cè)量能力。但DPI由于采用的是消逝波的原理，因此只能探測(cè)到樣品表面100 nm以內(nèi)的信息。所以DPI對(duì)測(cè)試的樣品要求較高，如：厚度、均勻性與芯片的結(jié)合力等都有要求，即DPI的測(cè)試樣品有一定的局限性。

3 結(jié)語(yǔ)

血液相容性材料制備完成后的表面性能的表征是其關(guān)鍵步驟，實(shí)時(shí)在線的檢測(cè)儀器及其相應(yīng)的表征方法在血液相容性的領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，通過(guò)以上表征手段可以有效評(píng)價(jià)改性材料與血液直接接觸后是否引發(fā)血小板聚集、凝血及血栓形成和溶血現(xiàn)象等問(wèn)題，推進(jìn)材料的凝血機(jī)制研究。